Name: Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Impara a preparare vescicole giganti con microsfere incapsulate mediante centrifugazione di emulsione acqua-in-olio. Questo metodo semplificato utilizza DOPC e Texas Red DHPE per creare modelli cellulari artificiali in biologia sintetica.

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Ringraziamo Tomoko Yamaguchi per disegnare l&#39;immagine schematica della figura 1. Questo studio è stato sostenuto dal progetto Okazaki ORION dell&#39;Istituto Okazaki for Integrative Bioscience della dell&#39;Ufficio Nazionale Istituti di Scienze Naturali (NINS); dal Centro Progetto Astrobiologia (senza AB281010.) di NINS; da un Grant-in-Aid per la ricerca scientifica su aree innovative (ordinamento dinamico di sistemi biomolecolari per la creazione di funzioni integrate) dalla Società giapponese per la promozione della Scienza (JSP) (senza 25.102.008.); da un Grant-in-Aid per giovani scienziati (B) (a KK, non 15K17850.) da JSPS; andby un Grant-in-Aid per la ricerca di attività Start-Up (a YN, n. 15H06653) da JSPS. Ulteriore supporto è stato fornito da una sovvenzione da parte del Noguchi Institute, una borsa di studio dalla Fondazione Kao per le Arti e delle Scienze, e di una sovvenzione da parte del Kurita Water e Fondazione Ambiente.

1. Preparazione del GVs dal W / O Emulsione Centrifugazione Method <ol><li> Preparare una soluzione stock di 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DOPC, 25 mm) e una soluzione stock di Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- SN -glycero-3-fosfoetanolamina, trietilammonio sale (Texas Red DHPE, 0,20 mm) in cloroformio e memorizzare i soluzioni di riserva a -20 ° C. </li><li> Preparare una soluzione di olio. <ol><li> Forma un film lipidico sulla superficie interna di una fiala di vetro da 5 ml evaporando una miscela della soluzione DOPC magazzino (51,0 microlitri e la soluzione madre Texas Red DHPE (19,2 ml) sotto flusso di gas di azoto. </li><li> Incubare la pellicola a pressione ridotta durante la notte e quindi aggiungere 1,0 ml di paraffina liquida (0,86-0,89 g / cm 3) al flaconcino. Avvolgere la fiala in foglio di alluminio e incubare a 80 ° CO / N a riposo. Le concentrazioni finali di DOPC e Texas Red DHPE sono 1,3 e 3,8 x 10 - 3 mM, Rispettivamente, e il DOPC: rapporto molare Texas Red DHPE è 100: 0.3. </li></ol></li><li> Preparare la dispersione acquosa interna. <ol><li> In un microtubo 1,5 ml con coperchio, mescolare 237,5 ml di una dispersione di 1,0 micron microsfere nonfluorescent (2,5 vol%) e 12,5 ml di una dispersione di 1,0 micron microsfere fluorescenti (2,5 vol%); questo corrisponde ad un 95: 5 (v / v) rapporto nonfluorescent a microsfere fluorescenti. </li><li> Aggiungere 64 mg di saccarosio seguita da 125 ml di soluzione tampone tris (TBS, 1 m) e 875 ml di acqua deionizzata. La frazione di volume finale di microsfere è di 0,5% in volume, e le concentrazioni finali di Tris-HCl (pH 7,5) e saccarosio sono 0,1 e 0,15 M, rispettivamente. </li><li> Vortex provetta per 30 sec e poi sonicazione per 10 min. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione acquosa esterna. <ol><li> Dopo la preparazione di 10 ml di una soluzione tamponata con Tris (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M Glucose) nella stessa procedura mezzi acquosi interna, posizionare 1 ml della soluzione in 1,5 ml provetta con coperchio. Vortex provetta per 30 sec e poi sonicazione per 10 min. </li></ol></li><li> Preparare aw / o emulsione contenente microsfere. <ol><li> Mescolare 1 ml della soluzione in olio (paraffina liquida contenente DOPC e Texas Red DHPE) con 300 ml di soluzione acquosa interna in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Emulsionare i due componenti in provetta utilizzando un omogeneizzatore meccanico (un agitatore con lame che ruotano ad alta velocità) azionato a 10.000 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Precipitare la GVs. <ol><li> strato delicatamente 300 microlitri della w / o emulsione sulla superficie superiore di 1 ml della