Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Ciao, sono Jersey. Ciao, mi chiamo Shabi e siamo entrambi ricercatori post-dottorato presso l'Imperial College di Londra, lavorando con il professor Andrew Di Melo e il dottor Josh Del su piattaforme di goccioline microfluidiche. Le piattaforme microfluidiche basate su goccioline sono candidate promettenti per la sperimentazione di una maggiore produttività perché possono essere generate a volumi molto elevati definiti con precisione e la frequenza di generazione può raggiungere diversi kiloper.

Inoltre, poiché la regione di interesse può essere incapsulata in compartimenti fino a pochi litri, sia la diafonia che la dispersione possono essere eliminate e i processi analitici possono essere cronometrati con maggiore precisione. Nel nostro gruppo, abbiamo già implementato con successo piattaforme di micro droplet per molte applicazioni. Ad esempio, la reazione a catena della polimerasi, la sintesi di nanoparticelle e il saggio di una singola cellula molecolare.

Le grandi quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi devono essere estratte, sfruttate e utilizzate in modo efficiente. A questo proposito, il metodo di rilevamento scelto dovrebbe essere corretto, fornire un'elevata sensibilità e bassi limiti di rilevamento, essere applicabile a una serie di specie molecolari, essere non distruttivo ed essere in grado di essere integrato con dispositivi microfluidici in modo semplice. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato una suite di strumenti e protocolli sperimentali che consentono l'estrazione di grandi quantità di informazioni fisiche da ambienti di piccolo volume e sono applicabili all'analisi di un'ampia gamma di fattori fisici, chimici e biologici.

In questo protocollo, presenteremo i metodi che vengono applicati al rilevamento di singole cellule e alla mappatura dei processi di miscelazione in Dropbox. I chip microfluidici sono tradizionalmente fabbricati in polidimetilSloane PGMS utilizzando metodi di fotolitografia. Questo processo dovrebbe essere eseguito in una camera bianca per ottenere canali microfluidici Spinco, SU otto 50 su un wafer di silicio morbido cuocere su una piastra calda a 65 gradi e 95 gradi per far evaporare il solvente e densificare il film dopo il raffreddamento, esporre il SU otto, resistere con radiazioni UV sotto l'apposita maschera, E poi cuocere la cialda a 65 gradi e 95 gradi dopo il raffreddamento.

Sviluppare le aree non esposte utilizzando la soluzione di sviluppo appropriata mentre si mescola. Utilizzare un solvente EC fresco per sciacquare il wafer e poi asciugarlo sotto gas per generare una superficie pulita. Trattare il wafer con lavaggi a base di esano e metanolo.

Inoltre, per completare il processo di fabbricazione master esate, far evaporare un agente grippante sulla superficie in un essiccante per 40 minuti. Per formare substrati microfluidici strutturati, mescoliamo S guard 1 8 4 in un rapporto di 10 a uno di reticolante in resina e lo tiriamo sopra il master. Degassare questo in un essiccante e polimerizzare il dispositivo a 65 gradi.

Tagliare il PDMS stagionato e staccarlo dal master. Creare fori di accesso per tubi fluidici utilizzando un punzone per biopsia. Polimerizzare un altro strato di PDMS per 20 minuti a 65 gradi.

Posizionare lo strato superiore preparato sullo strato inferiore e polimerizzare per una notte a 65 gradi. Sbucciare le patatine dalla capsula di Petri e tagliarle a dadini. Una volta che i chip sono stati fabbricati, sono pronti per essere utilizzati infondendo le soluzioni di interesse.

Riempire le siringhe con le soluzioni necessarie, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria in nessuna parte del tubo. Per la generazione di goccioline, vengono utilizzate due fasi. La fase acquosa dispersa contiene i reagenti di interesse.

La fase oleosa funge da tubo di adattamento in fase continua dello stesso diametro interno della siringa, le punte degli aghi su un'estremità agli aghi, il montaggio delle siringhe su una pompa a siringa e la definizione della portata di infusione desiderata. Per ogni fase, si raccomanda un rapporto minimo di portate acquose dell'olio di uno per evitare la bagnatura del PDMS da parte della fase acquosa, che porterebbe alla formazione instabile di goccioline. Collegare le altre estremità del tubo direttamente ai fori praticati nel substrato PDMS.

