Name: Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Scopri l'imaging di polisomi cerebrali con microscopia a forza atomica senza fissazione o marcatura. Questo metodo consente analisi in condizioni fisiologiche per studiare l'organizzazione dei ribosomi.

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Questa ricerca è stata supportata dal progetto di ricerca AXonomIX finanziato dalla Provincia Autonoma di Trento, Italia.

Le pratiche utilizzate per ottenere i tessuti di topo sono stati approvati dal corpo per la protezione degli animali (OPBA) dell&#39;Università degli Studi di Trento (Italia), il protocollo n. 04-2015, il decreto di cui al art.31 legislativo n. 26/2014. Tutti i topi sono stati mantenuti al Organismo modello Struttura del Centro per la Biologia Integrata (CIBIO), Università degli Studi di Trento, Italia. Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell&#39;RNA dei campioni, preparare tutti i buffer con acqua DEPC trattati per ridurre al minimo la contaminazione RNasi. 1. Preparazione di polisomi da Brains Interi <ol><li> Raccolta di tessuti cerebrali (15 min) <ol><li> Euthanize wild-type ceppo di topi C57BL / 6 con CO 2 asfissia per 5 min 36. Sezionare accuratamente il cervello dal cranio 36, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml e metterlo immediatamente in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione del lisato (30 min) <ol><li> Polverizzare l&#39;intero tessuto cerebrale utilizzandoun mortaio e pestello sotto azoto liquido. </li><li> Trasferire circa 25 mg di polvere in una provetta fredda e immediatamente (per evitare lo scongelamento del tessuto polverizzato) aggiungere 0,8 ml di tampone di lisi (vedi Tabella 1) e disturbare la cella pipettando su e giù 25 volte rapidamente. </li><li> Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 1 min a 4 ° C per sedimentare detriti cellulari. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta e mantenere il tubo in ghiaccio per 15 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 5 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e mitocondri. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Conservare il supernatante a -80 ° C per un massimo di 6 mesi o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Saccarosio preparazione gradiente e centrifugazione (2 ore e 30 min) <ol><li> tubi ultracentrifuga Lavare a lungo con RNase-free acqua (acqua trattata dietilpirocarbonato (DEPC-acqua) o commerciale) di und 3% H 2 O / DEPC H soluzione 2 O 2. </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio e aggiungere 5,5 ml di soluzione di saccarosio al 50% freddo nella parte inferiore di ciascun tubo (vedi Tabella 1 per soluzioni di saccarosio). Aggiungere con cautela la caduta di soluzione di saccarosio al 15% a goccia, rimanendo vicino al interfase per preservare un interfase tagliente, finché il tubo sia completamente riempito. Quando il tubo viene riempito completamente, chiuderla con un tappo di gomma per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> In una stanza fredda delicatamente fissare i tubi in orizzontale e tenerlo in questa posizione per 2 ore. Trascorso questo tempo, lentamente raddrizzare i tubi nella posizione verticale e metterli in ghiaccio. I gradienti sono ora pronti per essere utilizzati. In alternativa, preparare il gradiente di saccarosio 15-50% utilizzando un gradiente convenzionale ex. </li><li> In una stanza fredda rimuovere attentamente 1,0 ml dalla sommità del gradiente e sovrapporre la goccia di saccarosio a goccia con il lisato citosolica (cioè, il supernatante ottenuto in step 1.2). </li><li> Abbassare con cautela i tubi nei secchi di rotore oscillante. Centrifugare i gradienti per 100 min a 180.000 xg a 4 ° C usando un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Dopo la centrifugazione, lasciare i tubi in loro secchi per 20 min a 4 ° C per consentire ai gradienti stabilizzano. </li></ol></li><li> frazionamento gradiente di saccarosio (2 ore) <ol><li> Rimuovere con cautela un tubo ultracentrifuga dal rotore ultracentrifuge e montarlo sul dispositivo di raccolta di un gradiente di densità frazionamento del sistema. Raccogliere 1 ml frazioni di monitoraggio l&#39;assorbanza a 260 nm con una VIS ​​rivelatore UV / (vedi figura 1 pannello superiore). Mantenere le frazioni raccolte sul ghiaccio. </li><li> Preparare aliquote di 30-40 ml delle frazioni di interesse, tenerli in ghiaccio prima di riporli a -80 ° C fino all&#39;uso. Non utilizzare aliquote o frazioni di saccarosio che hanno subito più di due cicli di gelo-disgelo (vedi Figura 1 inferiore del pannello). