La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging
8 aprile 2016
L'immunoistochimica è una potente tecnica di laboratorio per valutare la localizzazione e l'espressione delle proteine all'interno dei tessuti. Gli attuali metodi semi-automatici per la quantificazione introducono soggettività e spesso creano risultati irriproducibili. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'immunoistochimica multiplexata e la quantificazione oggettiva dell'espressione proteica e della co-localizzazione mediante imaging multispettrale.
L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare in modo oggettivo l'espressione proteica e la co-localizzazione mediante imaging multispettrale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella ricerca di base e nel campo della patologia diagnostica, ad esempio in che modo l'espressione e la localizzazione delle proteine cambiano dopo un trattamento o durante la progressione di una malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che elimina la soggettività dell'operatore insita nei metodi tradizionali di quantificazione.
Per iniziare il processo di quantificazione, aprire il software di imaging multispettrale per creare una libreria spettrale a partire da vetrini controllo precedentemente preparati, colorati con singoli cromogeni e con il vetrino colorato con ematossilina. Successivamente, aprire un cubo immagine acquisito da un vetrino controllo e selezionare quattro o cinque aree positivamente colorate per definire otticamente il cromogeno. Ripetere i passaggi con cubi immagine provenienti da altri vetrini controllo fino a quando non viene creata una libreria spettrale completa che rappresenti tutti i cromogeni, quindi salvare la libreria spettrale.
Avviare un nuovo progetto all'interno del software di imaging multispettrale selezionando Multispectral o im3 come opzione del formato immagine e Brightfield come formato del campione. Configurare il progetto scegliendo segmentazione del tessuto, individuazione delle caratteristiche, fenotipizzazione, valutazione e esportazione. Modificare la risoluzione dell'immagine per accelerare il tempo di analisi, se desiderato.
Importare la libreria spettrale creata in precedenza e selezionare tutti i cromogeni da includere nell'analisi. Aprire i cubi di immagine da includere nel set di dati di addestramento selezionando l'opzione Apri cubo di immagine. Selezionare almeno il 18% del numero totale di immagini da analizzare per garantire l'accuratezza dell'addestramento.
Successivamente, scegliere il set di addestramento delle immagini. Immagini che rappresentano tutti gli stati patologici, al fine di aumentare l'accuratezza della segmentazione. Includere un numero elevato di immagini con colorazione negativa nel set di addestramento per evitare bias durante questo passaggio.
Bilanciare il bianco delle immagini nel set di addestramento selezionando lo strumento contagocce e scegliendo un'area bianca in una delle immagini. Selezionare il pulsante Avanti per passare alla segmentazione del tessuto. Quindi utilizzare il pannello categorie di tessuto per selezionare i tipi di tessuto da analizzare; per una localizzazione proteica nei tessuti più accurata, è possibile utilizzare le categorie di tessuto selezionabili.
Iniziare a creare l'algoritmo e definire le categorie di tessuto utilizzando lo strumento penna e disegnando attorno ai gruppi di cellule all'interno delle immagini di addestramento. Al termine di una categoria di tessuto, ripetere il passaggio per le altre categorie di tessuto. Assicurarsi di scegliere gruppi di cellule all'interno delle immagini che siano caratteristici del tipo di categoria di tessuto.
Selezionare i componenti da includere nell'addestramento del segmentatore di tessuto. Scegliere una scala di pattern appropriata per addestrare il segmentatore di tessuto. Quindi selezionare il pulsante del segmentatore di tessuto addestrato.
Osservare una finestra pop-up che mostra l'accuratezza della proporzione di pixel all'interno delle regioni di addestramento correttamente classificate. Segmentare l'intero set di immagini di addestramento facendo clic su "segmenta immagini". Al termine, rivedere il set di addestramento per individuare eventuali tessuti classificati in modo errato con l'algoritmo di addestramento attuale.
Dopo aver verificato con fiducia i risultati dell'algoritmo di segmentazione del tessuto, selezionare il pulsante avanti. Assicurarsi che i nuclei siano già selezionati per poter scegliere il citoplasma e/o la membrana. Selezionare la scheda nuclei e impostare le opzioni appropriate per la segmentazione nucleare.
Quindi scegliere se includere singole categorie di tessuto o tutte le categorie di tessuto nella segmentazione. Selezionare l'approccio basato sulla soglia dell'oggetto di controcolorazione per un metodo semplificato che consenta di ottenere buoni risultati. Successivamente, selezionare l'approccio basato sulla soglia dell'oggetto su una controcolorazione nucleare affidabile.