Per soluzioni più complesse, è possibile implementare anche silice, porte capillari o connettori. Collegare la porta di uscita del chip al tubo e dirigerlo in un collettore per la raccolta dei rifiuti o l'ulteriore elaborazione delle analisi. Una volta impostato, ci sono due configurazioni principali di microcanali per generare la focalizzazione del flusso di goccioline o un formato di giunzione a T come risultato delle forze pure che derivano dall'uso di queste geometrie per unire i due fluidi ammissibili e i successivi capillari che si sviluppano nell'interfaccia.

Si disperdono goccioline piccole come pochi femtolitri vengono generate spontaneamente. Una volta che le goccioline sono state generate, possono essere sondate utilizzando una configurazione ottica. Il sistema ottico è impostato con il seguente protocollo.

Utilizzare un microscopio confocale con capacità di posizionamento submicronico automatizzato e un laser che opera a una lunghezza d'onda che corrisponda all'assorbimento delle cadute di Fluor coinvolte. Per eccitarli, utilizzare un laser a impulsi che opera a velocità di ripetizione di diversi megahertz per l'imaging fluorescente a vita. Gli esperimenti sul catarro utilizzano specchi e ottiche per controllare l'altezza e la direzione del fascio.

Utilizzare uno specchio dicroico per riflettere il raggio laser nella lente dell'obiettivo. Se due laser vengono utilizzati contemporaneamente, è possibile installare uno specchio diic a doppia banda. Per consentire la riflessione dei due raggi laser, utilizzare un obiettivo per microscopio NA ad alta apertura numerica corretta all'infinito per portare la luce laser a una messa a fuoco stretta all'interno di un canale microfluidico.

Raccogliere la fluorescenza emessa dal campione all'interno del canale microfluidico, utilizzando lo stesso obiettivo ad alta NA e trasmessa attraverso lo stesso specchio dicroico. Rimuovere qualsiasi luce di eccitazione residua utilizzando un filtro di emissione a banda singola o doppia. Focalizzare l'emissione di fluorescenza su un foro stenopeico da 75 micrometri.

Utilizzando una lente convessa piana. Posizionare il foro stenopeico sul piano confocale dell'obiettivo del microscopio. Utilizzare un altro specchio dicroico per dividere il segnale fluorescente su due rivelatori.

Filtrare la fluorescenza riflessa dallo specchio dicroico con un filtro di emissione e focalizzarla con una lente convessa sul primo rivelatore. Per gli esperimenti che coinvolgono un fluorescente rosso secondario, filtrare la fluorescenza trasmessa dallo specchio diic con un altro filtro di emissione, e poi focalizzarla con un'altra lente convessa piana sul secondo rivelatore. Utilizzare fotodiodi a valanga per il rilevamento di fotoni di fluorescenza.

Per l'acquisizione dei dati a fluorescenza, è possibile accoppiare il segnale elettronico proveniente dal rivelatore a fotodiodo da valanga a un dispositivo DAQ multifunzione per la registrazione dei dati in esecuzione su un personal computer. Per gli esperimenti con catarro, utilizzare un laser a impulsi e collegare i rivelatori a una scheda PC TCS con conteggio di singoli fotoni correlato nel tempo in esecuzione su un PC separato. Questa scheda consente di ottenere i dati sulla durata della fluorescenza.

Utilizzando una metodologia TCS PC. Ogni fotone fluorescente rilevato è correlato a un impulso laser incidente e quindi a ogni fotone fluorescente emesso viene assegnato un tempo di ritardo. Questi dati possono essere adattati a una curva di decadimento esponenziale singola o multipla per ottenere una stima del tasso radiativo dei fluorofori.

Ora sappiamo che le cellule sono altamente eterogenee sia dal punto di vista biologico, fisico e chimico. Pertanto, idealmente, dovremmo analizzare ogni cellula alla volta. Tuttavia, i saggi dovrebbero essere eseguiti con una produttività più elevata in modo da poter raccogliere informazioni quantitative sufficienti per giungere a una conclusione affidabile e significativa.

Qui abbiamo un esempio di un incapsulamento di cellule di e coli in una singola gocciolina, in modo che così com'è possa essere eseguito. Usa il ceppo top 10 di e coli che è stato coltivato durante la notte. Per rilevare la vitalità delle cellule, utilizzare il cito nove e lo ioduro di propidio.

