Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

L'obiettivo generale di questo metodo è identificare, caratterizzare e isolare le cellule da uno steroide multicellulare rispetto al loro stato del ciclo cellulare e alla posizione all'interno dello steroide rispetto alla coltura cellulare 2D. Il modello 3D OID ricapitola la biologia del cancro in vivo in quanto imita l'architettura tumorale e il suo microambiente accoppiando gli sferoi con la citometria a flusso e le tecniche di imaging. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come ad esempio il modo in cui il microambiente tumorale altera la sensibilità ai farmaci, la motilità cellulare e la proliferazione.

Il vantaggio principale di questo metodo è che consente la visualizzazione in tempo reale del ciclo cellulare e consente la purificazione di cellule vive da una specifica regione steroidea, dimostrando che la procedura verrà eseguita A sharp, un assistente di ricerca del nostro laboratorio Iniziare a prepararsi per la formazione di steroidi 3D cuocendo al microonde l'1,5% di aros in 100 millilitri di soluzione salina di Hank o HBSS o da tre a cinque minuti agitare a intermittenza il pallone per garantire che l'AROS sia completamente disciolto. Quindi pipettare immediatamente 100 microlitri della soluzione aros in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti a fondo piatto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora per consentire agli aros di solidificarsi.

Successivamente, rimuovere una coltura cellulare con confluenza all'80% di cellule di melanoma che esprimono i costrutti FCI dall'incubatore di coltura cellulare. Lavare le celle con 10 millilitri di HBSS. Aggiungere 1,5 millilitri di 0,05% in EDTA e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per circa due minuti.

Una volta che le cellule si sono staccate, sospenderle in 10 millilitri di coltura cellulare. Medio. Contare manualmente le cellule utilizzando un emometro, un citometro e un microscopio invertito e diluirle a 25.000 cellule per millilitro in terreno di coltura cellulare. Quindi pipettare 200 microlitri di sospensione cellulare per sovrapporre ciascun pozzetto della piastra aros da 96 pozzetti.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per circa tre giorni per formare sferoidi cellulari. Dopo l'incubazione, immagine degli sferoidi su un microscopio invertito utilizzando un obiettivo Forex e un filtro a contrasto di fase. Gli sferoidi dovrebbero apparire come aggregati cellulari compatti e approssimativamente sferici per preparare lo steroide cellulare per il sezionamento e l'imaging.

Usa una pipetta da un millilitro per spostarli in una provetta di falco. Quindi lasciare che lo steroide si depositi sul fondo del conico. Successivamente, rimuovere la bi aspirazione media e quindi fissare gli sferoidi incubandoli in formina tamponata neutra al 10% per almeno due ore a temperatura ambiente.

L'SP può quindi essere conservato in HBSS a quattro gradi Celsius per diversi giorni dopo il sezionamento e l'imaging della cellula. Apri il software di analisi delle immagini e scegli la configurazione di sola quantificazione. Quindi crea una nuova libreria e importa il file immagine confocale sferoidale trascinando il file di dati grezzi nella libreria.

Successivamente, vai alla scheda delle misurazioni per creare un protocollo di analisi delle immagini trascinando e rilasciando i comandi nell'ordine corretto nella finestra del protocollo. Per trovare oggetti nel canale verde, trascinare e rilasciare il comando Trova oggetti dalla sezione di ricerca nella finestra del protocollo e selezionare il canale appropriato. Aggiungi un comando di apertura trovato in fase di elaborazione, quindi aggiungi un comando di contatto separato per gli oggetti per separare le celle.

Infine, dalla sezione di filtraggio, aggiungi ed escludi oggetti in base alle dimensioni. Comando per oggetti inferiori a 50 micrometri per escludere piccoli oggetti non cellulari. Quindi, trascinare e rilasciare un nuovo comando di ricerca oggetti nella finestra del protocollo.

Seguendo gli stessi passaggi, selezionare il canale rosso e applicare tutti i comandi successivi. Una volta trovati gli oggetti, utilizzare i comandi nascondi canale o mostra canale per assicurarsi visivamente che gli oggetti rosso e verde corrispondano ai nuclei rosso e verde. Se necessario, fare clic sulle opzioni di misurazione e quindi su feedback per modificare l'aspetto delle maschere degli oggetti.

