Name: Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: Scopri i metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme microfluidiche a goccia. Queste tecniche consentono l'analisi ad alto throughput di singole cellule e il mapping dei processi di miscelazione con elevata sensibilità.

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Gli autori desiderano ringraziare per il sostegno delle seguenti consigli di ricerca e borse di studio: EPSRC, HFSP, National Research Foundation della Corea (Numero di Grant R11-2009-044-1002-0K20904000004-09A050000410).

<ol><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li>
<li>Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid%2FLiquid%2FGas+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li>
<li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplets%3A+A+sea+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li>
<li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li>
<li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+%CE%BCs+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li>
<li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li>
<li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li>
<li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto la fabbricazione di un dispositivo a microfluidi, un apparato sperimentale e protocolli associati per la formazione e l&#39;incapsulamento microdroplet reagente e la rilevazione ottica delle gocce elaborati. I due esempi selezionati (la rilevazione di singole cellule in goccioline e la mappatura dei processi di miscelazione all&#39;interno gocce che scorre) rappresentano applicazioni più comuni che sono attualmente in fase di studio con microfluidica goccia. Come gli esperimenti presentati illustrano l&#39;utilizzo di piattaforme goccia microfluidica presenti alcune caratteristiche interessanti, come ad esempio un throughput elevato, quasi perfetto isolamento, alta riproducibilità ... La grande quantità di dati prodotti e la rapidità con cui queste informazioni vengono generate, però, richiedono l&#39;uso di metodi di rilevamento veloce ad alta risoluzione spazio-temporale se il vantaggio è che si possono ottenere da queste piattaforme miniaturizzati. In questo caso si dimostra che questo èpossibile utilizzando tecniche di spettroscopia a fluorescenza ad alta precisione. In particolare, la tecnica di rilevazione FLIM (che fa uso di un laser pulsato con periodi di ripetizione breve come un ns pochi) rivela la capacità di ottenere informazioni molto velocemente dal rapido fluire gocce (circa 200 al secondo). In questo caso la risoluzione temporale degli eventi è stato rilevato fino a 1 ms. In termini di limiti di dimensioni delle gocce e la concentrazione, l&#39;uso di lenti più grandi apertura numerica e laser di potenza più grande sarebbe facilmente consentono la rilevazione delle concentrazioni nM in goccioline di soli 5 micron (i limiti di dimensioni delle gocce essere imposte dalle risoluzioni della fotolitografia processo di fabbricazione e della fase di posizionamento inferiori al micron). Gocce Microfluidic sono i candidati ideali per effettuare la sperimentazione su vasta scala con piccole quantità di reagenti, fino al singolo bersaglio / evento. Attuali limiti di questa tecnologia comporta la difficoltà di generare droplets da una varietà di grandi dimensioni (decine o centinaia) di diverse fonti in un high-throughput modo. Inoltre, la difficoltà di indirizzare e manipolare ogni singola goccia generato impone severe limitazioni alla applicabilità pratica di queste tecniche. Pertanto, questi temi sono al centro degli sforzi di ricerca importanti volti a sviluppare le necessarie soluzioni tecnologiche che permetteranno piattaforme goccia microfluidica per diventare un metodo di riferimento standard di ricerca e analisi in applicazioni ad elevato throughput.