Clearing ottico rapido per l'analisi semi-ad alto rendimento degli sferoidi tumorali
23 agosto 2022
Gli sferoidi tumorali stanno diventando sempre più utilizzati per valutare le interazioni cellula tumorale-microambiente e la risposta terapeutica. Il presente protocollo descrive un metodo robusto ma semplice per l'imaging semi-ad alto rendimento di sferoidi tumorali 3D utilizzando la rapida compensazione ottica.
Il mio laboratorio è specializzato nella modellazione tumorale tridimensionale e quadridimensionale. I modelli sferoidi tumorali sono ampiamente utilizzati in biologia e scoperta di farmaci. Tuttavia, i protocolli esistenti per la raccolta dei dati da questi esperimenti sono costosi, difficili e limitati.
Questo protocollo richiede sostanze chimiche e attrezzature facilmente accessibili e non richiede molto lavoro rispetto ai metodi attuali che forniscono risultati simili. Questo protocollo è stato sviluppato per essere relativamente facile da implementare per i principianti e robusto per piccoli errori, poiché molti dei passaggi sono reversibili. Inizia pesando 0,5 grammi di agarosio a basso punto di fusione in una bottiglia di vetro.
E aggiungere 25 millilitri di PBS. Sciogliere l'agarosio facendo bollire la soluzione in un microonde per 30-60 secondi con il coperchio chiuso e ruotando costantemente. Pesare nove grammi di N, N, N'N'Tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina, 22 grammi di urea, 44 grammi di saccarosio, 0,1 grammi di Triton X-100 e 24,9 grammi di acqua deionizzata.
Riscaldare la soluzione a bagnomaria a 56 gradi Celsius con miscelazione costante. Dopo che i cristalli sono stati sciolti, riposare la soluzione a temperatura ambiente per consentire alle bolle formate durante la miscelazione, di salire in superficie. Generare sferoidi usando il metodo di sovrapposizione di agarosio descritto nel manoscritto testuale.
Tagliare la punta di una punta di pipetta da un millilitro usando un bisturi per allargare l'orifizio. Utilizzando la pipetta, aspirare gli sferoidi dai pozzetti e trasferirli in un tubo conico trasparente da 1,5 millilitri. Più sferoidi delle stesse condizioni possono essere combinati nello stesso tubo.
Lavare gli sferoidi due volte in un millilitro di PBS, quindi aggiungere una soluzione neutra di paraformaldeide preriscaldata al 4% e incubare gli sferoidi a 37 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, rimuovere la soluzione di paraformaldeide e lavare gli sferoidi due volte con un millilitro di PBS. Quindi per la colorazione, trasferire fino a 15 sferoidi in un tubo PCR da 200 microlitri, utilizzando una pipetta.
Permeabilizzare le cellule utilizzando 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,5% in PBS. Posizionare i tubi PCR all'interno di tubi da 50 millilitri, con tappo a vite e coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare gli sferoidi a temperatura ambiente con lieve agitazione. Dopo due ore, sostituire la soluzione con 200 microlitri di tampone anticorpale e incubare per una notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, rimuovere il tampone di diluizione degli anticorpi prima di aggiungere 75 microlitri di anticorpo primario e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni e mezzo. Dopo l'incubazione, rimuovere il surnatante e lavare gli sferoidi due volte con 200 microlitri di PBS, contenente 0,1% Tween e 0,1% Triton X-100 o PBS-TT. Quindi incubare con 200 microlitri di PBS-TT per quattro ore a temperatura ambiente.
Quindi, rimuovere PBS-TT prima di aggiungere 100 microlitri di anticorpo secondario e incubare a quattro gradi Celsius per due giorni e mezzo. Dopo l'incubazione, rimuovere il surnatante e lavare due volte con PBS-TT, prima di incubare con 200 microlitri di PBS-TT per quattro ore. Per il montaggio, utilizzare una pipetta da 200 microlitri, trasferire sferoidi fissi e colorati in tubi PCR da 500 microlitri, in un tubo per condizione.
