Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

L'obiettivo generale di questo metodo di centrifugazione dell'emulsione acqua-in-olio è quello di preparare facilmente una vescicola gigante a strato sottile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia sintetica, come la creazione di una cellula artificiale basata su una vescicola gigante. Per iniziare questa procedura, preparare una soluzione madre da 25 millimolari di DOPC e una soluzione madre da due millimolari di punto zero di DHPE rosso Texas in cloroformio.

Quindi, formare un film lipidico sulla superficie interna di una fiala di vetro da cinque millilitri facendo evaporare una miscela di DOPC e soluzioni madre di DHPE rosso del Texas sotto il flusso di azoto gassoso. Dopo aver incubato il film a pressione ridotta per una notte, aggiungere un millilitro di paraffina liquida al flaconcino. Avvolgere la fiala in un foglio di alluminio e incubare la miscela a 80 gradi Celsius durante la notte.

In una microprovetta con coperchio da cinque millilitri mescolare 237 microsfere non fluorescenti da cinque microlitri e microsfere fluorescenti da 12 microlitri e microsfere fluorescenti da 12 microlitri da un micrometro. Ora aggiungi 64 milligrammi di saccarosio seguiti da 125 microlitri di soluzione tamponata Tris molare e 875 microlitri di acqua deionizzata al microtubo. Agitare la miscela per 30 secondi, quindi sonicare per 10 minuti.

Dopo la preparazione di 10 millilitri di una soluzione tamponata Tris, porre un millilitro in una microprovetta con coperchio da cinque millilitri. Una volta che la soluzione è stata agitata e sonicata, mescolare un millilitro della soluzione oleosa con 300 microlitri della soluzione acquosa interna in una microprovetta da cinque millilitri. Emulsionare i due componenti nella microprovetta utilizzando un omogeneizzatore meccanico azionato a 10.000 giri/min per due minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, stratificare delicatamente 300 microlitri di emulsione acqua-in-olio sulla superficie superiore di un millilitro di soluzione acquosa esterna a quattro gradi Celsius in un microtubo con coperchio da cinque millilitri. Subito dopo aver raffreddato la microprovetta per 10 minuti, centrifugare la miscela a 18.000 volte G per 30 minuti. Al termine, ottenere le vescicole giganti precipitate o GV perforando il fondo della microprovetta con una puntina e raccogliendo una goccia in una microprovetta sterilizzata da cinque millilitri.

Posizionare una camera di incubazione adesiva per la reazione a catena della polimerasi NC due e l'ibridazione sopra un vetro di copertura del microscopio. Utilizzando una micropipetta, depositare 25 microlitri di GV precipitato diluito sull'area del campione e posizionare immediatamente un vetro di copertura dello spessore di cinque millimetri sopra la camera di incubazione. Dopo aver registrato le immagini al microscopio delle vescicole, eseguire la microscopia a fluorescenza inserendo prima le unità a specchio a fluorescenza UFBNA e UFMCHE nel microscopio.

Quindi dotare le unità di filtri di eccitazione e filtri di emissione per l'analisi. Il fattore determinante più importante per il successo del metodo acqua-in-olio è che il peso specifico della soluzione acquosa interna deve essere maggiore di quello della soluzione acquosa esterna, in modo che i GV precipitino durante la centrifugazione. La microscopia ad interferenza differenziale e la microscopia a fluorescenza dei GV senza microsfere e con microsfere hanno confermato la formazione di GV a bassa lamellarità.

Dei 160 GV ottenuti, 55 microsfere incapsulate e 105 erano vuote, con un rapporto di incapsulamento del 34%. La frazione di volume delle microsfere nei GV è stata stimata essere di circa l'11 più o meno il tre percento di volume e la precisione della frazione di volume calcolata era dal 10 al 30% L'incapsulamento di altri materiali in GV DOPC al 100 percento molare utilizzando la stessa soluzione acquosa esterna e lo stesso protocollo ha avuto successo, come dimostrato dalla microscopia a interferenza differenziale e dalla microscopia a fluorescenza. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria a flusso per rispondere a ulteriori domande come la delucidazione della cellula modellata.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare vescicole giganti con materiali incapsulati.