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Fluoresceina 5-isotiocianato (FITC) </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F3651 </td></tr><tr><td> Streptavidina-Alexa Fluor 488 </td><td> Reagente </td><td> Molecular Probes </td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 kit di silicone elastomero </td><td> Reagente </td><td> Premier Farnell UK LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td> auramina-O </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nm ad impulsi laser a diodi </td><td> Attrezzatura </td><td> PicoQuant </td><td> LDH-PC-485 </td></tr><tr><td> TCSPC Carta </td><td> Attrezzatura </td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td> specchio dicroico </td><td> Attrezzatura </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> z488rdc, </td></tr><tr><td> Microscopio obiettivo </td><td> Attrezzatura </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td> Avalanche fotodiodo </td><td> Attrezzatura </td><td> AQR-141, EG &amp; G, Perkin-Elmer). </td><td> AQR-141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> S34854 </td></tr><tr><td> Propidio ioduro </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td></tr><tr><td> Escherichia coli ceppo top 10 </td><td> Cellule </td><td> Invitrogen </td><td> C4040-10 </td></tr></tbody></table>

metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Lo sviluppo di piattaforme microfluidica per l&#39;esecuzione di chimica e la biologia è in gran parte stata guidata da una serie di potenziali benefici che accompagnano la miniaturizzazione del sistema. I vantaggi includono la capacità di elaborare in modo efficiente nano-to femoto litri volumi di campione, l&#39;integrazione facile di componenti funzionali, una predisposizione intrinseca verso la grande scala multiplexing, maggiore velocità di analisi, un miglior controllo e ridotta impronta strumentale 1. Negli ultimi anni molto interesse si è concentrato sullo sviluppo di goccia-based (o flusso segmentato) sistemi microfluidica e il loro potenziale come piattaforme in high-throughput di sperimentazione. 2-4 Qui l&#39;acqua in olio emulsioni sono fatti per formarsi spontaneamente nei canali microfluidica a seguito di instabilità capillare tra le due fasi immiscibili. Importante, microgocce di volumi ben definiti e composizioni possono essere generati a frequenzedi parecchi kHz. Inoltre, incapsulando i reagenti di interesse all&#39;interno di compartimenti stagni separati da una fase continua immiscibili, sia del campione cross-talk e la dispersione (diffusione e Taylor-based) può essere eliminato, che porta alla minima contaminazione incrociata e la possibilità di processi in tempo di analisi con grande accuratezza. Inoltre, poiché non vi è alcun contatto tra il contenuto delle goccioline e le pareti del canale (che sono bagnate dalla fase continua), l&#39;assorbimento e la perdita di reagenti sui muri canale è impedito. Una volta che le goccioline di questo tipo sono state prodotte ed elaborate, è necessario estrarre le informazioni richieste analitiche. In questo senso il metodo di rilevazione di scelta deve essere rapida, forniscono ad alta sensibilità e bassi limiti di rilevabilità, applicabile a una vasta gamma di specie molecolari, essere non distruttiva ed essere in grado di essere integrato con dispositivi microfluidici in maniera facile. Per rispondere a questa esigenza abbiamo sviluppato comeuite di strumenti sperimentali e protocolli che permettono l&#39;estrazione di grandi quantità di informazioni fotofisiche da piccoli volumi degli ambienti, e sono applicabili per l&#39;analisi di una vasta gamma di parametri fisici, chimici e biologici. Qui due esempi di questi metodi sono presentati e applicati alla rilevazione di singole cellule e la mappatura dei processi di miscelazione all&#39;interno picolitri volumi goccioline. Riportiamo l&#39;intero processo di fabbricazione di chip sperimentali, tra cui microfluidica, la configurazione ottica e il processo di generazione delle gocce e la rilevazione.

Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l&#39;integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all&#39;interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Lo sviluppo di piattaforme microfluidiche per l'esecuzione di processi chimici e biologici è stato in gran parte guidato da una serie di potenziali vantaggi che...