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparazione del campione per la microscopia a forza atomica (3 ore) <ol><li> Con del nastro, staccare i fogli di mica. </li><li> Lavare i fogli di mica 3-4 volte con DEPC-acqua e metterlo in una piccola capsula di Petri. Quindi asciugare la superficie con l&#39;aria. </li><li> Coprire la mica con 200 ml di 1 mM Niso 4 e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione di nichel e poi asciugare la superficie con l&#39;aria. Eseguire tutte le fasi future a 4 ° C mettendo la piastra di Petri con la mica su ghiaccio. </li><li> Scongelare una aliquota ottenuta in 1.4.2 su ghiaccio e delicatamente aggiungere tutti della goccia campione goccia sulla mica. Utilizzando una punta 100-200 microlitri, spalmare il campione su tutta la superficie della mica. Incubare il campione in ghiaccio per 3 min. </li><li> Coprire la goccia foglio di mica a goccia con 200 ml freddo Buffer-AFM (vedi Tabella 1) e incubare per 1 ora su ghiaccio. </li><li> Imaging a liquido <ol><li> Rimuovere con attenzione il Buffer-AFM e lavare i fogli di mica 3-4 tempos con 200 ml freddo Buffer-AFM per rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio. Poi lavare i fogli di mica 3 volte con tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1), lasciando la superficie di mica ricoperta da alcuni microlitri di soluzione. </li><li> Vai al punto 3 (acquisizione immagine). </li></ol></li><li> Imaging in aria <ol><li> Rimuovere con cautela il Buffer-AFM e lavare la mica 3-4 volte con 200 pl freddo Buffer-AFM per rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio. Poi, lavare il mica 3 volte con soluzione di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1) e scaricare l&#39;acqua in eccesso con carta. </li><li> Lasciare asciugare il campione sotto il cofano chimica con la parte superiore della scatola di Petri parzialmente aperta. Dopo 2 ore, chiudere la piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente. Misurare il campione dopo 2-3 ore come sono stabili per anni. </li></ol></li></ol> 3. Acquisizione di immagini (15 min per immagine dopo la stabilizzazione termica) Nota: polisomi immobilizzati su mica possono essere esposte in aria o in liquido, utilizzando la modalità AC. <ol><li> Fissare la mica a supporto del campione con del nastro biadesivo. </li><li> Inserire il supporto del campione nella fase AFM seguendo le indicazioni del produttore. Quando l&#39;imaging in liquido, se possibile, cercare di mantenere il campione ad una temperatura inferiore a 25 ° C per aumentare polysome stabilità nel tempo. </li><li> Selezionare un cantilever adatta per l&#39;imaging CA e montarlo sul supporto punta seguendo le indicazioni del produttore. Qui, l&#39;uso cantilever con forza costante tra 2-20 N / m per l&#39;imaging e l&#39;aria intorno a 0,1 N / m per l&#39;imaging liquido. </li><li> Regolare il punto laser sulla mensola e azzerare i segnali rivelatori quadrante. </li><li> Selezionare una frequenza di pilotaggio opportune e guidare il cantilever con un&#39;ampiezza di 10-20 nm. </li><li> Approccio il campione fino a quando la punta impegna la superficie. </li><li> Selezionare un&#39;area di scansione di 2x2 micron, acquisire almeno 512x512 pixel immagini (larghezza in pixel &lt;4 nm), selezionare una modalità di sottrazione dello sfondo dal vivo e una scala Z di 20-25 nm. </li><li> ispezionare tsi cerca di immagine per la presenza di oggetti rotondi caratterizzati dalla altezza tra 10 e 15 nm quando l&#39;acquisizione in aria e 25 e 30 nm quando nel liquido e la larghezza nell&#39;intervallo 25-30 nm. Regolare i parametri di setpoint e un giudizio fino ad oggetti appuntiti sono visualizzati. Lo sfondo deve apparire relativamente piatta in buoni campioni, con alcuni oggetti di altezza 2-4 nm (vedi Figura 2A e B). </li><li> Se l&#39;immagine sembra buono (come indicato al punto 3.8), acquisire diversi (almeno dieci) scansioni 2x2 micron a diverse aree campione. </li><li> (opzionale). Se necessario, acquisire immagini ad alta risoluzione di polisomi selezionati (vedi Figura 2C). </li><li> Applicare correzioni software (piano sottrazione e line-by-line algoritmi di correzione) per correggere le immagini AFM rimozione inclinazione arbitraria e alla deriva effetti. </li></ol> 4. Analisi dei dati (30 min per immagine) <ol><li> esportare immagini in ImageJ (opzionale: applicare un fattore di scala) Preferentbuona resa utilizzando un formato di compressione senza perdita di dati, ad esempio, il formato TIFF (vedi Figura 3A). </li><li> Utilizzare la macro set di strumenti RiboPick.ijm ImageJ (da copiare nella macro / set di strumenti sottodirectory ImageJ) per contare ribosomi in polisomi (vedi Figura 3B) e calcolare le proprietà statistiche del campione (vedi Figura 3C). <ol><li> Inizia il caricamento di un&#39;immagine utilizzando il &lt;Leggi image&gt; strumento che inizializza il programma. </li><li> Scegli i centri ribosoma con il &lt;selezione Point&gt; standard di ImageJ strumento (shift + click sinistro consente la selezione multipla dei ribosomi). Segnare i ribosomi selezionati con il &lt;Mark ribosomi&gt; strumento. coordinate Ribosoma verranno visualizzati in una finestra di testo personalizzato. </li><li> Aggiungere più ribosomi allo stesso polysome ripetendo la procedura indicata al punto 4.2.2. </li><li> Rimuovere ribosomi erroneamente contrassegnati con l&#39;&lt;Annulla l&#39;ultima scelta&gt; strumento (inizia la rimozione dall&#39;ultimo ribosoma aggiunto al primo212; nel polysome corrente). </li><li> Quando la polysome è completata, utilizzare il &lt;Nuovo polysome&gt; strumento. Come si aggiunge il numero polysome come una sovrapposizione all&#39;immagine, viene aggiornata la finestra di testo. </li><li> Utilizzare il &lt;Salva risultati e vicino&gt; di scrivere il ribosoma un&#39;immagine PNG che riassume ribosomi e polisomi la raccolte di file (le unità predefinite dell&#39;immagine vengono utilizzati) e coordina. L&#39;immagine originale è chiuso senza essere salvato. </li></ol></li></ol>