Selezionare i parametri di forma del citoplasma scegliendo la scheda citoplasma. Successivamente, selezionare la distanza esterna rispetto al nucleo. Quindi, selezionare la dimensione minima.
Selezionare il componente dell'opzione successiva con primario, secondario e terziario selezionato come opzioni secondarie. Passare alla scheda della membrana. Scegliere primo per il marcatore specifico della membrana utilizzato.
Regolare la densità ottica a scala completa o OD per determinare una soglia minima o un valore positivo per ciascun marcatore sulle membrane cellulari. Proseguire sotto la scheda membrana selezionando la dimensione massima della cellula. Dopo aver selezionato tutte le opzioni, scegliere "segmenta tutto".
Applicare le impostazioni alle immagini e osservarle. Scegliere Avanti per passare al passaggio di valutazione IHC e selezionare una categoria di tessuto da valutare. Scegliere un tipo di valutazione desiderato e selezionare il compartimento cellulare da utilizzare nell'analisi di valutazione.
Successivamente, selezionare i dati del componente di visualizzazione e spostare il cursore sulle immagini di addestramento per individuare la soglia minima di densità ottica della colorazione per le cellule positive relativamente ai componenti di interesse. Esportare i dati del set di addestramento per testare l'algoritmo creato mediante la segmentazione del tessuto, la segmentazione cellulare e i valori di punteggio; seguire le istruzioni per creare una nuova cartella per la directory di esportazione. Selezionare le immagini e le tabelle da generare e includere nell'analisi.
Successivamente, eseguire l'analisi selezionando l'esportazione per tutti. Al termine dell'analisi, visualizzare i dati di segmentazione cellulare e di punteggio per immagini con entrambe le colorazioni, alta e bassa, per valutare l'accuratezza delle impostazioni. Una volta soddisfatti delle impostazioni, fare clic sulla scheda di analisi in blocco per copiare l'algoritmo nel progetto attivo.
Quindi scegliere una nuova directory di esportazione e selezionare le immagini e le tabelle da includere nell'analisi. Nell'opzione dei file di input, selezionare tutte le immagini da includere nell'analisi in batch. Selezionare l'opzione di esecuzione per effettuare l'analisi.
Al termine, passare alla scheda di revisione e unione. Selezionare "includi tutto" e quindi selezionare "unisci" per creare fogli di dati con i dati riassuntivi per l'analisi. L'addestramento è stato eseguito su tessuti prostatici per segmentare le immagini in porzioni epiteliali e stromali.
Insieme a un compartimento non tissutale. Un insieme di immagini di addestramento è stato importato in un software di imaging multispettrale rappresentante i tipi di tessuto e gli stati patologici dell'intero set di immagini. Sono state create categorie di tessuto, incluse stroma, epitelio e non tessuto, e le categorie sono state definite disegnando manualmente sopra le immagini di addestramento.
È stato creato e applicato un algoritmo per la segmentazione dei tessuti al set di addestramento delle immagini. Segmentazione accurata dei tessuti. Utilizzando la tecnica di immunohistochimica multietichetta, le cellule positive per l'espressione nucleare di ER-alfa, visibili in rosso, e di AR, visibili in marrone, sono state identificate nonostante i segnali cromatici e metrici sovrapposti. L'espressione specifica della membrana cellulare di CD-147 è stata quantificata utilizzando E-caderina, visibile in nero, come proteina marcatrice.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare l'espressione proteica e la co-localizzazione, nonché di come informare e fissare tessuti inclusi in paraffina.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo di immunohistochemia multiplex che utilizza l'imaging multispettrale per quantificare in modo oggettivo l'espressione proteica e la co-localizzazione. La tecnica mira ad eliminare la soggettività dell'operatore presente nei metodi tradizionali di quantificazione, migliorando la riproducibilità della ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Patologia
- Immunoeistochemica
Sfondo
- L'immunohistochemia valuta la localizzazione e l'espressione delle proteine.
- I metodi attuali spesso introducono soggettività e irreproducibilità.
- L'imaging multispettrale offre una soluzione a queste sfide.
- Questo metodo può essere applicato sia nella ricerca di base che nella patologia diagnostica.
Scopo dello studio
- Quantificare oggettivamente l'espressione proteica e la co-localizzazione.