Sostituire la soluzione con 200 microlitri di gel di agarosio liquido al 2% e centrifugare sulla centrifuga rapida, alla velocità massima fissata, a temperatura ambiente, per 30 secondi. Aspirare gli sferoidi in 50 microlitri di gel di agarosio liquido ed erogare nel pozzetto di una piastra di fondo di vetro a 24 pozzetti. Prima che il gel si indurisca, separare gli sferoidi usando una punta di pipetta nel gel circostante e assicurarsi che gli sferoidi siano coperti di gel.
Quindi, immergere il gel aggiungendo 500 microlitri di soluzione di pulizia per pozzetto e incubare a temperatura ambiente, al buio, per 24 ore prima dell'imaging. Per l'imaging, scegli un obiettivo con una distanza di lavoro abbastanza lunga da comprendere l'intero sferoide, compresa l'altezza di montaggio dello sferoide nella nave. Per identificare il piano equatoriale, regolare la messa a fuoco fino a raggiungere la superficie più grande nel piano XY e visualizzare l'immagine con la percentuale di potenza laser, la tensione del rilevatore, il guadagno e le impostazioni di offset richieste.
Per le immagini tridimensionali, impostare l'inizio e la fine degli sferoidi e scegliere l'intensità del segnale appropriata a varie profondità Z, utilizzando le impostazioni di correzione dell'intensità Z. Questo studio mostra un confronto tra sferoidi per melanoma umano FUCCI e non eliminati, rispetto agli sferoidi montati su PBS. La soluzione di clearing fornisce immagini ad alta chiarezza con una distorsione delle dimensioni minima.
La soluzione di clearing consente inoltre l'imaging ad alta risoluzione dei dettagli a livello cellulare più in profondità negli sferoidi senza sezionamento istologico. Con immagini confocali tridimensionali, è possibile ottenere dettagli a livello cellulare a una profondità di 200 micron. Inoltre, viene mostrato un confronto tra sferoide a foro criosezionato e cancellato, colorato per pimonidazolo e p27kip1.
La colorazione del pimonidazolo mostra la regione ipossica dello sferoide e la colorazione p27kip1, segna l'arresto del ciclo cellulare e la colorazione nucleare DAPI. Una penetrazione più profonda e una minore dispersione, consentono una migliore rappresentazione tridimensionale della struttura sferoidale con una minima perdita di luce. Viene mostrato il rendering tridimensionale degli sferoidi FUCCI, colorati con DRAQ7.
La soluzione di compensazione ha un impatto minimo sulle dimensioni degli sferoidi. Il diametro dello sferoide è stato definito sulla base di una sfera con la stessa area della sezione trasversale dello sferoide. Gli sferoidi sono stati osservati aumentare leggermente di dimensioni nelle prime sei ore, come indicato da un cambiamento di piega del diametro compreso tra il 2% e il 6% Al contrario, dopo 24-72 ore, gli sferoidi sono tornati a una dimensione approssimativamente uguale alla dimensione corrispondente nella fissazione post-paraformaldeide PBS.
È importante attendere almeno 24 ore prima dell'imaging, per lasciare che la soluzione di compensazione si equilibri con gli sferoidi e il gel. Questo protocollo consente ai professionisti di raccogliere rapidamente dati da un gran numero di sferoidi, consentendo un'analisi matematica e statistica quantitativa dettagliata che fornisce approfondimenti dettagliati sulla biologia.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'analisi semialta in throughput di sferoidi tumorali tridimensionali, con un focus sulle interazioni tra cellule tumorali e microambiente e sulle risposte alla terapia. Il metodo si avvale di un'efficiente schiaritura ottica per migliorare la qualità delle immagini.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- Gli sferoidi tumorali sono modelli preziosi nella scoperta di farmaci e nella ricerca biologica.
- I protocolli di imaging esistenti sono spesso complessi e costosi.
- Questo protocollo ha lo scopo di semplificare il processo utilizzando materiali accessibili.
- È stato progettato per essere facile da usare per i principianti e robusto rispetto a errori minori.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'acquisizione di immagini di sferoidi tumorali tridimensionali.
- Facilitare lo studio delle interazioni con il microambiente tumorale.
- Migliorare la valutazione delle risposte terapeutiche nei modelli tumorali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di agarosio a basso punto di fusione e PBS per la generazione di sferoidi.
