Creazione di Sub-50 Nm nanofluidic giunzioni in PDMS Microfluidic Chip tramite processo di auto-assemblaggio di particelle colloidale

Questo protocollo dimostra una nuova e semplice tecnica di auto-assemblaggio di nanoparticelle di silice colloidale per creare una giunzione nanofluidica tra due microcanali in polidimetilsilossano. La membrana a microsfere con una dimensione dei pori di circa 45 nanometri, che funge da membrana cationo-selettiva, può essere utilizzata per la concentrazione elettrocinetica di campioni di DNA e proteine. Panoramica: Nella prima fase, il dispositivo PDMS con nanotrappole viene fuso attraverso un processo di doppio stampaggio.

Dopo aver incollato al plasma il dispositivo su un substrato di vetro, le perle di silice funzionalizzate in superficie vengono iniettate nei microcanali per formare la membrana colloidale autoassemblante. Infine, una tensione viene applicata attraverso la membrana utilizzando un misuratore di sorgente e un divisore di tensione. La deplezione ionica e l'aumento della concentrazione sono osservati utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito, con una telecamera CCD.

Preparazione delle sospensioni di particelle colloidali di silice: A partire dalle perle di silice da 300 nanometri; stock di perline vortex per 30 secondi; prelevare 600 microlitri di sospensione in una provetta Eppendorf e centrifugare per un minuto a 2.600 g. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante. Risospendere le perle con 400 microlitri di tampone fosfato di sodio da un millimolare, per raggiungere una concentrazione di lavoro del 15%.

Vortice per raggiungere una sospensione omogenea. Ripetere gli stessi passaggi per preparare perle di silice a 500 nanometri. Per le perle di silice carbossilica da 500 nanometri, pesare 100 milligrammi in un tubo Falcon da 15 millilitri.

Quindi trasferire 9,8 millilitri di cloruro di sodio monomolare per risospendere le perle. Agitare energicamente il tubo. Capovolgere il tubo più volte per spostare le perline colpite sul fondo.

Per modificare la carica superficiale sulle perle, prepariamo due polielettroliti: PAH e PSS. Il PSS allo 0,9% viene preparato sciogliendo 180 milligrammi di PSS con 200 millilitri di cloruro di sodio monomolare. Lo 0,4% di IPA viene preparato condensando 300 microlitri della soluzione madre in 15 millilitri di cloruro di sodio monomolare.

Agitare entrambe le soluzioni per assicurarsi che siano completamente disciolte. Per depositare uno strato di IPA caricato positivamente, aggiungere 200 microlitri della soluzione di IPA alla sospensione del tallone. Agitare per un minuto e incubare la sospensione in un rotatore per un'ora a temperatura ambiente.

Per lavare via gli IPA non legati, centrifugare la sospensione a 1,801 g per un minuto, per far precipitare le perle. Rimuovere il surnatante. Pipettare da uno a due millilitri d'acqua nel tubo per rompere le perline.

Aggiungere i restanti otto millilitri di acqua e poi vortice. Ripetere la procedura di lavaggio altre quattro volte. Dopo il quinto lavaggio e la centrifugazione, scartare il surnatante e ripristinare le perle con 9,8 millilitri di cloruro di sodio monomolare.

Per depositare lo strato di PSS caricato negativamente, aggiungere 200 microlitri della soluzione di PSS alla sospensione del tallone. Agitare per un minuto e incubare la sospensione nel rotatore per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le perline cinque volte con acqua deionizzata come fatto per il rivestimento IPA.

Dopo l'ultimo lavaggio, scartare il surnatante e risospendere le perle con 650 microlitri di tampone fosfato di sodio millimolare allo 0,05%Tween 20. Trasferire la sospensione del tallone in una provetta Eppendorf. Per la preparazione delle perle di silice amminica a 500 nanometri, ripetere la stessa procedura per depositare un singolo strato di PSS caricato negativamente.

Fabbricazione del chip microfluidico PDMS: per fabbricare il master in silicio, prima rivestire un fotoresist sottile un micrometro a 4.000 giri/min su un wafer di silicio. Quindi utilizzare la litografia a proiezione e l'incisione ionica reattiva per creare nanocanali planari profondi 700 nanometri e larghi due micrometri come nanotrappole per le perline. Quindi rivestire il 2° strato di fotoresist a 2.000 giri/min ed eseguire un allineamento con le nanotrappole precedentemente modellate.

Aggiungere i microcanali tramite litografia a contatto e incisione ionica del silicio con reattività profonda. Per creare lo strato di rilascio, silanare il master di silicone in un barattolo sottovuoto con 50 microlitri di triclorosilano, per una notte. Per fondere lo stampo PDMS, mescolare la base PDMS con l'agente indurente in un rapporto 10:1.

Versare il composto sopra il master in silicone. Mettere il panetto con PDMS in un barattolo sottovuoto per eliminare le bolle d'aria e cuocerlo in forno a 70 gradi C per reticolare il PDMS. Dopo aver cotto per due ore, rimuovere con cura la lastra PDMS dal master in silicone.