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<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti in questo articolo e nulla da rivelare.

Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l&#39;organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell&#39;espressione genica, è essenziale analizzare l&#39;organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione. Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizzati s...

La sintesi delle proteine ​​è la più processo consumo di energia nelle cellule 1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine ​​sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che 3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono 6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi 14- 16, le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l&#39;organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l&#39;indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell&#39;espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma 17,18. Dalla scoperta del ribosoma 14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti 19,20, lievito 21 e più recentemente in umano 22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici 14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione 23-26, lisati cellulari umani 27 o 28 nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull&#39;organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi 23, 26-28 e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano 24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l&#39;RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l&#39;organizzazione della macchina di traduzione. Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l&#39;imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori 29-33 e gli esseri umani 27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l&#39;etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi 27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l&#39;analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome 27 con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi 27. Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l&#39;analisi dei dati in cui AFM viene applicata all&#39;immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l&#39;imaging AFM. Oltre all&#39;analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ 34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome 27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Preparazione del lisato</td></tr><tr><td>Microcentrifuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Preparazione di lisato</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Preparazione a gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Centrifugazione a gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Centrifugazione a gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>Provetta in poliallomero</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di frazionamento a gradiente di densità di centrifugazione a gradiente di saccarosio&nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Frazionamento in gradiente di saccarosio</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

scrutando cervello polisomi con microscopia a forza atomica

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine ​​e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l&#39;organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l&#39;acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l&#39;imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.

Il saccarosio gradiente polisomale profiling dell&#39;intero cervello di topo È possibile purificare polisomi da un lisato cellulare mediante profilatura polisomale, che separa macromolecole conformemente al loro peso e dimensioni. Con profiling polisomale, lisati citoplasmatici ottenuti da cellule o tessuti coltivati, come in questo esempio, vengono caricati su un gradiente di saccarosio lineare e trattati da...

