Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l'integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare l'integrazione di innesti ossei cranici in termini di rigenerazione ossea e neovascolarizzazione, utilizzando approcci di imaging multimodale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina rigenerativa, come l'accoppiamento tra osteogenesi e angiogenesi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una determinazione tridimensionale ad alta definizione dell'albero vascolare e consente lo studio dell'organo completo. A dimostrazione della procedura sarà Doron Vic, uno studente di dottorato del mio laboratorio, dopo l'eutanasia di un topo Bab sea di sette-otto settimane di età.

Secondo il protocollo descritto, utilizzare un tagliacapelli per rasare la regione calvarica contro il verso di crescita del pelo. Applicare isopropanolo al 70% sulla carcassa, in particolare sulla testa, per disinfettare. Successivamente, utilizzare un bisturi numero 11 per tagliare la cute del cuoio capelluto ed eliminare il periostio mediante un trapano dentale e una punta con diametro interno di 4,5 millimetri.

Stacca un frammento circolare di osso cranico. Trasferisci il frammento osseo in una piastra di plastica da 100 millimetri contenente soluzione salina sterile. A questo punto, osserva con pinzette curve il sangue e i tessuti molli aderenti al frammento osseo.

Tenere un frammento osseo alla volta e utilizzare un applicatore di cotone per tamponarlo accuratamente, rimuovendo qualsiasi tessuto cerebrale, tessuto molle e sangue. Utilizzare forbici fini per tagliare delicatamente eventuali schegge ossee ancora attaccate all'innesto, in modo che l'innesto assuma una forma perfettamente rotonda.

Immergere ogni innesto una volta in una provetta da 15 millilitri contenente etanolo al 70% e due volte in provette da 15 millilitri contenenti PBS per rimuovere l'etanolo. Congelare l'innesto allogenico in un congelatore a meno 80 gradi Celsius in provette criogeniche per almeno una settimana dopo il congelamento. Assicurarsi che l'innesto allogenico appaia trasparente lavorando con topi riceventi transgenici che esprimono la luciferasi sotto il controllo del promotore dell'osteocalcina.

Dopo aver anestetizzato un topo femmina di sette-otto settimane utilizzando anestetici iniettabili e aver verificato la sedazione, usare un tagliacapelli contro la direzione della crescita del pelo per rasare la regione calvarica. Applicare un depilatorio per rimuovere eventuali residui di pelo e utilizzare garza asciutta per rimuoverlo dopo non più di due minuti.

Quindi utilizzare una garza imbevuta di soluzione fisiologica per pulire l'area. Disinfettare il cuoio capelluto applicando clorhexidina al 5% per via sottocutanea. Iniettare cinque milligrammi per chilogrammo di carprofene diluito in 200 microlitri di soluzione fisiologica.

Applicare un unguento oculare per prevenire l'essiccazione e mantenere l'animale su un tappetino termico in ogni momento. Successivamente, posizionare l'animale sotto il microscopio operatorio. Poi, utilizzando forbici fini e pinzette, praticare un'incisione ovale lunga un centimetro nel cuoio capelluto con l'aiuto delle pinzette.

Tenere il periostio e utilizzare forbici fini per asportarlo con un trapano dentale e un trapano di precisione con diametro esterno di cinque millimetri; creare il difetto calvarico due millimetri anteriormente alla sutura lambdoidea per evitare la penetrazione della dura madre. Trapanare fino ai tre quarti dello spessore osseo e utilizzare una spatola per staccare il frammento osseo. Un passaggio critico del protocollo è la definizione precisa della localizzazione del difetto.

Una lesione della sutura lambdoidea provocherà un'emorragia massiva. Pertanto, è necessario fare attenzione a non danneggiare il durometro sottostante e il seno sagittale superiore. Per impiantare un autoinnesto.

Utilizzare 10 millilitri di soluzione salina sterile in una piastra di plastica da 10 millimetri per lavare il frammento osseo. Rimuovere i coaguli di sangue senza asportare i tessuti molli, quindi impiantare un innesto omologo scongelato in anticipo e portare il campione alla temperatura ambiente. Successivamente, lavare il frammento osseo con pinzette curve.

Posizionare l'innesto osseo nel difetto in modo che non tocchi i margini del difetto. Quindi, utilizzando gel di fibrina, incollare l'innesto all'osso ospite. Suturare la cute con punto Vicryl quattro-oh e applicare iodopovidone sulla ferita chirurgica.

Contrassegnare l'orecchio del topo e iniettare 0,25 milligrammi per chilogrammo di anti sedan. Per invertire l'effetto anestetico del meato. Eseguire le cure postoperatorie secondo il protocollo indicato nel testo.

Preparare una soluzione salina eparinizzata pesando 2000 unità di eparina sodica e trasferendole in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di soluzione salina sterile al tubo e agitare. Riempire accuratamente una siringa da 20 millilitri con blocco a baionetta con 15 millilitri di soluzione salina eparinizzata riscaldata e collegare la siringa a un set per vene scalpo da 23 gauge.

Fissare la siringa a una pompa per siringhe e impostare la pompa su 10 millilitri a un millilitro al minuto. Dopo aver anestetizzato un topo secondo il protocollo descritto nel testo, verificare la sedazione con una pinzatura del dito del piede e posizionare il topo supino su una tavola di fissaggio rivestita con un foglio assorbente.

Successivamente, incidi la pelle dall'addome fino al collo. Incidi la parete addominale fino al processo xifoideo. Quindi, incidi la gabbia toracica lungo il suo aspetto laterale, assicurandoti che il cuore sia completamente esposto e che cuore e polmoni non siano danneggiati.