Ciao, sono Jersey. Ciao, mi chiamo Shabi e siamo entrambi ricercatori postdottorandi all'Imperial College di Londra, dove lavoriamo con il Professor Andrew Di Melo e il Dottor Josh Del su piattaforme microfluidiche a goccioline. Le piattaforme microfluidiche basate su goccioline sono candidati promettenti per sperimentazioni ad alto rendimento, poiché possono essere generate con volumi molto precisi e ben definiti e, per quanto riguarda la loro produzione, la frequenza di generazione può raggiungere diversi kilohertz.Inoltre, poiché la regione di interesse può essere incapsulata in compartimenti anche di pochi litri, sia il crosstalk che la dispersione possono essere eliminati, e i processi analitici possono essere temporizzati con maggiore precisione. Nel nostro gruppo, abbiamo già implementato con successo piattaforme a goccioline microfluidiche per numerose applicazioni. Ad esempio, reazione a catena della polimerasi, sintesi di nanoparticelle e saggio cellulare a livello di singola molecola.Le grandi quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi devono essere estratte, sfruttate e utilizzate in modo efficiente. A questo riguardo, il metodo di rilevamento prescelto dovrebbe essere appropriato, fornire un'elevata sensibilità e bassi limiti di rilevamento, essere applicabile a un'ampia gamma di specie molecolari, essere non distruttivo e poter essere integrato facilmente con dispositivi microfluidici. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato un insieme di strumenti sperimentali e protocolli che consentono l'estrazione di grandi quantità di informazioni fisiche da ambienti a piccolo volume, ed è applicabile all'analisi di un'ampia gamma di parametri fisici, chimici e biologici.In questo protocollo, presenteremo due metodi applicati al rilevamento di singole cellule e alla mappatura dei processi di miscelazione in Dropbox. I chip microfluidici sono tradizionalmente realizzati in poli dimetil silossano PGMS mediante tecniche di fotolitografia. Questo processo deve essere eseguito in una struttura di sala bianca per ottenere canali microfluidici Spinco, SU 8 50 su un wafer di silicio; cottura soft su una piastra riscaldante a 65 gradi e 95 gradi per evaporare il solvente e densificare il film; dopo il raffreddamento, esporre la resist SU 8 alla radiazione UV sotto la maschera appropriata, quindi cuocere nuovamente il wafer a 65 gradi e 95 gradi dopo il raffreddamento.Sviluppare le aree non esposte utilizzando la soluzione sviluppatrice appropriata sotto agitazione. Risciacquare la wafer con solvente EC fresco e quindi asciugarla sotto flusso di gas per ottenere una superficie pulita. Trattare la wafer con lavaggi a base di esano e metanolo.Inoltre, per completare il processo di fabbricazione del master, evaporare un agente di adesione sulla superficie in un essiccatore per 40 minuti. Per formare substrati microfluidici strutturati, mescoliamo S guard 1 8 4 in un rapporto di 10 a 1 tra resina e crosslinker, quindi stendiamo questa miscela sul master. Degasare il tutto in un essiccatore e polimerizzare il dispositivo a 65 gradi.Tagliare il PDMS polimerizzato e staccarlo dal master. Creare fori di accesso per i tubi fluidici utilizzando un punch per biopsia. Polimerizzare un altro strato di PDMS per 20 minuti a 65 gradi.Posizionare lo strato superiore preparato sullo strato inferiore e polimerizzare tutta la notte a 65 gradi. Staccare le chip dalla piastra di Petri e tagliarle a cubetti. Una volta fabbricate, le chip sono pronte per essere utilizzate, infondendo le soluzioni di interesse.Riempire le siringhe con le soluzioni richieste, assicurandosi che non rimangano bolle d'aria in nessuna parte dei tubi. Per la generazione di goccioline, si utilizzano due fasi. La fase dispersa acquosa contiene i reagenti di interesse.La fase oleosa agisce come fase continua; collegare tubi con lo stesso diametro interno delle punte degli aghi delle siringhe a un'estremità degli aghi, montare le siringhe su una pompa per siringhe e impostare la velocità di flusso desiderata per l'infusione. Per ciascuna fase, si raccomanda un rapporto minimo tra le velocità di flusso oleoso e acquoso pari a uno, per evitare il bagnamento del PDMS da parte della fase acquosa, il che porterebbe a una formazione instabile delle goccioline. Collegare le