Sebbene la struttura dei ribosomi sia stata ampiamente caratterizzata, l'organizzazione dei polisomi è ancora poco studiata. Per ovviare a questa mancanza di conoscenza, presentiamo qui un protocollo di preparazione dettagliato per l'imaging accurato dei polisomi dei mammiferi mediante microscopia a forza atomica (AFM) in aria e liquidi.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una procedura dettagliata per la corretta purificazione e deposizione di poliribosomi cerebrali su mica ed ottenere migliaia di immagini con risoluzione nanometrica, senza la necessità di un pesante post-processing o di analisi di ricostruzione tridimensionale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della traduzione e del controllo traduzionale, come comprendere l'impatto dell'organizzazione dei ribosomi all'interno dei polisomi durante il ripristino dell'espressione genica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non richiede fissazione o marcatura del campione, e le misurazioni possono essere effettuate in condizioni prossime a quelle fisiologiche, consentendo di identificare facilmente i ribosomi e i filamenti di RNA nudo.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione dei poliribosomi nei mammiferi, può essere applicato anche ad altri microrganismi, come lieviti, batteri e insetti, nonché a condizioni che coinvolgono i controlli traduzionali dell'espressione genica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la manipolazione del campione polisomale per l'assorbimento sulla micca e i passaggi di lavaggio sono piuttosto delicati e richiedono abilità manuali ed esperienza. La procedura sarà dimostrata da Paola Bernabo e Lorenzo Lunelli.Per iniziare, raccogliere e congelare il tessuto cerebrale come descritto nel protocollo testuale allegato. Successivamente, prelevare il tessuto congelato dal congelatore e portarlo sul banco di lavoro. Mettere il tessuto cerebrale congelato e azoto liquido in un mortaio preraffreddato e ridurlo in polvere utilizzando un pestello fino a ottenere una polvere fine.Trasferire circa 25 milligrammi della polvere cerebrale in una provetta da microcentrifuga fredda e aggiungere immediatamente 0,8 millilitri di buffer di lisi. Aspirare e rilasciare la miscela 25 volte rapidamente per rompere le cellule. Successivamente, centrifugare la provetta a 12.000 x g per un minuto a quattro gradi Celsius per formare un pellet con i detriti cellulari.Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da microcentrifuga e mantenere il tubo sul ghiaccio per 15 minuti. Successivamente, centrifugare il tubo per cinque minuti per ottenere un pellet di nuclei e mitocondri. Poi, rimuovere con attenzione un millilitro dalla parte superiore di un gradiente di saccarosio precedentemente preparato.Aggiungere goccia a goccia il surnatante del lisato citosolico sulla soluzione di saccarosio. Con il campione ora posizionato in cima al gradiente, inserire con attenzione la provetta e una provetta di controbilanciamento nei contenitori del rotore a bracci oscillanti. Centrifugare il gradiente per 100 minuti.Dopo l'ultracentrifugazione, lasciare i tubi nei rispettivi alloggiamenti per 20 minuti a quattro gradi Celsius, in modo che il gradiente si stabilizzi. Successivamente, rimuovere con attenzione il tubo del campione e montarlo sul dispositivo di raccolta di un sistema di frazionamento su gradiente di densità. Raccogliere frazioni da un millilitro monitorando l'assorbanza degli acidi nucleici a 260 nanometri mediante un rivelatore a luce UV-visibile e porle sul ghiaccio.Successivamente, preparare aliquote di 30-40 microlitri delle frazioni di interesse e mantenerle sul ghiaccio. Se i campioni non verranno utilizzati immediatamente, conservarli a 80 gradi Celsius e adottare misure per limitare il numero di cicli di congelamento-scongelamento. Per preparare i campioni per l'analisi mediante AFM, coprire innanzitutto un foglio di mica lavato con 200 microlitri di solfato di nichel ii 1 millimolare e incubare il foglio per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi rimuovere la soluzione, asciugare la superficie con aria compressa e posizionare la piastra di Petri sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere delicatamente l'intero aliqota dalla frazione di interesse, goccia