- Colorazione e fissazione dei sferoidi mediante paraformaldeide e anticorpi.
- Applicazione di una soluzione trasparente per migliorare la chiarezza dell'immagine.
- Acquisizione di immagini mediante microscopia confocale per catturare dettagli cellulari tridimensionali.
Risultati principali
- Sono state ottenute immagini ad alta chiarezza di sferoidi tumorali con minima distorsione.
- Un'analisi più approfondita ha rivelato dettagli cellulari a profondità di 200 micron.
- Il confronto tra sferoidi chiarificati e non chiarificati ha mostrato una migliore rappresentazione della struttura.
- Le variazioni di dimensione dei sferoidi sono state minime dopo il trattamento con la soluzione di chiarificazione.
Conclusioni
- Questo protocollo consente una raccolta efficiente dei dati da numerosi sferoidi.
- Permette un'analisi quantitativa dettagliata della biologia tumorale.
- Il metodo è accessibile e può essere implementato in diversi contesti di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'analisi quantitativa degli sferoidi tumorali è fondamentale per la scoperta precoce di farmaci in oncologia, consentendo una valutazione ad alto contenuto informativo dell'espressione proteica e dell'eterogeneità cellulare. Questo rapido protocollo di chiarificazione ottica supporta flussi di lavoro semi-ad alto rendimento riducendo al minimo la distorsione dimensionale e sfruttando attrezzature di laboratorio standard, affrontando direttamente le sfide relative alla scalabilità e alla riproducibilità nei sistemi di modelli preclinici. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva dello screening fenotipico e della validazione degli obiettivi consentendo un'immagine robusta in tre dimensioni di sferoidi integri.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi dettagliata dell'espressione proteica e della variabilità cellulare all'interno di modelli tumorali tridimensionali.
- Supporta la validazione funzionale del bersaglio preservando l'architettura degli sferoidi per un'analisi spaziale accurata.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici mediante imaging ad alta risoluzione della struttura interna degli sferoidi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara un elevato numero di sferoidi per l'analisi confocale standardizzata e quantitativa.
- Minimizza la distorsione delle dimensioni, garantendo risultati dosabili riproducibili e confrontabili tra diverse condizioni.
- Permette flussi di lavoro di imaging scalabili mediante l'uso di reagenti e attrezzature facilmente accessibili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette l'allineamento dei risultati ottenuti in vitro con la biologia tumorale tridimensionale rilevante per la malattia.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, supportando letture quantitative e multiparametriche.
- Migliora le decisioni relative all'avanzamento basate sulla valutazione del rischio, fornendo dati solidi e statisticamente analizzabili.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Questo protocollo si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un'analisi rapida e quantitativa mediante imaging degli sferoidi tumorali, utile sia per la validazione del bersaglio che per lo screening fenotipico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi proteica con risoluzione spaziale.
- Screening: Fornisce modelli tridimensionali pronti per saggi, riproducibili, per la valutazione di composti e studi comparativi.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative e risultati statistici per l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Allinea l'imaging in vitro ai requisiti dei modelli preclinici per studi su biomarcatori e meccanismi d'azione.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e scalabile, adattabile attraverso diversi programmi di ricerca in oncologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nell'analisi dei modelli tumorali tridimensionali.
- Valore operativo: Semplifica la preparazione dei campioni e l'acquisizione delle immagini, favorendo la riproducibilità e l'elevata produttività.
- Valore strategico: Permette decisioni più informate di tipo go/no-go e un avanzamento efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo dati robusti e quantitativi per le decisioni di avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine confocale e nell'analisi quantitativa di modelli 3D.
- Utilizza reagenti ed attrezzature di laboratorio standard, riducendo al minimo le barriere infrastrutturali.
- Richiede una standardizzazione tra i team per garantire un trattamento del campione e parametri di acquisizione immagini costanti.
- Adattabile a diversi tipi di sferoidi tumorali e condizioni sperimentali.
- L'acquisizione delle immagini deve avvenire dopo un periodo di equilibrazione di 24 ore per assicurare una distorsione minima delle dimensioni e una chiarezza ottimale.