soluzione acquosa esterna a 4 ° C in una provetta da 1,5 ml con coperchio. Raffreddare la provetta per 10 minuti a 4 ° C. </li></ol></li><li> Raccogliere le GVs. <ol><li> Subito dopo il raffreddamento della provetta,centrifugare a 18.000 x g per 30 min. Ottenere i GVs precipitati perforando il fondo della provetta con una puntina da disegno e la raccolta di una gocciolina in una sterile 1,5 ml provetta. </li><li> Diluire il GV precipitato droplet 10-100 volte in volume con la soluzione acquosa esterna se i GVs ottenuti sono ottenuti in quantità sufficiente per fare osservazione difficile. </li></ol></li></ol> 2. Microscopia osservazione di GVs <ol><li> Preparare campioni di microscopia. <ol><li> Inserire un camera di incubazione adesivo per reazione a catena della polimerasi situ e ibridazione (dimensioni camera 9 mm x 9 mm x 0,3 mm di spessore) sopra un vetro di copertura microscopio. </li><li> Usando una micropipetta, deposito 25 microlitri della diluito precipitati GVs sull&#39;area campione e immediatamente posto un altro vetro di copertura (spessore in circa 0,15 mm) sulla parte superiore della camera di incubazione. </li></ol></li><li> Registra contras interferenza differenzialeimmagini t microscopia dei GVs. <ol><li> Per registrare immagini microscopia delle vescicole con un microscopio (10X, 20X, 40X e obiettivi) equipaggiato con una lampada alogena 12V100WHAL-L. </li></ol></li><li> Condurre fluorescenza osservazioni al microscopio. <ol><li> Inserire U-FBNA e U-FMCHE unità specchio a fluorescenza nel microscopio. Montare le unità con 470-495 nm e 565-585 nm di eccitazione filtri, rispettivamente, e con filtri di emissione che trasmettono 510-550 nm e 600-690 nm luce, rispettivamente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

<html> I pesi specifici del mezzo di dispersione acquosa interna e la soluzione acquosa esterna devono essere scelti con attenzione. Per l&#39;emulsione w / o precipitazione nella soluzione acquosa esterna durante la centrifugazione, il peso specifico del mezzo di dispersione acquosa interna deve essere maggiore di quella della soluzione acquosa esterna. Abbiamo cercato di preparare GVs utilizzano soluzioni interne ed esterne senza zuccheri, ma ottenuto non GVs in queste condizioni, perché la soluzione acquosa interna non ha abbastanza massa attraversare l&#39;interferenza tra le due fasi. Se vi è una grande differenza di pressione osmotica tra le due soluzioni, GVs che precipitano nella soluzione acquosa esterna può ridursi o rottura. Pertanto, la pressione osmotica dentro e fuori le GVs deve essere uguale. Per realizzare ciò, abbiamo utilizzato saccarosio come soluto in dispersione acquosa interna e glucosio come un soluto nella soluzione acquosa esterna; entrambi gli zuccheri erano alla stessa concentrazione. sia il saless = &quot;xref&quot;&gt; 22 e zucchero 23, 35, 38 sono stati utilizzati per tali scopi, ma lo zucchero è normalmente impiegate perché è meno tossico e più solubile del sale. Tuttavia, se viene aggiunto troppo zucchero, i GVs possono venire a contatto con la parte inferiore del vetro di copertura e collasso. Ci sono diverse strategie per evitare questo. Una strategia è di ridurre la differenza peso specifico tra le soluzioni acquose interno ed esterno in modo che i GVs precipitano in condizioni blande; in particolare, il surnatante della dispersione GV precipitato può essere scambiata con una soluzione che è identica alla soluzione acquosa interna per ridurre la possibilità di rottura vescicolare per adesione al vetro di copertura a seguito di galleggiamento. Un&#39;altra strategia è quella dello strato preliminare sia di vetrini con un sottile film lipidico 29. La preparazione adeguata e incubazione dell&#39;emulsione vengonoimportante. Abbiamo usato paraffina liquida per preparare la soluzione di olio. Oli minerali 26, 31, dodecano 21, 33, e squalene 33, 39 sono spesso usati come oli solventi. Poiché questi materiali vari in peso specifico, viscosità e tensione superficiale, un diverso numero di vescicole formano anche quando