Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

L'obiettivo generale di questo metodo è identificare, caratterizzare e isolare le cellule da un steroidi multicellulari in base allo stato del ciclo cellulare e alla posizione all'interno dello steroidi, rispetto alla coltura cellulare in 2D. Il modello 3D OID riproduce la biologia del cancro in vivo, poiché imita l'architettura tumorale e il suo microambiente, abbinando gli sfereoidi alla citometria a flusso e alle tecniche di imaging. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro, come ad esempio in che modo il microambiente tumorale modifica la sensibilità ai farmaci, la motilità cellulare e la proliferazione.

Il principale vantaggio di questo metodo è che permette la visualizzazione in tempo reale del ciclo cellulare e consente la purificazione di cellule vive da una specifica regione dello stereoido. La procedura sarà eseguita da A Sharp, un assistente di ricerca del nostro laboratorio. Iniziare la preparazione della formazione stereoidica 3D riscaldando al microonde l'aros allo 1,5% in 100 millilitri di soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS per tre-cinque minuti, agitando occasionalmente il flacone per assicurare che l'aros si sciolga completamente. Successivamente, pipettare immediatamente 100 microlitri della soluzione di aros in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti con fondo piatto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora per permettere all'aros di solidificare.

Successivamente, prelevare una coltura cellulare di cellule di melanoma in espressione dei costrutti FCI con una confluenza dell'80% dall'incubatore per colture cellulari. Lavare le cellule con 10 millilitri di HBSS. Aggiungere 1,5 millilitri di 0,05% in EDTA e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa due minuti.

Una volta che le cellule si sono staccate, sospenderle in 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare. Contare manualmente le cellule utilizzando un emo, citometro e un microscopio invertito e diluirle a 25.000 cellule per millilitro in mezzo di coltura cellulare. Quindi pipettare 200 microlitri della sospensione cellulare per ricoprire ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti aros.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per circa tre giorni per formare gli sferoidi cellulari. Dopo l'incubazione, acquisire le immagini degli sferoidi mediante un microscopio invertito utilizzando un obiettivo Forex e un filtro a contrasto di fase. Gli sferoidi dovrebbero apparire come aggregati cellulari compatti e approssimativamente sferici, pronti per la preparazione dello steroide cellulare per la sezione e l'acquisizione di immagini.

Utilizzare una pipetta da un millilitro per trasferirli in un tubo falcon. Successivamente, lasciare sedimentare lo steroide sul fondo del conico. Poi, rimuovere il mezzo per aspirazione e fissare gli sferoidi incubandoli in formalina tamponata neutra al 10% per almeno due ore a temperatura ambiente.

SP può quindi essere conservato in HBSS a quattro gradi Celsius per diversi giorni dopo il taglio e l'acquisizione dell'immagine della cellula. Aprire il software di analisi delle immagini e selezionare la configurazione solo quantificazione. Creare quindi una nuova libreria e importare il file dell'immagine confocale dello sferoide trascinando il file dei dati grezzi nella libreria.

Successivamente, passare alla scheda delle misurazioni per creare un protocollo di analisi dell'immagine trascinando e rilasciando i comandi nell'ordine corretto nella finestra del protocollo. Per individuare oggetti nel canale verde, trascinare e rilasciare il comando "trova oggetti" dalla sezione di ricerca nella finestra del protocollo e selezionare il canale appropriato. Aggiungere un comando di apertura presente nella sezione di elaborazione, quindi aggiungere un comando separato per oggetti contigui al fine di separare le cellule.

Infine, dalla sezione di filtraggio, aggiungere ed escludere oggetti in base alle dimensioni. Impostare il comando per escludere oggetti di dimensioni inferiori a 50 micrometri al fine di rimuovere oggetti non cellulari di piccole dimensioni. Successivamente, trascinare e rilasciare un nuovo comando "trova oggetti" nella finestra del protocollo.

Seguendo gli stessi passaggi, selezionare il canale rosso e applicare tutti i comandi successivi. Una volta individuati gli oggetti, utilizzare i comandi nascondi canale o mostra canale per verificare visivamente che gli oggetti rossi e verdi corrispondano ai nuclei rossi e verdi. Se necessario, fare clic su misurazioni quindi su opzioni di feedback per modificare l'aspetto delle maschere degli oggetti.