altre estremità dei tubi direttamente ai fori praticati nel substrato in PDMS.Per soluzioni più complesse, possono essere utilizzate anche silice, porte capillari o connettori. Collegare la porta di uscita del chip al tubo e indirizzare verso un collettore per la raccolta dei rifiuti o per ulteriori analisi. Una volta completata questa configurazione, esistono due principali configurazioni di microcanali per generare goccioline: il flusso focalizzato o il formato a giunzione a T, risultanti dalle forze di taglio che si sviluppano utilizzando queste geometrie per unire i due fluidi ammissibili e dai successivi effetti capillari che si instaurano all'interfaccia.Si generano spontaneamente goccioline di un oh con volumi ridotti a pochi femtolitri. Una volta che le goccioline vengono generate, possono essere analizzate mediante un apparato ottico. Il sistema ottico è configurato secondo il seguente protocollo.Utilizzare un microscopio confocale dotato di capacità di posizionamento automatizzato submicrometrico e di un laser che opera a una lunghezza d'onda corrispondente all'assorbimento dei fluorocromi coinvolti. Per eccitarli, utilizzare un laser a impulsi che opera a frequenze di ripetizione di diversi megahertz per l'immagine del tempo di vita della fluorescenza. Gli esperimenti con flemma utilizzano specchi deviatori del fascio e ottiche per controllare l'altezza e la direzione del fascio.Utilizzare uno specchio dicromatico per riflettere il fascio laser nell'obiettivo. Se si utilizzano due laser contemporaneamente, è possibile installare uno specchio dicromatico a doppia banda. Per consentire la riflessione dei due fasci laser, utilizzare un obiettivo microscopico con apertura numerica NA elevata e correzione all'infinito, in modo da focalizzare strettamente la luce laser all'interno di un canale microfluidico.Raccogliere la fluorescenza emessa dal campione all'interno del canale microfluidico, utilizzando lo stesso obiettivo ad alta apertura numerica e facendola passare attraverso lo stesso specchio dicromatico. Rimuovere qualsiasi luce residua di eccitazione mediante un filtro di emissione a banda singola o doppia. Focalizzare l'emissione di fluorescenza su un foro stenopeico di 75 micrometri.Utilizzando una lente piano-convessa. Posizionare il pinhole nel piano confocale dell'obiettivo del microscopio. Utilizzare un altro specchio dicromatico per dividere il segnale fluorescente su due rivelatori.Filtrare la fluorescenza riflessa dallo specchio dicromatico mediante un filtro di emissione e focalizzarla con una lente piano-convessa sul primo rivelatore. Per esperimenti che coinvolgono un fluorocromo rosso secondario, filtrare la fluorescenza trasmessa dallo specchio dicromatico con un altro filtro di emissione, quindi focalizzarla con un'altra lente piano-convessa sul secondo rivelatore. Utilizzare fotodiodi a valanga per la rilevazione dei fotoni di fluorescenza.Per l'acquisizione dei dati di fluorescenza, collegare il segnale elettronico proveniente dal rivelatore a fotodiodo a valanga a un dispositivo DAQ multifunzione per la registrazione dei dati, in esecuzione su un computer personale. Per gli esperimenti con flegma, utilizzare un laser a impulsi e collegare i rivelatori a una scheda TCS PC per il conteggio dei singoli fotoni in correlazione temporale, in esecuzione su un PC separato. Questa scheda consente di ottenere i dati relativi al tempo di vita della fluorescenza.Utilizzando una metodologia TCS PC. Ogni fotone fluorescente rilevato viene correlato a un impulso laser incidente e quindi a ogni fotone fluorescente emesso viene assegnato un tempo di ritardo. Questi dati possono essere adattati a una curva di decadimento esponenziale singola o multipla per ottenere una stima della velocità radiativa dei fluorocromi.Ora sappiamo che le cellule sono altamente eterogenee da un punto di vista biologico, fisico e chimico. Pertanto, idealmente, dovremmo analizzare ogni cellula singolarmente. Tuttavia, i saggi devono essere eseguiti con un'elevata produttività in modo da raccogliere informazioni quantitative sufficienti per giungere a conclusioni affidabili e significative.Qui abbiamo un esempio di incapsulamento di cellule di e coli in una singola goccia, in modo che possa essere eseguito. Utilizzare il ceppo e coli top 10 coltivato durante