Utilizzare un emostatico per retrarre lo sterno. Inserire l'ago a farfalla a tre millimetri nel ventricolo sinistro. Quindi, con una colla a presa rapida di tre secondi, fissare l'ago al cuore e alla parete toracica. L'inserimento dell'ago a farfalla nel ventricolo sinistro è una procedura delicata.

Cercare di evitare l'inserzione nel ventricolo destro o troppo in profondità nel ventricolo sinistro, poiché ciò comporterebbe la penetrazione della parete cardiaca posteriore. Successivamente, attivare immediatamente la pompa. Dopo un minuto, dissezionare la vena cava inferiore al fine di deprimere la vascolatura.

Inclinare la tavola in modo che i fluidi defluiscano dalla testa. Una perfusione riuscita determinerà una decolorazione del fegato e dei vasi sanguigni. Ora perfondere 10 millilitri di formaldeide al 4%.

Evitare la penetrazione di bolle d'aria nella vascolarizzazione. Quando la perfusione è completa, come indicato dall'irrigidimento della coda, utilizzare 10 millilitri di soluzione salina eparinizzata per rimuovere il formaldeide. Preparare l'agente di contrasto radio-opaco seguendo le istruzioni del produttore.

Mescolando il diluente del composto e l'agente indurente in un tubo di plastica, perfondere l'animale con l'agente di contrasto a una velocità di un millilitro al minuto. Le arterie coronariche, intestinali ed epatiche devono diventare gialle al termine della perfusione. Tagliare il tubo rispetto all'ago a farfalla e avvolgere la carcassa in carta per prevenire la fuoriuscita della soluzione nella regione calvarica.

Posizionare l'animale a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire la polimerizzazione il giorno successivo. Per dissezionare la regione calvarica, utilizzare un bisturi per tagliare la cute il più lateralmente possibile, evitando di danneggiare la regione cranica di interesse. Individuare il trapianto osseo e quindi utilizzare forbici fini per tagliare l'osso cranico a 10 millimetri di distanza dal trapianto.

Utilizzando uno scanner micro-TC. Impostare il campo visivo a 20,5 millimetri, l'energia a raggi X a 55 kVp, l'intensità a 145 microampere, mille proiezioni per 360 gradi e un tempo di integrazione di 200 millisecondi. Scansionare il campione osseo calvarico isolato.

Osservare le sezioni ricostruite in 2D generate dal software di micro-CT. Assicurarsi di scansionare correttamente la regione di interesse e quindi localizzare il difetto calvarico. Se i vasi perfusi sono facilmente identificabili, utilizzare acido tricloroacetico al 6% diluito in acqua doppio-distillata.

Per decalcificare il campione, rieseguire la scansione del campione utilizzando gli stessi parametri appena descritti. Individuare la sutura lambdoidea nelle fette 2D ricostruite. Definire un volume di interesse cilindrico, o VOI, alto due millimetri e con un diametro di otto millimetri, tangente alla sutura.

Questa è la sede anatomica del difetto. Successivamente, segmentare l'osso dal tessuto molle. Impostare la soglia inferiore a 130 e applicare un filtro gaussiano 3D vincolato per sopprimere parzialmente il rumore nei volumi.

Generare una ricostruzione 3D. Assicurarsi che il VOI sia posizionato correttamente utilizzando il software IPL e l'oggetto DT. La funzione Peram genera una mappa di spessore.

Questa funzione descrive il volume del vaso per ciascun diametro del vaso mediante imaging e tomografia computerizzata microscopica. Secondo il protocollo descritto nel testo, come mostrato qui, sette giorni dopo l'intervento chirurgico, la scansione TC ha dimostrato un volume significativamente maggiore di vasi sanguigni di diametro piccolo e medio che irroravano l'intera area del trapianto nei topi che avevano ricevuto autotrapianti, rispetto ai topi che avevano ricevuto allotrapianti, nei quali i vasi sembravano penetrare dall'esterno. Inoltre, l'imaging a fluorescenza ha mostrato una perfusione sanguigna significativamente maggiore negli animali trattati con autotrapianto.

Al giorno 14, l'albero vascolare nell'innesto allogenico raggiunge tutta la periferia dell'innesto. Tuttavia, il volume dei vasi era significativamente inferiore rispetto al gruppo Autologo. Questa differenza era particolarmente evidente quando si confrontavano i vasi con diametro compreso tra 0,08 e 0,1 millimetri, come mostrato qui a 28 giorni dall'intervento chirurgico; il volume della vascolarizzazione è tornato al valore basale sette giorni dopo l'intervento chirurgico.

Il gruppo con autoinnesto ha mostrato una mineralizzazione ossea significativamente maggiore, come evidenziato dall'imaging a fluorescenza mediante una sonda diretta verso l'idrossiapatite. Nel suddetto gruppo si è formato tessuto osseo in tutta la zona adiacente all'innesto, mentre nel gruppo con alloinnesto la formazione ossea si è verificata soltanto ai margini della lesione, come indicato da una forma ad anello. A 56 giorni dall'intervento chirurgico, il volume osseo era significativamente più elevato e lo spessore dell'innesto risultava significativamente maggiore negli animali che avevano ricevuto autoinnesti rispetto a quelli che avevano ricevuto alloinnesti. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica chirurgica può essere eseguita in circa 25 minuti. Successivamente a questa procedura, è possibile effettuare imaging a fluorescenza utilizzando altre sonde al fine di rispondere a ulteriori quesiti, ad esempio riguardo l'attività degli osteoclasti e il coinvolgimento della risposta immunitaria.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare l'imaging della rigenerazione ossea nell'angiogenesi sottostante.