Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l'integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di monitorare l'integrazione degli innesti ossei cranici in termini di rigenerazione ossea e neovascolarizzazione utilizzando approcci di imaging multimodale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come l'accoppiamento osteogenesi-angiogenesi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una determinazione 3D ad alta definizione dei tre vasi e consente lo studio dell'organo completo dimostrando che la procedura sarà Doron Vic, uno studente di dottorato nel mio laboratorio Dopo l'eutanasia di sette o otto settimane di topo marino di Bab.

Secondo il protocollo di testo, utilizzare un tagliacapelli per radere la regione calvario contro la direzione di crescita dei peli. Applicare il 70% di isopropanolo sulla carcassa, testa per disinfettare. Quindi utilizzare un bisturi numero 11 per tagliare la pelle del cuoio capelluto e rimuovere il periostio utilizzando un trapano dentale e un dente di diametro interno di 4,5 millimetri.

Staccare un frammento circolare di osso calvariare. Trasferire il frammento osseo in una capsula di plastica da 100 millimetri contenente soluzione fisiologica sterile. A questo punto, osservare il sangue e i tessuti molli attaccati al frammento osseo con una pinzetta ricurva.

Tenere un frammento osseo alla volta e utilizzare un applicatore con punta di cotone per tamponarlo accuratamente. Rimozione di qualsiasi tessuto cerebrale, tessuto molle e sangue. Usa le forbici sottili per tagliare delicatamente eventuali frammenti di osso che rimangono attaccati all'innesto in modo che l'innesto abbia una forma arrotondata perfetta.

Immergere ogni innesto una volta in una provetta da 15 millilitri contenente il 70% di etanolo e due volte in provette da 15 millilitri contenenti PBS per lavare via l'etanolo. Congelare l'allotrapianto in un congelatore a meno 80 gradi Celsius in provette criogeniche per almeno una settimana dopo il congelamento. Assicurarsi che l'allotrapianto appaia trasparente lavorando con topi transgenici riceventi che esprimono luciferasi sotto il controllo del promotore dell'osteocalcina.

Dopo aver anestetizzato una topolina di sette-otto settimane utilizzando anestetici iniettabili e verificando la sedazione. Utilizzare un tagliacapelli contro la direzione di crescita dei peli per radere la regione calvariare. Applicare un depilatorio per rimuovere eventuali resti di pelo e utilizzare una garza asciutta per pulirlo dopo non più di due minuti.

Quindi utilizzare una garza imbevuta di soluzione salina per pulire l'area. Disinfettare il cuoio capelluto applicando il 5% di clorexidina per via sottocutanea. Iniettare cinque milligrammi per chilogrammo di carprofene diluito in 200 microlitri di soluzione fisiologica.

Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza e mantenere l'animale sempre su un cuscinetto termico. Quindi posizionare l'animale sotto il binocolo operativo. Successivamente, usando forbici e pinzette sottili, fai un taglio ovale lungo un centimetro nella pelle del cuoio capelluto con una pinzetta.

Tenere il periostio e utilizzare le forbici sottili per tagliarlo via con un trapano dentale e un diametro esterno di cinque millimetri tr rifinire il trapano il difetto calvario due millimetri anteriormente alla sutura lambdoidea per evitare la penetrazione della dura madre. Perforare per tre quarti l'osso e utilizzare una spatola per staccare il frammento osseo. Un passaggio critico del protocollo è la terminazione della posizione del difetto.

La lesione alla sutura labo porterà a un'emorragia massiccia. Pertanto, è necessario prestare attenzione a non interrompere il durometro sottostante e il sagittale superiore. Per impiantare un autoinnesto.

Utilizzare 10 millilitri di soluzione fisiologica sterile in una piastra di plastica da 10 millimetri per lavare il frammento osseo. Rimuovere i coaguli di sangue senza rimuovere i tessuti molli per impiantare un allotrapianto, scongelare in anticipo e normalizzare il campione a temperatura ambiente. Quindi lavare il frammento osseo con una pinzetta curva.

Posizionare l'innesto osseo nel difetto in modo che non tocchi i margini del difetto. Quindi, usando il gel di fibrina, incolla l'innesto all'osso ospite. Sutura la pelle con quattro suture Vicryl e applicazione di iodio povidone sul taglio chirurgico.

Segna l'orecchio del topo e inietta 0,25 milligrammi per chilogrammo anti berlina. Per invertire l'effetto anestetico del meato. Eseguire l'assistenza postoperatoria secondo il protocollo di testo.

Preparare soluzione salina eparinizzata pesando 2000 unità di eparina sodica e trasferendole in una provetta da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di soluzione fisiologica sterile al tubo e agitare. Riempire bene una siringa di blocco dell'esca da 20 millilitri con 15 millilitri di soluzione salina eparinizzata riscaldata e collegare la siringa a un set di vene del cuoio capelluto calibro 23.

Fissare la siringa a una pompa a siringa e impostare la pompa a 10 millilitri a un millilitro al minuto. Dopo aver anestetizzato un topo secondo il protocollo di testo, confermare la sedazione con un pizzico di dita dei piedi e fissare il mouse. Dà il retro a una tavola di fissaggio avvolta con un rivestimento superficiale assorbente.

Quindi, taglia la pelle dall'addome al collo. Tagliare la parete addominale fino al processo xifoideo. Quindi taglia la gabbia toracica lungo la sua parte laterale, assicurandoti che il cuore sia completamente esposto e che il cuore e i polmoni non siano danneggiati.