la notte. Per rilevare la vitalità delle cellule, usare citina nove e ioduro di propidio.Entrambi i coloranti sono coloranti intercalanti del DNA e la loro intensità di fluorescenza aumenta di oltre 20 volte. Una volta legati al DNA, la citocina è un colorante fluorescente verde permeabile alla membrana e l'ioduro di propidio è un colorante fluorescente rosso impermeabile alla membrana.Pertanto, le cellule vive fluorescono in verde, mentre le cellule morte mostrano emissioni sia verdi che rosse. Qui possiamo osservare la generazione di goccioline e l'incapsulamento di una singola cellula mediante un giunto a T. Questo video è stato registrato con una telecamera ad alta velocità, ma le goccioline possono essere generate a una velocità di migliaia al secondo.Quando si incapsulano cellule, è necessario assicurarsi che la coltura cellulare sia diluita in modo che il numero di cellule sia inferiore al numero di goccioline generate e che le cellule siano impedite a sedimentare, fenomeno che può verificarsi nella siringa o nei tubi. Utilizzare una barretta magnetica all'interno della siringa per mantenere le cellule uniformemente distribuite nella soluzione. Usare tubi molto sottili, di 50 micrometri, per collegare la siringa al microchip.Questo garantisce una velocità di flusso elevata all'interno del tubo e quindi impedisce alle cellule di sedimentare. Di seguito sono riportati esempi tipici di conteggi di fotoni in funzione del tempo per esperimenti basati su cellule. Per mappare i processi di mescolamento all'interno delle goccioline.Le goccioline possono essere generate utilizzando due diversi fluoro fours con tempi di vita differenti. All'interno di una gocciolina in movimento, si genera un campo di flusso, che alla fine mescola le due soluzioni inizialmente separate per potenziare il processo di miscelazione. La simmetria del campo di flusso può essere modificata utilizzando canali serpentinati.Per analizzare le goccioline, focalizzare il volume della sonda ottica a metà dell'altezza di un microcanale lungo il quale scorrono le goccioline, partendo da un lato del canale ed eseguendo ogni esperimento lungo tutta la larghezza del canale, a intervalli di un micrometro. Implementare un algoritmo per differenziare i singoli picchi associati alle goccioline dal rumore di fondo della fase oleosa e per determinare la durata di ciascun picco.Implementare un secondo algoritmo per estrarre i valori di tempo di ritardo e intensità lungo la lunghezza di ciascuna goccia alla larghezza specifica in cui è stato condotto l'esperimento. Successivamente, utilizzare un algoritmo di stima della massima verosimiglianza (MLE) per valutare il tempo di vita fluorescente di ogni goccia nell'esperimento. Mediando i valori di tempo di vita di tutte le gocce presenti nell'esperimento, si riduce l'errore finale del calcolo MLE.Più gocce vengono analizzate, minore sarà l'errore una volta ottenuta una traiettoria di vita. Per ogni larghezza, combinare tutte le traiettorie in una mappa 2D. Poiché a ogni valore di vita è associata una particolare miscela delle due flora fours, può essere così ottenuta una mappa di concentrazione o di miscelazione.È stata descritta la fabbricazione di un microdispositivo e dell'apparato sperimentale, nonché i protocolli associati per la formazione di microgocce, l'incapsulamento in regioni specifiche e il rilevamento ottico del processo e delle gocce stesse. I due esempi selezionati, il rilevamento di singole cellule all'interno delle gocce e la mappatura dei processi di miscelazione, rappresentano applicazioni comuni attualmente oggetto di studio nella microfluidica a gocce.Come illustrano gli esperimenti presentati, le piattaforme a microfluidica a goccioline presentano alcune caratteristiche interessanti, come l'elevata produttività, il perfetto confinamento e una riproducibilità superiore. La grande quantità di informazioni prodotta e la velocità elevata con cui queste informazioni vengono generate richiedono l'uso di metodi di rilevamento rapidi con la massima risoluzione spaziotemporale, al fine di sfruttare appieno i vantaggi offerti da queste piattaforme miniaturizzate.In questo caso, dimostriamo che ciò è possibile utilizzando tecniche spettroscopiche fluoro altamente precise.

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