Entrambi i coloranti sono coloranti che interagiscono con il DNA e la loro intensità di fluorescenza aumenta di oltre 20 volte. Dopo il legame con il DNA, il citonove è un colorante fluorescente verde permeabile alla membrana e ioduro di propidio. Si tratta di un colorante fluorescente rosso, impermeabile alla membrana.

Pertanto, le cellule vive emettono fluorescenza in verde, mentre le cellule morte mostrano emissioni sia verdi che rosse. Qui possiamo vedere la generazione di goccioline e l'incapsulamento di una singola cellula con una giunzione a T. Questo video è stato registrato con una telecamera ad alta velocità, ma le goccioline possono essere generate a una velocità di migliaia al secondo.

Quando si incapsulano le cellule, è necessario assicurarsi che la coltura delle cellule sia diluita in modo che ci siano meno cellule rispetto alle goccioline generate, che alle cellule sia impedito di sedimentare, che può verificarsi nella siringa o nel tubo. Utilizzare un'ancoretta magnetica all'interno della siringa per mantenere le cellule distribuite uniformemente nella soluzione. Utilizzare un tubo molto sottile, 50 micrometri per collegare la siringa al microchip.

Ciò garantisce una portata elevata all'interno del tubo e quindi impedisce la sedimentazione delle celle. Ecco gli esempi tipici di conteggio delle foto in funzione del tempo per gli esperimenti basati su cellule. Per mappare i processi di miscelazione all'interno delle goccioline.

Le goccioline possono essere generate utilizzando due diversi fluoro four con tempi di vita diversi. All'interno di una gocciolina che scorre, viene generato un campo di flusso, che alla fine mescola le due soluzioni originariamente separate per migliorare il processo di miscelazione. La simmetria del campo di flusso può essere modificata utilizzando canali di avvolgimento.

Per sondare le goccioline, focalizzare il volume della sonda ottica a metà dell'altezza di un microcanale lungo il quale scorrono le goccioline, partendo da un lato del canale, eseguire ogni esperimento lungo l'intera larghezza del canale. A intervalli di un micrometro. Implementare un algoritmo per differenziare le singole esplosioni associate alle goccioline dal rumore di fondo della fase oleosa e per stabilire la durata di ciascuna esplosione.

Implementa un secondo algoritmo per estrarre i valori di ritardo, tempo e intensità lungo la lunghezza di ciascuna goccia alla particolare larghezza in cui è stato eseguito l'esperimento. Quindi utilizzare un algoritmo MLE di stima della massima verosimiglianza per valutare la durata della fluorescenza di ciascuna gocciolina nell'esperimento. La media dei valori di durata per tutte le goccioline nell'esperimento riduce l'errore finale del calcolo MLE.

Più goccioline vengono sondate, minore è l'errore una volta ottenuta una traiettoria di durata. Per ogni larghezza, combinare tutte le traiettorie in una mappa 2D. Poiché ogni valore di vita è associato a una particolare miscela dei due quattro della flora, è possibile ottenere una mappa di concentrazione o di miscelazione.

Abbiamo descritto la fabbricazione di un micro dispositivo e l'impostazione sperimentale e i protocolli associati per la formazione di micro goccioline e l'incapsulamento della regione e la rilevazione ottica del processo, le goccioline. I due esempi hanno selezionato la rilevazione di singole cellule in goccioline e la mappatura dei processi di miscelazione. All'interno della gocciolina che scorre rappresentano applicazioni comuni che sono attualmente oggetto di studio con la microfluidica delle goccioline.

Come illustrano gli esperimenti presentati, l'uso di droplet, le piattaforme microfluidiche presentano alcune caratteristiche interessanti come l'elevata produttività, che causano il confinamento perfetto e una maggiore riproducibilità. La grande quantità di informazioni prodotte e la massima velocità con cui queste informazioni vengono generate. L'uranio impoverito richiedeva l'uso di metodi di rilevamento rapidi con la massima risoluzione temporale spaziale se si voleva ottenere il massimo vantaggio da queste piattaforme miniaturizzate.

In questo caso, dimostriamo che ciò è possibile utilizzando tecniche spettroscopiche fluoroscopiche ad alta precisione.