Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una pipeline dettagliata per la purificazione e la deposizione accurate di poliribosomi cerebrali su mica e di ottenere migliaia di immagini con risoluzione su scala nanometrica senza la necessità di pesanti analisi di post-elaborazione o ricostruzione 3D. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della traduzione e del controllo traduzionale, come la comprensione dell'impatto dell'organizzazione dei ribosomi all'interno dei polisomi durante il ricablaggio dell'espressione genica. I principali vantaggi di questa tecnica sono che non è richiesta la fissazione o la marcatura del campione e le misurazioni possono essere effettuate in condizioni quasi fisiologiche per identificare facilmente i ribosomi e i supporti di RNA nudo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'organizzazione del poliribosoma dei mammiferi, può essere applicato anche ad altri microrganismi, come lieviti, batteri e insetti, nonché allo stato che coinvolge controlli traduzionali dell'espressione genica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la manipolazione del campione polisomiale per l'assorbimento della mica e le fasi di lavaggio sono piuttosto complicate e richiedono capacità di manipolazione ed esperienza. A illustrare la procedura saranno Paola Bernabo e Lorenzo Lunelli.

Per iniziare, raccogliere e congelare il tessuto cerebrale come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi, estrarre il fazzoletto congelato dal congelatore e portarlo sul banco. Mettere il tessuto cerebrale congelato e l'azoto liquido in un mortaio pre-raffreddato e polverizzarlo con un pestello fino a formare una polvere.

Trasferire circa 25 milligrammi di polvere cerebrale in una provetta da microcentrifuga fredda e aggiungere immediatamente 0,8 millilitri di tampone di lisi. Pipettare la miscela su e giù 25 volte rapidamente per disgregare le cellule. Quindi, centrifugare la provetta a 12.000 x g per un minuto a quattro gradi Celsius per pellettare i detriti cellulari.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga e tenere la provetta in ghiaccio per 15 minuti. Quindi, centrifugare la provetta per cinque minuti per pellettare i nuclei e i mitocondri. Quindi, rimuovere con cura un millilitro dalla parte superiore di una sfumatura di saccarosio precedentemente preparata.

Sovrapporre il saccarosio goccia a goccia con il surnatante del lisato citosolico. Con il campione ora caricato sopra il gradiente, abbassare con cautela il tubo e un tubo di contrappeso nei secchi di un rotore a secchiello oscillante. Centrifugare il gradiente per 100 minuti.

Dopo l'ultracentrifugazione, lasciare le provette nei loro secchi per 20 minuti a quattro gradi Celsius, per consentire alla stabilizzazione del gradiente. Quindi, rimuovere con cautela il tubo del campione e montarlo sul dispositivo di raccolta di un sistema di frazionamento a gradiente di densità. Raccogli frazioni di un millilitro monitorando l'assorbanza degli acidi nucleici a 260 nanometri con un rivelatore di luce visibile UV e mettile su ghiaccio.

Successivamente, prepara aliquote da 30-40 microlitri delle frazioni di interesse e tienile in ghiaccio. Se i campioni non verranno utilizzati immediatamente, conservarli a 80 gradi Celsius e adottare misure per limitare il numero di cicli di congelamento-scongelamento. Per preparare i campioni per l'imaging AFM, coprire prima un foglio di mica lavato con 200 microlitri di solfato di nichel ii millimolare e incubare il foglio per tre minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere la soluzione, asciugare la superficie con aria compressa e posizionare la capsula di Petri sul ghiaccio. Successivamente, aggiungi delicatamente l'intera aliquota della frazione di interesse goccia a goccia sulla mica. Utilizzando una punta da 100 o 200 microlitri, distribuire il campione su tutta la superficie della mica e incubare il campione su ghiaccio per tre minuti.

Quindi, coprire il foglio di mica goccia a goccia con 200 microlitri di tampone freddo AFM e incubare il campione su ghiaccio per un'ora. Mantenere il campione a 40 gradi e utilizzare tampone freddo preparato in acqua priva di RNasi è importante per preservare l'organizzazione dei poliribosomi. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura il tampone e lavare la mica tre o quattro volte con 200 microlitri di tampone freddo AFM per rimuovere l'eccesso di saccarosio.

Quindi, lavare la mica tre volte con una soluzione di lavaggio fredda e scolare l'acqua in eccesso dalla mica usando la carta. La rimozione completa del saccarosio dai campioni assorbenti è fondamentale ora che hai reciso sia il ribosoma che l'RNA nudo nel polisoma. Lasciare asciugare il campione sotto la cappa chimica con la parte superiore della capsula di Petri parzialmente aperta.

Dopo due ore, chiudere la capsula di Petri. Il campione può ora essere conservato a temperatura ambiente. Attaccare il campione preparato al portacampione dell'AFM utilizzando del nastro biadesivo.

Quindi, inserire il portacampione nello stadio AFM secondo le istruzioni del produttore. Dopo la calibrazione, avvicinarsi al campione fino a quando la punta a sbalzo non si innesta sulla superficie. Seleziona un'area di scansione di due per due micron, una risoluzione di almeno 512 x 512 pixel, scegli la modalità di sottrazione dello sfondo in tempo reale e seleziona una scala Z di 20-25 nanometri.

Quindi, inizia l'acquisizione dell'immagine. Ispezionare l'immagine, cercando la presenza di oggetti rotondi caratterizzati da un'altezza compresa tra 10 e 15 nanometri quando si acquisiscono immagini in aria. Quindi, regolare il set point e i parametri di feedback fino a visualizzare gli oggetti appuntiti.

Lo sfondo dovrebbe apparire relativamente piatto in buoni campioni con oggetti alti da due a quattro nanometri. Una volta che l'immagine appare buona, acquisisci diverse scansioni di due micron per due in diverse aree del campione. Dopo la deposizione di aliquote di saccarosio sulla mica, l'AFM fornisce accurate descrizioni dimensionali di singoli polisomi che appaiono come gruppi di ribosomi strettamente impacchettati.

Dando un'occhiata più da vicino a uno dei picchi ribosomiali utilizzando l'analisi della sezione trasversale si scopre che l'altezza dei picchi ribosomiali è di circa 14 nanometri. Ciò corrisponde a quanto precedentemente osservato per i ribosomi e i polisomi umani dopo l'essiccazione all'aria. Nell'immagine a destra, è stata utilizzata una macro per identificare la posizione del ribosoma e contrassegnare ogni ribosoma con un cerchio rosso.

Utilizzando queste informazioni, è possibile analizzare la distribuzione di frequenza del numero di ribosomi per polisoma. Questa distribuzione sperimentale è stata dotata di una curva gaussiana centrata a 5,8 ribosomi per polisoma, con una deviazione standard di 1,3. Una volta padroneggiata, questa tecnica, dalla polverizzazione cerebrale all'acquisizione di immagini poliribosomiali, può essere eseguita in meno di otto ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di mantenere il campione su ghiaccio e di utilizzare tamponi freddi per la deposizione del campione sulla mica. Seguendo questa procedura e utilizzando il plug-in ImageJ di uno sviluppatore per renderlo disponibile nel documento, è possibile contare con precisione il numero di ribosomi per polisoma. Dopo ogni sviluppo, questa tecnica aprirà la strada alla comprensione della cinetica della formazione dei polisomi e all'identificazione dei cambiamenti nell'organizzazione dei polisomi e delle loro diverse condizioni cellulari o tissutali.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ottenere migliaia di immagini di polisomi per analizzare e studiare sistematicamente la loro organizzazione.