La quantificazione di espressione della proteina e co-localizzazione Usando multiplex immunoistochimica di colorazione e multispettrale Imaging

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di quantificare oggettivamente l'espressione proteica e la co-localizzazione utilizzando l'imaging multispettrale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca di base e della patologia diagnostica, come ad esempio il modo in cui le proteine cambiano l'espressione e la localizzazione dopo il trattamento o nella progressione della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che elimina la soggettività dell'operatore inerente ai metodi di quantificazione tradizionali.

Per iniziare il processo di quantificazione, aprire il software di imaging multispettrale per creare una libreria spettrale da vetrini di controllo precedentemente preparati e colorati con singoli cromogeni e dal vetrino colorato con ematossilina. Quindi, apri un cubo di immagini acquisito da un vetrino di controllo e seleziona da quattro a cinque aree colorate positivamente per definire otticamente il cromogeno. Ripetere i passaggi con i cubi immagine di altri vetrini di controllo fino a creare una libreria spettrale completa che rappresenta tutti i cromogeni, quindi salvare la libreria spettrale.

Iniziate un nuovo progetto all'interno del software di imaging multispettrale selezionando Multispettrale o im3 per l'opzione del formato immagine e Campo chiaro per il formato del campione. Configura il progetto scegliendo il tessuto del segmento, trova le funzionalità, la fenotipizzazione, il punteggio e l'esportazione. Se lo si desidera, modificare la risoluzione dell'immagine per accelerare il tempo di analisi.

Importare la libreria spettrale precedentemente creata e selezionare tutti i cromogeni da includere nell'analisi. Aprire i cubi di immagini da includere nel set di dati di training selezionando l'opzione Apri cubo immagine. Seleziona almeno il 18% del numero totale di immagini da analizzare per garantire l'accuratezza dell'addestramento.

Quindi, scegli il set di immagini di training. Immagini che rappresentano tutti gli stati patologici, per aumentare l'accuratezza della segmentazione. Includi abbondanti immagini di colorazione negativa nel set di addestramento per evitare distorsioni durante questo passaggio.

Bilancia il bianco delle immagini nel set di addestramento selezionando lo strumento contagocce e scegliendo un'area bianca in un'immagine. Selezionare il pulsante di avanzamento per spostare la segmentazione del tessuto. Quindi, utilizzare il pannello delle categorie di tessuti per scegliere i tipi di tessuto da analizzare per una localizzazione più accurata delle proteine, è possibile utilizzare categorie di tessuti selezionate.

Inizia a creare l'algoritmo e a definire le categorie di tessuti utilizzando lo strumento penna e disegnando gruppi di cellule all'interno delle immagini di addestramento. Al termine di una categoria di tessuto, ripetere il passaggio per le altre categorie di tessuto. Assicurati di scegliere gruppi di cellule all'interno di immagini che sono caratteristiche del tipo di categoria di tessuto.

Selezionare i componenti da includere nell'addestramento per il segmentatore tissutale. Scegliere una scala di pattern appropriata per addestrare il segmentatore tissutale. Quindi selezionare il pulsante del segmentatore di tessuto addestrato.

Osservare una finestra pop-up che mostra l'accuratezza della proporzione di pixel all'interno di regioni di addestramento correttamente classificate. Segmenta l'intero set di immagini di training facendo clic su Segmenta immagini. Al termine, esaminare il set di addestramento per individuare eventuali tessuti classificati in modo errato con un algoritmo di addestramento corrente.

Quando si è certi dei risultati dell'algoritmo di segmentazione dei tessuti, selezionare il pulsante di avanzamento. Assicurarsi che i nuclei siano già selezionati per scegliere il citoplasma e/o la membrana. Seleziona la scheda nuclei e scegli le impostazioni appropriate per la segmentazione nucleare.

Quindi scegli se le singole o tutte le categorie di tessuti saranno incluse nella segmentazione. Selezionare l'approccio di soglia basato sull'oggetto di contromacchia per un metodo semplificato per ottenere buoni risultati. Quindi, selezionare l'approccio della soglia basato sull'oggetto su un controcolorante nucleare affidabile.

Seleziona i parametri a forma di citoplasma scegliendo la scheda del citoplasma. Quindi, selezionare la distanza esterna dal nucleo. Quindi seleziona la dimensione minima.

Seleziona il componente opzione successivo con opzioni primarie, secondarie e terziarie come opzioni secondarie. Passare alla scheda della membrana. Scegliere prima il marcatore specifico della membrana utilizzato.

Regola la densità ottica o OD a fondo scala per trovare una soglia minima o un positivo per ogni marcatore sulle membrane cellulari. Proseguendo nella scheda membrana, selezionare la dimensione massima della cella. Dopo aver selezionato tutte le opzioni, seleziona Segmenta tutto.

Applicare le impostazioni alle immagini e osservarle. Scegli avanza per passare al passaggio IHC del punteggio e scegli una categoria di tessuto da valutare. Scegliere il tipo di punteggio desiderato e scegliere il compartimento delle celle da utilizzare nell'analisi del punteggio.

Quindi, selezionare Visualizza dati componente e spostare il cursore sulle immagini di addestramento per trovare la soglia minima di colorazione della densità ottica appropriata per le celle positive per i componenti di interesse. Esporta i dati per il set di addestramento per testare l'algoritmo creato tramite la segmentazione dei tessuti, la segmentazione cellulare e i valori di punteggio, segui le istruzioni per creare una nuova cartella per la directory di esportazione. Selezionare le immagini e le tabelle da creare e includere nell'analisi.

Quindi, eseguire l'analisi selezionando Esporta per tutti. Al termine dell'analisi, visualizzare i dati di segmentazione cellulare e punteggio per le immagini con colorazione alta e bassa per valutare l'accuratezza delle impostazioni. Una volta soddisfatti delle impostazioni, fare clic sulla scheda di analisi batch per copiare l'algoritmo nel progetto attivo.

Quindi scegli una nuova directory di esportazione e seleziona le immagini e le tabelle da includere nell'analisi. Nell'opzione dei file di input, scegli tutte le immagini da includere nell'analisi batch. Selezionare l'opzione Esegui per eseguire l'analisi.

Al termine, passare alla scheda di unione di revisione. Selezionare Includi tutto e selezionare Unisci per creare fogli di dati con dati di riepilogo per l'analisi. L'allenamento è stato eseguito sui tessuti prostatici per segmentare le immagini in porzioni epiteliali e stromali.

Insieme a un compartimento non tissutale. Una serie di immagini di addestramento è stata importata in un software di imaging multispettrale che rappresenta i tipi di tessuto e gli stati patologici dell'intero set di immagini. Sono state create categorie di tessuti, tra cui stroma, epiteli e non tessuti, e le categorie sono state definite disegnando manualmente sopra le immagini di addestramento.

È stato creato un algoritmo per la segmentazione dei tessuti e applicato al set di immagini di addestramento. Segmentazione accurata dei tessuti. Utilizzando la tecnica di immunoistochimica multiplex, sono state identificate cellule positive per l'espressione nucleare di ER-alfa viste come rosse e AR viste come marroni nonostante la sovrapposizione di colori e segnali metrici L'espressione specifica della membrana cellulare di CD-147 è stata quantificata utilizzando E-caterina vista come nera come proteina marcatrice.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come quantificare l'espressione proteica e la co-localizzazione, informare e fissare i tessuti inclusi nella paraffina.