dopo goccia, sulla mica. Utilizzando una punta da 100 o 200 microlitri, distribuire il campione su tutta la superficie della mica e incubare il campione sul ghiaccio per tre minuti.Quindi, coprire la lamina di mica, goccia a goccia, con 200 microlitri di tampone AFM freddo e incubare il campione sul ghiaccio per un'ora. È fondamentale mantenere il campione a 40 gradi e utilizzare un tampone freddo preparato in acqua priva di RNasi per preservare l'organizzazione dei poliribosomi. Al termine dell'incubazione, rimuovere con attenzione il tampone e lavare la mica da tre a quattro volte con 200 microlitri di tampone AFM freddo per eliminare qualsiasi eccesso di saccarosio.Quindi, lavare la mica tre volte con soluzione di lavaggio fredda e rimuovere l'acqua in eccesso dalla mica utilizzando carta da filtro. È fondamentale ora rimuovere completamente il saccarosio dai campioni assorbenti, ora che sono stati separati sia i ribosomi che l'RNA nudo nel polisoma. Lasciare il campione asciugare sotto la cappa chimica con il coperchio della piastra di Petri parzialmente aperto.Dopo due ore, chiudere la piastra di Petri. Il campione può ora essere conservato a temperatura ambiente. Fissare il campione preparato al portacampione del microscopio a forza atomica (AFM) utilizzando nastro adesivo doppiofaccia.Quindi, inserire il portacampioni sulla piattaforma del microscopio a forza atomica (AFM) seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la calibrazione, avvicinare il campione fino a quando la punta della mensola interagisce con la superficie. Selezionare un'area di scansione di due per due micron, una risoluzione di almeno 512 x 512 pixel, scegliere la modalità di sottrazione del fondo in tempo reale e impostare una scala Z compresa tra 20 e 25 nanometri.Quindi, iniziare l'acquisizione delle immagini. Esaminare l'immagine, cercando la presenza di oggetti rotondi caratterizzati da un'altezza compresa tra 10 e 15 nanometri durante l'acquisizione delle immagini in aria. Successivamente, regolare il punto di regolazione e i parametri di retroazione finché non vengono visualizzati oggetti nitidi.Lo sfondo dovrebbe apparire relativamente piatto nei campioni di buona qualità, con alcuni oggetti alti da due a quattro nanometri. Una volta che l'immagine appare soddisfacente, acquisire diverse scansioni di due per due micron in diverse aree del campione. Dopo il deposito di aliquote di saccarosio sulla micca, la microscopia a forza atomica (AFM) fornisce descrizioni accurate delle dimensioni dei singoli polisomi, che appaiono come aggregati di ribosomi strettamente impacchettati.Un'analisi più approfondita di uno dei picchi ribosomiali mediante sezione trasversale rivela che l'altezza dei picchi ribosomiali è di circa 14 nanometri. Questo valore corrisponde a quanto osservato in precedenza per ribosomi e polisomi umani dopo essiccazione all'aria. Nell'immagine a destra, è stato utilizzato un macro per identificare la posizione dei ribosomi e contrassegnare ciascun ribosoma con un cerchio rosso.Utilizzando queste informazioni, è possibile analizzare la distribuzione di frequenza del numero di ribosomi per polisoma. Tale distribuzione sperimentale è stata interpolata con una curva gaussiana centrata a 5,8 ribosomi per polisoma, con una deviazione standard di 1,3. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica, dalla pulverizzazione del tessuto cerebrale all'acquisizione delle immagini di poliribosomi, può essere completata in meno di otto ore se eseguita correttamente.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di mantenere il campione sul ghiaccio e di utilizzare tamponi freddi per il deposito del campione sulla mica. Seguendo questo protocollo e utilizzando il plugin di ImageJ di un ricercatore per renderlo disponibile nel vostro articolo, è possibile contare con precisione il numero di ribosomi per polisoma. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica aprirà la strada alla comprensione della cinetica della formazione dei polisomi e all'identificazione dei cambiamenti nell'organizzazione dei polisomi in diverse condizioni cellulari o tissutali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere migliaia di immagini di polisomi per analizzarne e studiarne sistematicamente l'organizzazione.