Ora, per trovare gli oggetti gialli corrispondenti alle cellule in fase S precoce, utilizzare il comando interseca presente nella sezione di combinazione e scegliere di intersecare gli oggetti rossi con gli oggetti verdi. Ancora una volta, escludere gli oggetti in base a una dimensione inferiore a 50 micrometri. Per identificare le cellule in fase G1, utilizzare il comando sottrai presente nella sezione di combinazione e scegliere di sottrarre gli oggetti gialli dagli oggetti rossi per individuare esclusivamente gli oggetti rossi.

In modo analogo, sottrarre gli oggetti gialli dagli oggetti verdi al fine di identificare esclusivamente gli oggetti verdi che corrispondono alle cellule in fase SG2 e MPH, sia per gli oggetti esclusivamente rossi che per quelli esclusivamente verdi. Rimuovere gli oggetti non cellulari secondo necessità applicando un comando di filtraggio della popolazione presente nella sezione di filtraggio, utilizzando un fattore di forma maggiore di 0,25. Successivamente, individuare il contorno dello sferoide S.

Utilizzare un comando "trova oggetti" dalla sezione di ricerca nel canale verde o rosso. Utilizzare un comando "chiudi" dalla sezione di elaborazione per unire le singole cellule in un unico oggetto. Quindi aggiungere un comando "riempi i buchi negli oggetti" per riempire i vuoti nella sfera.

Successivamente, utilizzare un filtro fine per rimuovere il rumore dall'oggetto Sphero. Completare l'individuazione del contorno dello sferoide scegliendo di escludere gli oggetti in base alle dimensioni, per rimuovere gli oggetti più piccoli di 30.000 micrometri. Una volta definiti tutti gli oggetti, aggiungere la misurazione delle distanze dalla sezione corrispondente per determinare la distanza tra ciascun OID e il bordo del contorno dello sferoide S.

Eseguire questa operazione in ciascuna delle popolazioni gialla, esclusivamente rossa ed esclusivamente verde. Per visualizzare le distanze minime tra la cellula e il bordo più vicino dello sferoide S, aprire la scheda delle misurazioni e selezionare le opzioni di feedback seguite da relazioni. Quindi scegliere mostra distanze.

Infine, salvare il protocollo per conservare i dati generati dal protocollo. Scegliere l'elemento "make measurement" dalla sezione di misurazione. Quindi, per interpretare i dati, selezionare l'elemento di misurazione, andare nella scheda "analysis" nella sezione di misurazione e scegliere "Analyze" dal menu di analisi per contare le cellule individuate a una certa distanza dal margine dello steroide.

Creare un filtro selezionando "filtro" dalla scheda analisi. Ad esempio, mostrare solo i dati in cui la distanza dal bordo della sfera è inferiore a 100 micron. Per esportare i dati grezzi, selezionare "esporta" dalla scheda file e quindi salvare i dati come testo separato da virgole o da tabulazioni.

Questi dati possono essere aperti in un programma di foglio elettronico per ulteriori analisi. Le sferoidi cellulari generate da C 8 1 16 1. Cellule di melanoma umano precedentemente trasdotte con il sistema Fuji sono state fissate e sezionate.

È stata eseguita l'immagine confocale per AZA verde, che marca le cellule nella fase M del SG due del ciclo cellulare, e Berra arancione, che marca le cellule nella fase G uno. Quando queste immagini vengono sovrapposte, caratteristiche chiave come un nucleo necrotico possono essere osservate come previsto. Le cellule rosse arrestate in fase G uno predominano più vicino a questo nucleo necrotico, mentre le cellule proliferanti rosse e verdi aumentano in modo gradiente verso il margine esterno dove l'accesso a ossigeno e nutrienti è maggiore.

Dopo l'analisi semiautomatica delle immagini, possono essere definite le maschere delle cellule fucci e il contorno dello sferoide S. Un software di imaging è stato utilizzato per quantificare le cellule rosse e verdi nella regione interna o esterna dello sferoide S. Questa analisi ha mostrato che le cellule arrestate nella fase G1 sono arricchite nella regione interna, mentre le cellule in proliferazione predominano più vicino al margine dello sferoide.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita nell'arco di una o due settimane, un periodo che comprende la coltivazione del fetoide, l'acquisizione delle immagini e l'analisi. Dopo aver seguito questa procedura, i fetoide possono essere impiantati in una matrice di collagene e quindi osservati mediante microscopia a scatto temporale (TimeLapse). Successivamente, possono essere sottoposti ad analisi proteica o di RNA, consentendo di rispondere a domande come se la posizione all'interno del fetoide e l'accesso a ossigeno e nutrienti possano alterare i fenotipi delle cellule tumorali.