Ora per trovare gli oggetti gialli che corrispondono alle prime celle della fase S, usa il comando interseca che si trova nella sezione di combinazione e scegli interseca oggetti rossi con oggetti verdi. Anche in questo caso, escludere gli oggetti in base a dimensioni inferiori a 50 micrometri. Per identificare le celle di una fase G, utilizzare il comando sottrai che si trova nella sezione di combinazione e scegliere sottrai oggetto giallo dagli oggetti rossi per trovare esclusivamente oggetti rossi.

Allo stesso modo, sottrarre oggetti gialli da oggetti verdi per identificare esclusivamente oggetti verdi che sono correlati alle celle di fase SG due e MPH sia per gli oggetti esclusivamente rossi che per quelli esclusivamente verdi. Se necessario, rimuovere gli oggetti non cellulari applicando un comando di filtro della popolazione dalla sezione di filtraggio con un fattore di forma maggiore di 0,25. Quindi trova il contorno dello sferoide S.

Utilizzando un comando di ricerca oggetti dalla sezione di ricerca nel canale verde o rosso. Utilizzare un comando chiuso dalla sezione di elaborazione per unire le singole celle in un unico oggetto. Quindi aggiungere un comando Riempi buchi negli oggetti per riempire i buchi nello sphe.

Quindi, utilizzare un filtro fine per rimuovere il rumore dall'oggetto Sphero. Termina la ricerca del contorno sferoidale scegliendo Escludi oggetti per dimensione per rimuovere oggetti più piccoli di 30.000 micrometri. Una volta definiti tutti gli oggetti, aggiungere le distanze di misura dalla sezione relativa per determinare la distanza da ciascun OID al bordo del contorno dello sferoide S.

Fallo in ciascuna delle popolazioni gialle, esclusivamente rosse ed esclusivamente verdi. Per visualizzare le distanze minime dalla cella al bordo sferoidale S più vicino, aprire la scheda delle misurazioni e selezionare le opzioni di feedback seguite dalle relazioni. Quindi scegli Mostra distanze.

Infine, salvare il protocollo per salvare i dati creati dal protocollo. Scegli l'elemento di misura dalla sezione di misurazione. Quindi per interpretare i dati, selezionare l'elemento di misurazione, andare alla scheda di analisi nella sezione di misurazione e scegliere Analizza nel menu di analisi per contare le celle trovate a una certa distanza dal bordo dello steroide.

Creare un filtro selezionando filtro dalla scheda di analisi. Ad esempio, mostra solo i dati in cui la distanza dal bordo della sfera è inferiore a 100 micron. Per esportare i dati non elaborati, selezionare Esporta dalla scheda File e quindi salvare i dati come testo separato da virgole o limitato da tabulazioni.

Questi dati possono essere aperti in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Sphe cellulare generato da C 8 1 16 1. Le cellule di melanoma umano che erano state trasdotte con il sistema Fuji sono state fissate e sezionate.

È stato eseguito l'imaging confocale per il verde AZA, che contrassegna le cellule nella fase SG due M del ciclo cellulare e l'arancione Berra, che contrassegna le cellule nella fase G uno. Quando queste immagini si sovrappongono, caratteristiche chiave come un nucleo necrotico possono essere osservate come previsto. Le cellule arrestate Red G one predominano più vicino a questo nucleo necrotico, mentre le cellule proliferanti rosse e verdi aumentano in modo graduale verso il bordo esterno dello steroide o l'accesso all'ossigeno e ai nutrienti è maggiore.

Dopo l'analisi semi-automatica dell'immagine, è possibile definire le maschere delle celle di Fucci e il contorno dello sferoide S. Il software di imaging è stato utilizzato per quantificare le cellule rosse e verdi nella regione interna o esterna dello sferoide S. Questa analisi ha mostrato che le cellule arrestate in una fase G sono arricchite nella regione interna, mentre le cellule proliferanti predominano più vicino allo steroide Edge.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una o due settimane, un lasso di tempo che include la crescita dello steroide, l'imaging e l'analisi. Seguendo questa procedura, i rad possono essere impiantati nella matrice di collagene e quindi riprodotti tramite una microscopia TimeLapse. Possono quindi essere sottoposti ad analisi di proteine o RNA e questo può aiutarci a rispondere a domande come se la posizione nello steroide e l'accesso all'ossigeno e ai nutrienti possano alterare i fenotipi delle cellule tumorali.