Modellazione dei tumori ossei primari e delle metastasi ossee con impianto di innesto tumorale solido nell'osso

Questo studio consente flessibilità nella creazione di tumori ossei primari o metastasi ossee inserendo innesti tumorali solidi nell'osso. Questa tecnica è un allontanamento dall'iniezione di sospensioni di cellule tumorali nell'osso. Questo metodo supera la limitazione delle iniezioni di sospensione delle cellule tumorali emboli polmonari.

Un altro vantaggio è la creazione di un modello più uniforme rispetto alle metastasi ossee spontanee o dopo l'iniezione intravascolare di cellule. Sulla base dell'impianto di innesti tumorali solidi, esistono possibilità che vanno oltre i modelli umani o murini, ma l'uso di xenotrapianti derivati da pazienti che possono portare a terapie su misura per pazienti specifici. L'obiettivo principale è l'uso nella ricerca sul cancro come il microambiente tumorale, le metastasi, la scoperta di farmaci, la genetica del cancro e la medicina di precisione.

La dimostrazione visiva è la chiave per mostrare le fasi chiave della creazione del tumore sottocutaneo, della dissezione e della creazione dell'innesto tumorale e dell'impianto chirurgico nella tibia. Per l'induzione sottocutanea del tumore, prelevare la linea cellulare di interesse utilizzando un'appropriata soluzione di dissociazione cellulare e risospendere le cellule a una o due volte 10 alla quinta cellula a una concentrazione sterile di PBS da 100 a 150 microlitri. Metti le celle sul ghiaccio.

Pulire la pelle esposta con etanolo al 70% e caricare le cellule in una siringa di tubercolina dotata di un ago calibro 27. Quindi iniettare la cellula per via sottocutanea in una regione di pelle disinfettata che non sarà influenzata dal movimento delle scapole. Utilizzare un calibro per monitorare le dimensioni del tumore sottocutaneo sovrastante il torace dorsale o l'addome e misurare il peso corporeo dell'animale settimanalmente per assicurarsi che il tumore non ulceri o che il topo non soddisfi i criteri di rimozione precoce stabiliti dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

Quando il tumore raggiunge i 15 millimetri in qualsiasi dimensione, utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare la pelle e utilizzare un bisturi da 15 per incidere la pelle sovrastante il tumore. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per sezionare bruscamente il tumore dai tessuti molli attaccati circostanti e posizionare il tumore in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente un terreno di crescita completo. Usa il bisturi per tritare il tumore in frammenti di dimensioni adeguate e posiziona i frammenti in un nuovo contenitore di terreno di coltura completo sterile a temperatura ambiente.

Per la crioconservazione, raggruppare più frammenti in un singolo crioviale in un terreno di crescita completo integrato con il 20% di siero fetale bovino e il 10% di dimetilsolfossido e utilizzare un sistema di crioconservazione commerciale a meno 80 gradi Celsius per congelare gradualmente il tessuto prima della conservazione a lungo termine in azoto liquido. Per conservare i frammenti tumorali per le analisi successive ma non per il futuro impianto, congelare i campioni mediante immersione in azoto liquido e conservare i frammenti tumorali congelati a lungo termine a meno 80 gradi Celsius. Per l'impianto di frammenti tumorali sottocutanei, portare prima la sospensione dei frammenti tumorali a temperatura ambiente.

Successivamente, confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo ricevente anestetizzato e somministrare analgesia per via sottocutanea. Per ridurre al minimo il potenziale trauma alla pelle, utilizzare una crema depilante per rimuovere i peli sull'articolazione del ginocchio destro e sulla tibia prossimale dell'arto posteriore collegato. Strofinare la pelle esposta con etanolo al 70%, quindi alternare scrub alla clorexidina e soluzione salina.

Mentre si flette ed si estende l'articolazione, visualizzare la tibia prossimale come la regione appena distale all'articolazione del ginocchio e utilizzare una lama di bisturi da 15 per creare un'incisione da tre a quattro millimetri a livello della tibia prossimale sulla parte mediale dell'arto attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo per esporre la corteccia mediale della tibia prossimale. Per creare un piccolo foro nella corteccia mediale della tibia prossimale, utilizzare la punta di un ago calibro 25 per applicare una leggera pressione mentre si ruota la punta di circa due millimetri distalmente all'articolazione del ginocchio ed equidistante tra le cortecce tibiale cranica e caudale. Quando il foro è stato creato, utilizzare una pinza sterile o un ago da 27 a 30 gauge per inserire un minimo di 0,5 frammenti di tumore millimetrici cubi nella cavità midollare della tibia prossimale e utilizzare un ago da 27 a 30 gauge per manipolare i frammenti tumorali nel canale midollare.

Dopo aver posizionato tutti i frammenti, contrapporre i bordi cutanei con il materiale appropriato e rimettere l'animale nella sua gabbia con monitoraggio fino a quando non viene ambulatoriale. Quindi valutare la crescita del tumore tibiale in modo non invasivo mediante radiografia digitale settimanale, bioluminescenza o imaging a fluorescenza e utilizzare calibri per misurare l'arto nel sito di impianto. L'attecchimento riuscito può essere documentato con l'imaging avanzato.

In questa analisi rappresentativa, il difetto corticale creato per l'impianto dell'innesto tumorale era visibile nella tibia prossimale una settimana dopo l'impianto. Entro la seconda settimana, si potevano osservare osteolisi visibili e rimodellamento osseo adiacenti al difetto corticale. Dalla seconda alla quinta settimana, si è verificata un'ulteriore progressiva distruzione ossea e la formazione di nuovo osso associato all'attecchimento e alla crescita del tumore.

Prestare attenzione durante la creazione di un piccolo foro nella tibia prossimale. Affidati alla rotazione della punta con una pressione delicata o minima, consentendo alla punta dell'ago di fare il lavoro. A seguito di questa procedura, oltre all'imaging, è possibile eseguire il posizionamento dell'innesto tumorale in altri siti ossei, il posizionamento di organoidi o cellule tumorali nella matrice extracellulare nel difetto osseo o l'analisi molecolare e istologica.