vengono utilizzate le stesse condizioni di centrifugazione 33. Per ottenere le vescicole con le proprietà di destinazione, è essenziale ottimizzare le gravità e viscosità delle soluzioni acquose interne ed esterne specifiche, nonché la preparazione acceleration.For centrifuga della fase olio, incubazione deve avvenire ad alta temperatura e in un luogo asciutto ambiente come incubatore o un disidratatore. In questo studio, abbiamo riscaldato la paraffina liquida a 80 ° C per sciogliere completamente i lipidi molecules.In Inoltre, l&#39;emulsione dovrebbemeglio solo se necessario e dovrebbe essere immediatamente sottoposto a centrifugazione perché instabile subito dopo che è preparato e il w / o goccioline facilmente fondono l&#39;uno all&#39;altro. L&#39;emulsione può essere preparato in grandi quantità mediante sonicazione, vortex, o maschiatura. Tuttavia, utilizzando un omogeneizzatore consente la rapida preparazione di grandi quantità di emulsione e più facile emulsione in olio ad alta viscosità. E &#39;anche importante che l&#39;emulsione essere stratificato sulla soluzione acquosa esterna delicatamente e rapidamente e poi raffreddata a 4 ° C. Per ridurre il tempo tra la emulsione e centrifugazione, il sistema della soluzione acquosa olio esterno può essere prechilled prima l&#39;emulsione è stratificato su di esso, e l&#39;intero sistema può essere quindi centrifugata immediately.If la torbidità bianca appare più velocemente o più lentamente rispetto al solito, il meccanico omogeneizzatore deve essere accuratamente lavato per rimuovere detergenti. Inoltre, prima emulsione, soluzione in olio, soluzione acquosa interna, ed emulsionante devono essere returned a temperatura ambiente. La corretta accelerazione centrifuga è importante. Per centrifugazione a 18.000 x g, siamo stati in grado di preparare GVs con un unico materiale interno incapsulato ad alta concentrazione. Quando è richiesta l&#39;incapsulamento di materiali diversi, è preferibile ridurre l&#39;accelerazione centrifuga. Ad esempio, un sistema di assemblaggio actina incapsulamento sette composti è stato ottenuto con centrifugazione a meno di 350 x g 35. Nei casi in cui la centrifugazione è indesiderabile, GVs può essere ottenuto regolando la concentrazione di zuccheri o per precipitazione l&#39;emulsione sotto l&#39;influenza della propria massa 38, 40, 41. Il metodo qui riportate ha due limiti importanti. Uno è che le molecole di olio di paraffina (, in questo caso) può essere solubilizzati nella membrana GV, come è stato rilevato dalla Weitgruppo z 21. Quando l&#39;inserimento di una proteina di membrana nella membrana GV si desidera, gli effetti delle molecole di olio coesistenti sulla proteina devono essere considerati. L&#39;altra limitazione è la variazione della frazione di volume. In questo studio, abbiamo stimato che le frazioni di volume di microsfere nelle GVs variava 4-30% in volume; le frazioni di volume non erano identici alla frazione di volume della soluzione acquosa interna utilizzati per la preparazione GV. Anche se siamo stati in grado di incapsulare microsfere nelle GVs ad una frazione di volume sufficiente per l&#39;osservazione al microscopio, questo metodo non è adatto per la preparazione di GVs con una distribuzione frazione di volume uniforme. E &#39;stato riportato che la distribuzione delle microsfere frazioni volumetriche cambia durante la centrifugazione 34. Il metodo di emulsione centrifugazione w / o viene comunemente utilizzato per la formazione di GVs contenenti materiali incapsulati. Tuttavia, pochi studi hanno descritto la priparazione di GVs incapsulamento materiali microscala 34, 42. Recentemente, robot molecolari contenenti un dispositivo DNA incapsulato o un dispositivo molecolare sono stati costruiti 43, 44. GVs con scomparti sono la prima scelta per questo tipo di applicazioni; Pertanto, le tecniche, come la nostra, che potrebbero essere utilizzati per l&#39;incapsulamento microsfere magnetiche e microsfere con diversi funzionalizzazione superficiale si può aspettare di essere utile 44.