Usa un emostatico per ritrarre lo sterno. Inserire l'ago a farfalla di tre millimetri nel ventricolo sinistro. Quindi, con una colla di tre secondi, incollare l'ago al cuore e alla parete toracica L'inserimento dell'ago a farfalla nel ventricolo sinistro è una procedura delicata.

Cerca di evitare l'inserimento nel ventricolo destro o troppo in profondità nel ventricolo sinistro perché penetrerà nella parete posteriore del cuore. Quindi, attivare immediatamente la pompa. Dopo un minuto, sezionare la vena cva inferiore per depressurizzare il sistema vascolare.

Inclinare la tavola in modo che i liquidi fluiscano lontano dalla testa. Una perfusione riuscita si tradurrà in una pulizia del fegato e dei vasi sanguigni. Ora perfusi 10 millilitri di formaldeide al 4%.

Evitare la penetrazione di bolle d'aria nel sistema vascolare. Quando la perfusione è completa, come indicato da un irrigidimento della coda, utilizzare 10 millilitri di soluzione salina eparinizzata per eliminare la formaldeide. Preparare il mezzo di contrasto radiopaco secondo le istruzioni del produttore.

Mescolando il diluente composto e l'agente indurente in un tubo di plastica, perfondere l'animale con l'agente di contrasto a una velocità di un millilitro al minuto. Le arterie coronarie intestinali ed epatiche dovrebbero ingiallire quando la perfusione è completa. Tagliare il tubo fino all'ago a farfalla e avvolgere la carcassa in carta per evitare la fuoriuscita della soluzione nella regione calvariare.

Posizionare l'animale a quattro gradi Celsius durante la notte per consentire la polimerizzazione il giorno successivo. Per sezionare la regione calvariare, utilizzare un bisturi per tagliare la pelle il più lateralmente possibile, evitando di danneggiare la regione cranica di interesse. Individuare l'innesto osseo e quindi utilizzare le forbici sottili per tagliare l'osso cranico a 10 millimetri di distanza dall'innesto.

Utilizzando uno scanner micro CT. Imposta il campo visivo a 20,5 millimetri, l'energia dei raggi X a 55 KVP, l'intensità a 145 microampere, mille proiezioni per 360 gradi e un tempo di integrazione di 200 millisecondi. Scansione del campione di osso calvario isolato.

Osserva le fette ricostruite in 2D che sono state generate dal software micro CT. Assicurati di scansionare correttamente la regione di interesse e quindi individua il difetto calvariare. Se i recipienti perfusi sono facilmente identificabili, utilizzare acido tricloroacetico al 6% diluito in acqua bidistillata.

Per decalcificare il campione, eseguire nuovamente la scansione del campione utilizzando gli stessi parametri appena descritti. Individuare la sutura lambdoide nelle fette 2D ricostruite. Definire un volume cilindrico di interesse o VOI di due millimetri di altezza e con un diametro di otto millimetri che sia tangente alla sutura.

Questa è la sede anatomica del difetto. Accanto a segmentare l'osso dai tessuti molli. Impostate la soglia inferiore su 130 e applicate un filtro gaussiano 3D vincolato per sopprimere parzialmente il rumore nei volumi.

Genera una ricostruzione 3D. Assicurarsi che il VOI sia posizionato correttamente utilizzando il software IPL e l'oggetto DT. La funzione Peram genera una mappa di spessore.

Questa funzione descrive il volume del vaso per ogni diametro del vaso, esegue l'imaging e la micro tomografia computerizzata. Secondo il protocollo di testo, come mostrato qui, sette giorni dopo l'intervento chirurgico, la scansione TC ha dimostrato un volume significativamente più elevato di vasi sanguigni di piccolo e medio diametro che nutrivano l'intera area dell'innesto nei topi che avevano ricevuto autografi rispetto ai topi che avevano ricevuto allotrapianti in cui i vasi sembravano penetrare dall'esterno. Inoltre, l'imaging a fluorescenza ha mostrato una perfusione sanguigna significativamente più elevata negli animali trattati con autografi.

Entro il giorno 14, l'albero vascolare nell'allotrapianto raggiunge tutte le vicinanze degli innesti. Tuttavia, il volume delle imbarcazioni era significativamente inferiore rispetto al gruppo Autographt. Questa differenza è stata più evidente quando sono stati confrontati vasi con diametri da 0,08 a 0,1 millimetri, come si vede qui 28 giorni dopo l'intervento chirurgico, il volume vascolare è tornato al basale sette giorni dopo l'intervento chirurgico.

Il gruppo autotrapianto ha dimostrato una mineralizzazione ossea significativamente maggiore, come si vede dall'imaging a fluorescenza utilizzando una sonda diretta all'idrossiapatite. L'osso si è formato in tutta la prossimità dell'innesto in questo gruppo mentre si è formato solo ai margini del difetto nel gruppo alloinnesto, come contrassegnato da una forma ad anello 56 giorni dopo l'intervento chirurgico, il volume osseo era significativamente più alto e lo spessore dell'innesto era significativamente maggiore negli animali che hanno ricevuto autografi rispetto agli allotrapianti Una volta padroneggiata, questa tecnica chirurgica può essere eseguita in circa 25 minuti. Dopo questa procedura, è possibile eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando altri prob per rispondere a ulteriori domande, ad esempio le attività degli osteoclasti e il coinvolgimento della risposta immunitaria.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare la rigenerazione ossea nell'angiogenesi sottostante.