Trattare la superficie con plasma per creare un legame permanente con un wafer di silicio vuoto. Attacca del nastro lungo il bordo per contrassegnare una linea di partizione per la successiva fase di fusione PDMS. Per creare uno strato distaccante, silanare lo stampo PDMS in un barattolo sottovuoto per una notte.

Gettare il PDMS sopra lo stampo PDMS e trasferirlo in un barattolo sottovuoto per il degasaggio. Quindi cuocerlo in forno. Staccare la lastra PDMS polimerizzata dallo stampo PDMS lungo la linea di partizione contrassegnata con nastro adesivo.

Tagliare con cura i dispositivi e praticare dei fori con un punzone per biopsia da 1,5 millimetri nei serbatoi. Dopo la pulizia della superficie con nastro adesivo e alcool isopropilico, incollare al plasma il dispositivo PDMS su un vetrino da microscopio da 25 mm x 75 millimetri. Immediatamente dopo l'incollaggio al plasma, iniettare 10 microlitri di sospensione negli ingressi quattro e sei dei canali di erogazione delle microsfere.

Dopo aver riempito i canali di erogazione delle perline, coprire tutti i serbatoi ad eccezione delle uscite uno e nove dei canali di erogazione delle perline. Asciugare il dispositivo all'aria per tre ore a temperatura ambiente e conservarlo a quattro gradi C prima dell'uso. Le micrografie del dispositivo mostrano le particelle colloidali assemblate all'interno dei canali di erogazione delle perle superiore e inferiore.

L'immagine SEM mostra particelle colloidali di silice autoassemblate a 300 nanometri intrappolate con gli array di nanotrappole, tra il campione e il canale tampone. Riempire gli ingressi tre e sette dei canali tampone con 10 microlitri di tampone fosfato di sodio millimolare. Riempire l'ingresso del canale del campione cinque con 10 microlitri di campione di DNA a 10 nanomolari.

Applicare una leggera pressione negativa con una punta di pipetta rovesciata su tutte le uscite per riempire i canali con le soluzioni senza bolle d'aria. Aggiungere 10 microlitri di tampone fosfato di sodio ai serbatoi due e otto e 10 microlitri di campione di DNA al serbatoio 10, per stabilizzare la pressione per cinque minuti. Esperimento per la concentrazione elettrocinetica del DNA: collegare il chip microfluidico con un divisore di tensione collegato a un misuratore di sorgente.

Inserire i fili PT nei serbatoi tre, sette, cinque e 10. Applicare tensione attraverso una giunzione nanofluidica. Per prima cosa applicare 30 volt sui serbatoi cinque e 10 e a terra sui serbatoi tre e sette.

Diminuire la tensione a 25 volt sul serbatoio 10 dopo circa 30 secondi. Risultati della preconcentrazione elettrocinetica: il canale microfluidico è riempito di DNA, con concentrazione iniziale a 10 nanomolari. Le micrografie time-lapse mostrano la formazione di una regione di deplezione ionica, entrambe le giunzioni colloidali nanofluidiche.

La regione di esaurimento degli ioni è stata avviata in 10 secondi. Un tappo di DNA concentrato è stato generato quando la tensione è stata applicata al canale del campione, mentre i canali tampone sono stati messi a terra. Le linee tratteggiate sono state utilizzate per evidenziare le pareti del canale.

Un fattore di concentrazione di circa 1.700 volte viene raggiunto entro 15 minuti utilizzando una membrana colloidale a 300 nanometri. L'intensità media della fluorescenza del DNA aumenta in funzione del tempo in un membrabe nanoporoso. Le linee tratteggiate rappresentano il livello del segnale per il DNA a 10 nanomolari, 17 micromolari, due micromolari e 10 micromolari.

Il tappo concentrato viene generato sulla membrana nanoporosa delle perle di silice da 300 nanometri; le perle di silice a 500 nanometri; le perle di ammina di silice da 500 nanometri, rivestite con un singolo strato di PSS; e le perle di carbossile di silice da 500 nanometri, rivestite con due strati di IPA e PSS. Conclusioni: Utilizzando la membrana di silice colloidale autoassemblata con una dimensione dei pori stimata di 45 nanometri, abbiamo dimostrato la polarizzazione della concentrazione ionica vicino alla giunzione nanofluidica e abbiamo concentrato un campione di DNA di 1700 volte entro 15 minuti. Rispetto ai nanocanali a base di silicio, il principale vantaggio della membrana colloidale autoassemblata è la possibilità di eseguire la funzionalizzazione della superficie completamente al di fuori del dispositivo microfluidico sigillato, in una fiala separata.

Riteniamo che questo approccio apra la possibilità di fabbricare rapidamente una piattaforma micro nanofluidica con pori di dimensioni facilmente regolabili, controllando la dimensione delle perle, la forza ionica o il valore del pH della soluzione tampone per studiare il trasporto ionico e molecolare nell'intervallo da 10 a 100 nanometri.