<html> L&#39;approccio di biologia costruttiva, o sintetico è una strada interessante per esplorare il confine tra vita e materia non vivente. Poiché la cellula è l&#39;unità minima richiesta per la vita come noi oggi lo intendiamo, vari ricercatori hanno tentato di costruire cellule artificiali da semplici, prodotti chimici ben compresi in modo che i fenomeni che si verificano all&#39;interno di tali cellule artificiali possono essere studiati, con l&#39;obiettivo finale di chiarire le origini della vita e lo studio delle funzioni fondamentali delle cellule viventi 1, 2, 3. In particolare, vescicole 4, che sono microcompartments sferiche fatte di molecole anfifiliche e possono incapsulare molecole biologiche come proteine 5, 6 e DNA 7, 8, 9,lass = &quot;xref&quot;&gt; 10, sono spesso stati utilizzati come modelli di membrane biologiche. Vescicole possono essere classificati come piccole (definito come avente un diametro &lt;100 nm), grande (diametro &lt;1 um), o gigante (diametro&gt; 1 micron). vescicole giganti (GVS) sono stati ampiamente studiati, perché sono simili alle cellule viventi in termini di dimensioni, forma e struttura. A causa delle dimensioni del GVs, cambiamenti morfologici nelle membrane GV possono facilmente osservare in tempo reale al microscopio ottico. Diversi metodi per la preparazione GVs sono stati riportati 11, compreso il metodo idratazione 12, 13, il metodo di congelamento-scongelamento 14, il metodo electroformation 15, 16, e il metodo dispositivo fluidico 17, 18. Tuttavia, incapsulamento proteine ​​e altri MACROMolecules in GVs ad alte concentrazioni mediante questi metodi è difficile. In particolare, è estremamente difficile per incapsulare materiali biologici in quantità sufficiente (20-30% vol) per simulare l&#39;ambiente affollato all&#39;interno delle cellule 19, 20. Per formare GVs istantaneamente, Weitz e colleghi ha istituito un acqua-in-olio (w / o) metodo di emulsione centrifugazione 21, 22. Questo metodo ha cinque caratteristiche importanti. In primo luogo, perché GVs preparati mediante questo metodo hanno bassa lamellarity 23, 24, le membrane sono così sottili che possono essere deformati facilmente. GV deformazione della membrana indotta da FtsZ (una proteina divisione cellulare batterica), tubulina, e altre macromolecole è stata studiata 25, 26, 27, 28, e abbiamo osservato polyhe<html> dron simile deformazione delle membrane GV indotti da incapsulamento di microsfere 29, 30. In secondo luogo, proteine di membrana possono essere inseriti nella membrana vescicolare con questo metodo, anche se con difficoltà 31. Ad esempio, il gruppo Yomo usato questo metodo per studiare la sintesi in vitro e l&#39;attività formano pori della proteina di membrana α-emolisina 32. In terzo luogo, è possibile generare GVs asimmetriche in cui i componenti lipidici delle foglioline interni ed esterni sono differenti 22. Ad esempio, Whittenton et al. GVs asimmetriche generate con lipidi cationici nel volantino interno per incapsulare polinucleotidi carica negativa, e con lipidi neutri sul foglietto esterno per diminuire la tossicità e non specifici assorbimento cellulare 33. In quarto luogo, la frazione concentrazione e volume delle sostanze all&#39;interno delle GVs può essere relativamente elevatos = &quot;xref&quot;&gt; 28, 34. In quinto luogo, diversi tipi di materiali possono essere incapsulati 35. Ad esempio, Nishimura et al. incapsulato un sistema di trascrizione-traduzione in vitro in GVs e utilizzato il sistema per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) all&#39;interno del GVs 36. Questi cinque caratteristiche rendono w / o emulsione centrifugazione un metodo indispensabile per la generazione di cellule GVs-imitando. Nel lavoro precedente, GVs generati mediante centrifugazione sono stati raccolti mediante una siringa dotata di una lunga 16 ago G inossidabile contenente alcune della soluzione acquosa finale 22. Nelle mani dei tecnici inesperti, questo metodo di raccolta potrebbe facilmente provocare la contaminazione della GV con una parte dell&#39;olio. In questo studio, abbiamo utilizzato il protocollo di emulsione centrifugazione w / o sviluppato dal gruppo Yomo 23, 37,in cui GVs precipitati vengono raccolti attraverso un foro aperto sul fondo della provetta in cui vengono preparati. Abbiamo preparato GVs incapsulamento 1.0 micron microsfere, che sono di dimensioni simili a organelli intracellulari. L&#39;uso di microsfere permesso di stimare la concentrazione calcolando la frazione di volume. Creazione di un metodo per la preparazione di GVs in cui i materiali sono densamente imballati è un passo importante per la creazione di cellule artificiali. Per confermare l&#39;utilità del nostro protocollo di vari tipi di materiali interni, abbiamo anche dimostrato che GFP e un piccolo idrosolubile molecola fluorescente (uranine) possono essere incapsulati nei GVs.