- Rispondere a domande relative alle variazioni proteiche dopo un trattamento o la progressione di una malattia.
- Migliorare l'accuratezza dei metodi di quantificazione nella ricerca.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di una libreria spettrale a partire da vetrini di controllo colorati con singoli cromogeni.
- Utilizzo di un software di imaging multispettrale per analizzare i cubi immagine provenienti dai vetrini di controllo.
- Definizione ottica delle aree di cromogeno per migliorare la quantificazione.
- Salvataggio della libreria spettrale per analisi future.
Risultati principali
- Il metodo elimina con successo la soggettività dell'operatore.
- Fornisce un metodo affidabile per valutare la localizzazione e l'espressione delle proteine.
- I risultati possono essere riprodotti in diversi esperimenti.
- Questa tecnica può contribuire ad approfondire la conoscenza in vari campi di ricerca.
Conclusioni
- L'immunoistochimica multiplex con imaging multispettrale è uno strumento prezioso.
- Il metodo migliora l'oggettività della quantificazione delle proteine.
- Ha implicazioni significative sia per la ricerca che per la diagnostica clinica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'immunohistochimica quantitativa multiplex con imaging multispettrale risponde all'esigenza fondamentale di dati oggettivi e riproducibili sull'espressione proteica e sulla co-localizzazione nei processi di scoperta basati sui tessuti. Eliminando la soggettività dell'operatore, questo flusso di lavoro aumenta la fiducia predittiva in punti critici di svolta nella validazione del target e nella ricerca traslazionale. L'approccio consente una valutazione robusta dei biomarcatori, abilitando decisioni di portafoglio aggiustate per il rischio nello sviluppo precoce e preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette una quantificazione oggettiva dell'espressione proteica e della localizzazione spaziale nel contesto del tessuto.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio distinguendo i modelli di espressione subcellulare e specifici del tessuto.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico mediante l'analisi di co-localizzazione di più biomarcatori.
- Migliora la sicurezza predittiva per la selezione di bersagli da avanzare nei test successivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un'acquisizione e un'analisi standardizzate e ad alto rendimento delle immagini per la riproducibilità dei saggi.
- Fornisce letture quantitative e specifiche per compartimento adatte ai flussi di lavoro di screening.
- Consente un confronto robusto degli effetti dei composti sulla localizzazione e sull'espressione delle proteine.
- Supporta la scalabilità della piattaforma e il riutilizzo su diversi modelli di tessuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la quantificazione dei biomarcatori al tessuto rilevante per la malattia e ai compartimenti subcellulari.
- Mantiene la continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, supportando confronti oggettivi tra studi.
- Riduce il rischio di traduzione consentendo l'analisi di popolazioni cellulari doppio-positivo, singolo-positivo e negative.
- Facilita decisioni di avanzamento basate sui dati per biomarcatori candidati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro di imaging multiplex integra la fase iniziale della scoperta fino alla ricerca preclinica, supportando la verifica delle ipotesi, la validazione dei bersagli e la valutazione traslazionale dei biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Quantifica in modo oggettivo l'espressione proteica e la co-localizzazione per chiarire i percorsi biologici e convalidare i bersagli.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Genera misurazioni specifiche per compartimento e statisticamente robuste per confronti incrociati tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Allinea l'analisi dei biomarcatori con l'architettura tissutale e le popolazioni cellulari rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging e analisi scalabile e standardizzata per l'implementazione in più progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi su target e biomarcatori.
- Valore operativo: Standardizza l'acquisizione e l'analisi delle immagini, migliorando la riproducibilità e la produttività.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di target e biomarcatori validati, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze specifiche in immunoeistochemia, imaging multispettrale e software di analisi delle immagini.
- Necessita dell'accesso a scanner automatici per vetrini e piattaforme di imaging multispettrale compatibili.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i team per i protocolli di colorazione e gli algoritmi di analisi.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi tipi di tessuto e modelli di malattia.
- La selezione del set di addestramento e la validazione dell'algoritmo sono fondamentali per una quantificazione robusta e priva di bias.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Automated Image Acquisition and Analysis
1:43
Tissue Segmentation
3:48
Cell Segementation
5:16
Scoring and IHC and Co-localization
5:50
Applying the Algorithm and Batch Analysis
7:08
Results: Successful Cell and Tissue Segmentation
8:18
Conclusion