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Ricerca

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Neuroscience

Neuroscienze

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

In questo video, dimostriamo la microscopia statica a forza atomica per visualizzare nucleosomi assemblati. Questa tecnica di imaging ad alta risoluzione consente lo studio della struttura del nucleosoma.

Microscopia statica a forza atomica per visualizzare e caratterizzare nucleosomi assemblati

Fonte: Lunelli, L., et. al. Scrutare i polisomi cerebrali con la microscopia a forza atomica. J. Vis. Exp.(2016). Questo video mostra l'imaging dei polisomi utilizzando la microscopia a forza atomica. Un foglio di mica rivestito di ioni nichel ancora l'RNA con i ribosomi attaccati. Il campione viene lavato, asciugato e montato sul tavolino del microscopio. La punta a sbalzo scansiona la superficie del campione, registrando le deflessioni laser per mappare la topologia. Il software viene...

 Imaging di polisomi isolati da un cervello di topo mediante microscopia a forza atomica

Qui, descriviamo un metodo per analizzare le modifiche l'apertura di traduzione dell'mRNA di cellule eucariotiche in risposta alle condizioni di stress. Questo metodo si basa sulla separazione velocità su gradienti di saccarosio di traduzione ribosomi da ribosomi non traslanti.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

In questo articolo viene descritto un metodo per studiare la struttura di un fotorecettore proteico utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Il PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) rivela dimeri proteici intatti su una superficie di mica.

Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà

Descriviamo le procedure dettagliate e le strategie per misurare le proprietà meccaniche e percorsi meccanici spiegamento di singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica. Mostriamo anche risultati rappresentativi come riferimento per la selezione e giustificazione delle registrazioni di buona singola proteina molecola.

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell'espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico senza utilizzare generatori di gradienti automatizzati o sistemi di frazionamento del gradiente.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

In questo articolo, presentiamo un protocollo per rilevare oligodendrociti caricati con microtubuli in un modello di tubulopatia attraverso un approccio di microscopia di seconda generazione armonica semplice e innovativo.

Ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale

Scopri l'imaging di polisomi cerebrali con microscopia a forza atomica senza fissazione o marcatura. Questo metodo consente analisi in condizioni fisiologiche per studiare l'organizzazione dei ribosomi.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

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