<table><tbody><tr><td>REAGENTI:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Molecola di membrana vescicolare</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-diexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina, sale di trietilammonio (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7,5)</td><td>Nippon Gene Co.</td><td>318-90225</td><td>Soluzione tampone</td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>Per soluzione acquosa esterna</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>Per soluzione acquosa interna</td></tr><tr><td>Microsfere di carbossilato poliperlato 1.0 &; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>Non fluorescente, 2R = 1,0 &micro; m</td></tr><tr><td>Microsfere di carbossilato di fluoresbrite YG 1.0 &; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Fluorescente, 2R = 1,0 &micro; m</td></tr><tr><td>Microsfere di carbossilato di fluoresbrite YG 0,10 &; m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>Fluorescente, 2R = 0,10 &micro; m</td></tr><tr><td>Sale sodico di fluoresceina (uranina)</td><td>Sigma Aldrich Japan</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP standard (ricombinante)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EQUIPMENT: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Rotore centrifuga: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Handy microomogeneizzatore</td></tr><tr><td>Albero generatore</td><td>Microtec Co.</td><td>Accessorio per omogeneizzatore</td> <td>NS-4</td></tr><tr><td>Camere di incubazione Frame-Seal per in situ PCR e ibridazione</td><td>Laboratori Bio-Rad</td><td>SLF0201</td><td>Volume della camera di ibridazione: 25 &; L Dimensioni della camera: 9 & volte; 9 &volte; </td></tr><tr><td>Camere di incubazione Frame-Seal da 0,3 mm per in situ PCR e ibridazione</td><td>Laboratori Bio-Rad</td><td>SLF0601</td><td>Volume della camera di ibridazione: 65 &; L&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Dimensioni della camera: 15 & 15 &volte; </td></tr><tr><td>Pipetta Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td> da 0,3 mm <td>per liquidi viscosi. Abbiamo misurato la paraffina liquida usando questo.</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Unità specchio</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FBNA</td><td>Filtro di eccitazione: 470 - 495 nm Filtro di emissione: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Unità specchio</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FMCHE</td><td>Filtro di eccitazione: 565 - 585 nm Filtro di emissione: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

preparazione di giganti vescicole encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

La biologia costruttiva e l&#39;approccio biologia sintetica per creare la vita artificiale coinvolgono il gruppo bottom-up di materiali biologici o non biologici. Tali approcci hanno ricevuto una notevole attenzione nella ricerca sul confine tra la vita e la materia non vivente e sono stati utilizzati per la costruzione di cellule artificiali nel corso degli ultimi due decenni. In particolare, Giant vescicole (GVs) sono state spesso usate come le membrane delle cellule artificiali. In questo articolo, si descrive la preparazione di GVs incapsulamento microsfere altamente imballato come un modello di cellule contenenti biomolecole altamente condensati. Le GVs sono stati preparati mediante un metodo semplice un&#39;emulsione centrifugazione acqua-in-olio. In particolare, un omogeneizzatore è stato usato per emulsionare una soluzione acquosa contenente i materiali da incapsulati e un olio contenente fosfolipidi disciolti, e l&#39;emulsione risultante è stato stratificato con attenzione sulla superficie di un&#39;altra soluzione acquosa. Il sistema stratificato è stato poi centrifugato to generare i GVs. Questo metodo potente è stato utilizzato per incapsulare materiali che vanno da piccole molecole a microsfere.

Il metodo di emulsione centrifugazione w / o è illustrata fotograficamente e schematicamente in figura 1. L&#39;immagine schematica nella figura 1 suggerisce che il determinante più importante del successo di questo metodo è che il peso specifico della soluzione acquosa interna deve essere maggiore di quella della soluzione acquosa esterna, in modo che i GVs precipiteranno durante la centrifugazione. Inoltre, la formazione di un monostrato lipidico all&#39;interfaccia w / o richiede che il sistema sia raffreddato per 10 minuti dopo l&#39;emulsione è stratificato sulla soluzione acquosa esterna. Poiché il modulo GVs mediante trasferimento di goccioline di emulsione attraverso l&#39;interfaccia w / o, le pressioni osmotiche negli strati acquosi interni ed esterni devono essere uguali. Come esperimento di controllo, noi GVs anche preparati non contenenti microsfere mediante processo mostrato nella figura 1 e passo 1.3, tranne che la soluzione acquosa interna erapreparato senza microsfere. Raccolta delle GVs precipitati dopo centrifugazione è mostrato in Figura 2. Oltre alla fase semitrasparente al fondo della provetta, abbiamo anche osservato un bianco, fase intermedia torbida nella soluzione acquosa esterna (Figura 2a). Questa fase intermedia era ricca di aggregazioni di microsfere e olio, mentre la fase di fondo conteneva le GVs. Pertanto, dopo aver forato il fondo della provetta con una puntina (figura 2b), abbiamo raccolto solo la prima goccia (figura 2c), che conteneva enormi quantità di GVs. È importante assicurarsi che non più di due gocce sono raccolti; eventuali gocce supplementari possono contenere aggregazioni di microsfere e lipidi, che si tradurrà in una minore densità di GVs. La dispersione vescicolare ottenuta spesso conteneva materiali incapsulati al di fuori dei GVs perché i GVs often rottura durante la centrifugazione. Per ottenere solo GVs, un metodo di ordinamento come la dialisi, gel filtrazione, o cella di fluorescenza-attivato ordinamento deve essere scelto, a causa delle dimensioni dei materiali Encapsulating. Se necessario per lo scopo per il quale le GVs precipitati devono essere utilizzati, essi possono essere diluiti con la soluzione acquosa esterna. In alcuni casi, la fase intermedia esteso al fondo della provetta, suggerendo che eventuali vescicole che formavano erano tenuti insieme dall&#39;olio. Abbiamo ottenuto interferenza microscopia e microscopia a fluorescenza immagini differenziali delle GVs senza microsfere (figura 3a, 3b) e con microsfere (Figura 3c -3 f). In linea con le precedenti relazioni 23, 37, GVs con bassa lamellarity erano formati da nostro protocollo. Lipidi coniugati con Texas Red DHPE, che emette FLUORES rossescenza, sono stati utilizzati in modo che la formazione di vescicole potrebbe essere un contatto diretto con la visualizzazione della membrana sottile. Dei 160 GVs che abbiamo ottenuto, 55 microsfere incapsulati e 105 erano vuote, dando un rapporto di incapsulamento del 34%. Abbiamo determinato la frazione di volume (φ, vol%) di microsfere nelle GVs mediante il seguente metodo. Poiché ogni GV contiene decine a diverse centinaia di microsfere, contando tutte le microsfere al microscopio ottico è impegnativo. Pertanto, abbiamo mescolato i nonfluorescent 1.0 micron microsfere con una piccola quantità di microsfere fluorescenti, che sono stati conteggiati manualmente al microscopio a fluorescenza. Il numero totale (N) di microsfere incapsulati stato calcolato moltiplicando il numero (n) di microsfere fluorescenti contati manualmente 20 (basato sull&#39;originale 95: 5 [v / v] rapporto nonfluorescent a microsfere fluorescenti). Il valore di66; è stato quindi stimato Nv 100 / V, dove V è il volume delle microsfere e V è il volume del singolo GV. Si noti che la stima di N da n dà luogo ad errori di conteggio, e questi errori devono essere prese in considerazione nel calcolo φ. Il valore φ è stato stimato da N, che è stato direttamente calcolato come 20 n, e questo a sua volta portato alla probabilità che Phi rappresenta in modo accurato il vero valore è &lt;50%. Infatti, N fluttua in una certa misura circa 20 n, quindi abbiamo bisogno di considerare come 20 (n ± i), dove i è l&#39;errore n. I Abbiamo stimato in modo che una probabilità di n ± i potrebbe essere superiore al 50% ottenuto sulla base di una distribuzione di Poisson. Abbiamo stimato i, che a sua volta ha permesso di calcolare 20 (n ± i) e valori di66; che comprendeva errori di conteggio per GVs con diametri di 10 e 15 micron (Tabella 1). Secondo questa procedura, la frazione di volume delle microsfere nel GV mostrato in figura 3c è stata stimata essere di 11 ± 3% vol. La precisione della frazione volume calcolato era 10-30%. I nostri risultati indicano che abbiamo incapsulato con successo 1 micron microsfere in GVs ad una frazione ad alto volume. Siamo stati anche in grado di incapsulare altri materiali in 100 moli% DOPC GVs utilizzando la stessa soluzione acquosa esterno e lo stesso protocollo (Figura 4). In particolare, GVs contenenti 0,1 micron microsfere sono stati preparati da una soluzione tamponata con Tris contenente 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M di saccarosio, e 0,5% in volume microsfere fluorescenti mediante protocollo descritti per GVs microsfere contenenti 1,0-micron ( Figura 4a). Seguendo il protocollo descritto above, DOPC GVs contenente GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M di saccarosio, e 100 mg / ml GFP; Figura 4b) e GVs contenenti uranine (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M di saccarosio, e 30 micron uranine; figura 4c) sono stati anche preparati. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> n </td><td> N </td><td> φ (10 micron di diametro) </td><td> φ (15 micron di diametro) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6.0 ± 2.0 </td><td> 1.8 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8.0 ± 2.0 </td><td> 2.4 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3.0 ± 0.6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3.6 ± 1.2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0,9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> una Errori sono stati determinati come descritto nel testo; n = numero di microsfere contati manualmente; N = numero totale di microsfere incapsulati. </td></tr></tbody></table> Tabella 1: numero e al volume frazioni (φ, vol%) di microsfere a. una Errori sono stati determinati come descritto nel testo; n = numero di microsfere contati manualmente; N = numero totale di microsfere incapsulati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> Figura 1: mandata<html> arte e schematica Rappresentazione di O emulsione centrifugazione Metodo W /. (A) soluzione olio costituito DOPC e Texas Red DHPE (100: rapporto 0,3 molare) in paraffina liquida. (B) dispersione acquosa interna composta di saccarosio e microsfere in tampone Tris-HCl. (C) soluzione acquosa esterno costituito da glucosio in tampone Tris-HCl. (D) Miscela di 1 ml di soluzione di olio e 300 ml di dispersione acquosa interna. (E) emulsionificazione con un omogeneizzatore (10.000 rpm, 2 min). (F) Il w / o emulsione. (G) stratificazione di 300 ml di emulsione su 1 ml di soluzione acquosa esterna. (H) precipitato GVs subito dopo la centrifugazione. (I) Rappresentazione schematica del principio del metodo dell&#39;emulsione centrifugazione w / o. La freccia nera indica la direzione di accelerazione centrifuga..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> Figura 2: Piercing della provetta. (A) precipitato GVs subito dopo centrifugazione (illustrato anche in figura 1 ora). L&#39;ellisse rosso indica la goccia della dispersione GV precipitato. (B) Piercing della provetta con una puntina da disegno. Il pellet contenente le GVs è stato ottenuto forando la provetta vicino al fondo con una puntina da disegno e raccogliendo le goccioline dal foro. (C) gocciolina dei GVs precipitati (indicate dalla freccia gialla) dispersione diluita con soluzione acquosa esterna. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3: Microscopia Immagini di GVs. (A) immagine microscopio a contrasto di interferenza differenziale di GV, senza microsfere. Il diametro di GV era di circa 10 micron. Barra di scala = 10 micron. Immagine di microscopia (b) fluorescenza di una GV senza microsfere. La fluorescenza rossa è stata emessa da Texas Red DHPE. (C) l&#39;immagine differenziale microscopio a contrasto di interferenza di un GV contenente microsfere. (D) microscopia a fluorescenza immagine di 1,0 micron microsfere (microsfere YG carbossilati) all&#39;interno di un GV. Il numero di microsfere fluorescenti contati (n) era 6. Abbiamo stimato gli errori (i = 2) basati sulla distribuzione di Poisson. Poi abbiamo stimato il numero totale di microsfere interne (N = 20 (n ± i)) era di 120 ± 40. È stato calcolato che laGV conteneva 1,0 micron microsfere ad una frazione di volume (φ = Nv 100 / V) di circa 11 ± 3% vol, dove v è il volume delle microsfere e V è il volume dei GVs. (E) microscopia a fluorescenza immagine di una membrana GV. La fluorescenza rossa è stata emessa da Texas Red DHPE. (F) l&#39;immagine delle immagini in pannelli D ed E unite. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> Figura 4: interferenza differenziale contrasto e microscopia a fluorescenza Immagini di GVs con differenti materiali incapsulati. microscopia differenziale contrasto interferenziale (in alto) e microscopia a fluorescenza (in basso) di immaginiGVs contenenti (a) 0,1 micron microsfere, (b) GFP, e (c) uranine. Barre di scala = 10 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Le vescicole giganti contenenti componenti altamente impacchettati di dimensioni micrometriche sono utili modelli cellulari. Il metodo di centrifugazione dell'emulsione acqua-in-olio è uno strumento semplice e potente per la preparazione di vescicole giganti con materiali incapsulati.

Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

L'obiettivo generale di questo metodo di centrifugazione di un'emulsione olio-su-acqua è preparare facilmente un vesicolo gigante in strato sottile. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia sintetica, come la creazione di una cellula artificiale basata su un vesicolo gigante. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione madre di DOPC 25 millimolare e una soluzione madre di Texas Red DHPE 0,2 millimolare in cloroformio.Successivamente, formare un film lipidico sulla superficie interna di un vial di vetro da cinque millilitri evaporando una miscela delle soluzioni stock di DOPC e Texas Red DHPE sotto flusso di gas azoto. Dopo aver incubato il film sotto vuoto per tutta la notte, aggiungere un millilitro di paraffina liquida al vial. Avvolgere il vial nella carta d'alluminio e incubare la miscela a 80 gradi Celsius per tutta la notte.In un microtubo da un millilitro e mezzo con coperchio, mescolare 237,5 microlitri di microsfere non fluorescenti da un micrometro e 12,5 microlitri di microsfere fluorescenti da un micrometro. Aggiungere ora 64 milligrammi di saccarosio, seguiti da 125 microlitri di soluzione tampone Tris uno molare e da 875 microlitri di acqua deionizzata nel microtubo. Vortexare la miscela per 30 secondi, quindi sottoporla a sonificazione per 10 minuti.Dopo aver preparato 10 millilitri di una soluzione tampone al Tris, versare un millilitro in una microprovetta da 1,5 millilitri con coperchio. Una volta che la soluzione è stata vortexata e sottoposta a sonica, mescolare un millilitro della soluzione oleosa con 300 microlitri della soluzione acquosa interna in una microprovetta da 1,5 millilitri. Emulsionare i due componenti nella microprovetta utilizzando un omogeneizzatore meccanico funzionante a 10.000 giri al minuto per due minuti a temperatura ambiente.Successivamente, stratificare delicatamente 300 microlitri dell'emulsione olio-in-acqua sulla superficie superiore di un millilitro della soluzione acquosa esterna a quattro gradi Celsius in un microtubo da un punto cinque millilitri con coperchio. Immediatamente dopo aver raffreddato il microtubo per 10 minuti, centrifugare la miscela a 18.000 ×g per 30 minuti. Al termine, recuperare le vescicole giganti (GV) precipitate forando il fondo del microtubo con un fermaglio da ufficio e raccogliendo una goccia in un microtubo sterile da un punto cinque millilitri.Posizionare una camera adesiva per l'incubazione destinata alla reazione a catena della polimerasi NC due e all'ibridazione sopra un vetrino coprioggetto per microscopio. Utilizzando una micropipetta, depositare 25 microlitri della sospensione diluita di GV nell'area del campione e posizionare immediatamente sopra la camera di incubazione un vetrino coprioggetto spesso zero virgola uno cinque millimetri. Dopo aver acquisito le immagini microscopiche delle vescicole, eseguire la microscopia a fluorescenza inserendo innanzitutto gli unità ottiche a specchio per fluorescenza UFBNA e UFMCHE nel microscopio.Quindi montare sulle unità i filtri di eccitazione e i filtri di emissione per l'analisi. Il fattore più importante per il successo del metodo acqua-in-olio è che la densità relativa della soluzione acquosa interna deve essere maggiore rispetto a quella della soluzione acquosa esterna, in modo che le GV precipitino durante la centrifugazione. L'analisi mediante microscopia a contrasto di interferenza differenziale e microscopia a fluorescenza delle GV in assenza e in presenza di microsfere ha confermato che si formano GV con bassa lamellarità.Dei 160 GV ottenuti, 55 contenevano microsfere e 105 erano vuoti, con un rapporto di incapsulamento del 34%. La frazione volumetrica delle microsfere nei GV è stata stimata intorno all'11 ± 3 percento in volume e la precisione della frazione volumetrica calcolata era del 10-30%. L'incapsulamento di altri materiali all'interno di GV costituiti da DOPC al 100 mole percento, utilizzando la stessa soluzione acquosa esterna e lo stesso protocollo, è stato efficace, come dimostrato dalla microscopia a interferenza differenziale e dalla microscopia a fluorescenza. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche, come la citometria a flusso, al fine di rispondere ad ulteriori quesiti, ad esempio la chiarificazione della cellula modellata.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare vescicole giganti con materiali incapsulati.

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