Name: High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Scopri un metodo microarray ad alto rendimento per identificare polimeri sintetici che riducono l'adesione batterica sui dispositivi medici. Questa tecnica consente lo screening simultaneo di centinaia di materiali.

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Gli autori ringraziano EASTBIO (l'East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership finanziato dal BBSRC) (S. V.) e il Medical Research Council (P.J.G) per il finanziamento.

1. Preparazione di vetrini rivestiti Agarose NOTA: prima di fabbricare i microchip polimero, vetrini aminoalkylsilane rivestite sono rivestiti con agarosio IB per ridurre al minimo non specifici sfondo vincolanti e consentire la valutazione dei polimeri che si legano o respingono batteri 6. Rivestimento silano facilita il legame di agarosio alle diapositive. <ol><li> Portare a 2% (w / v) di agarosio IB in acqua distillata in una bottiglia da 250 ml. </li><li> Dopo tappatura la bottiglia in modo impreciso, riscaldare la sospensione in un forno a microonde in 30 periodi sec fino alla dissoluzione. Assicurarsi che il tappo non è ben chiuso per evitare ogni potenziale accumulo di pressione fino. Rimuovere la bottiglia regolarmente e miscelare delicatamente. </li><li> Assicurarsi che il solido si è sciolto e la soluzione è limpida. Versare questa soluzione di agarosio in un becher da 100 ml, e posto in un bagno d&#39;acqua a 65 ° C per mantenere una soluzione liquida. </li><li> Immergere i vetrini rivestiti di silano nella soluzione di agarosio, assicurando rivestimento uniforme, e wipe il retro del vetrino con carta velina. </li><li> Essiccare i vetrini, con il lato rivestito up, in un ambiente privo di polvere (ad esempio, all&#39;interno di un armadio o fumi cappa) per un minimo di 24 ore. </li><li> Confermare un rivestimento uniforme mediante ispezione visiva. Rivestimento può essere facilmente valutata respirando sul vetrino - condensa si formerà sulle regioni non rivestiti. Solo vetrini rivestiti interamente e in modo uniforme devono essere utilizzati per la stampa di microarray. </li></ol> 2. Preparazione di Polymer Solutions per la stampa <ol><li> Preparare soluzioni (1% w / v) di una selezione di polimeri preformati costituiti da poliacrilati, poliacrilammidi e poliuretani a N -methylpyrrolidone (NMP) in fiale di vetro. (Preparare 1 ml di ciascun polimero). Vortex finché il polimero è completamente dissolto. Sintesi di polimeri è descritta altrove 6. </li><li> Usando una micro-pipetta, riempire ogni pozzetto di una piastra 384 pozzetto con soluzione polimerica 25 ml, garantendo che non vi è alcuna conta croceminazione e ogni pozzetto contiene un polimero unico. Utilizzare NMP come controllo negativo in almeno 2 pozzi. Registrare l&#39;identità di soluzione polimerica in ciascun bene su un file di modello piatto o foglio di calcolo bene. </li></ol> 3. Stampa polimeri Microarrays mediante un contatto stampante NOTA: La stampa del microarray è stata eseguita utilizzando una stampante contatto. Le istruzioni specifiche per quanto riguarda la stampa di microarray polimero sono riportati di seguito. Per le linee guida generali su come utilizzare le raccomandazioni di stampa e di sicurezza, seguire il manuale utente del produttore. Anche se usiamo una stampante contatto, un idoneo dispositivo di stampaggio manuale potrebbe anche essere usato. <ol><li> Come consigliato nel manuale utente della stampante, creare una routine (vedi punto 3.3) che permette la stampa di 384 liquidi (le soluzioni polimeriche o NMP) in quadruplicates, utilizzando una testa microarraying 32-pin (organizzato come 8 righe e 4 colonne). </li><li> Stampa 1.536 punti disposti come 48 righe e 32 colonne. Programmare la routine di stampare in 12 seziones, cioè., 32 soluzioni alla volta, in modo che la stampante può essere fermato dopo la stampa di ogni sezione per consentire la pulizia di spilli. </li><li> Per creare una routine di stampa: <ol><li> Apri il programma e tra le opzioni disponibili scegliere &#39;Crea una nuova routine&#39;. Selezionare il &#39;Descrizione&#39; scheda per i dettagli di ingresso dell&#39;esperimento. Selezionare la scheda &#39;capo&#39; e scegliere &#39;32 pin testa microarraying &#39;. </li><li> Selezionare la scheda &#39;Source&#39; e scegliere il portatarga (Portatarga fonte (1x5)), targhetta (piatto 384 x 6.000), le piastre totali (1) e l&#39;ordine fonte (da colonne). </li><li> Nella scheda &#39;disegno Slide&#39;, scegliere &#39;3x1&#39; &#39;scivolo&#39; e scegliere arraying da &#39;Numero di campo&#39;. Quindi selezionare &#39;modello arraying&#39;. Input &#39;vista Spot&#39; come &#39;Layout&#39; e &#39;le dimensioni del modello&#39; come &#39;count Row&#39; (6), &#39;count colonna&#39; (8), &#39;passo Row&#39; (750) e &#39;passo colonna&#39; (560). Scegli una sezione per la stampa abetit. </li><li> Nella ingresso scheda &#39;Layout Slide&#39; il numero di diapositive utilizzata per la stampa. Selezionare la scheda &#39;Stampa&#39; per inserire i parametri di stampa (numero di francobolli per inchiostrazione: 1, numero di francobolli per spot: 5, tempo di stampaggio: 200 msec, tempo di inchiostrazione: 100 msec). NOTA: Una routine è stato creato per la stampa di 384 liquidi (le soluzioni polimeriche o NMP) in quadruplicates, utilizzando una testa microarraying 32-pin (organizzato come 8 righe e 4 colonne). In totale la routine deve stampare 1.536 punti disposti come 48 righe e 32 colonne con un passo di fila di 750 micron e il passo della colonna di 560 micron. </li></ol></li><li> Porre i vetrini agarosio rivestite sulla piattaforma e garantire una buona tenuta di vuoto per tenere i vetrini in posizione. </li><li> Regolare la testina di stampa in modo che tutti i perni sono alla stessa altezza. Controlla questo abbassando manualmente la testa su un vetrino e confermando che i perni salgono contemporaneamente. Se ci sono delle discrepanze con l&#39;altezza, regolare utilizzando il sleeve sul perno verso l&#39;alto o verso il basso. </li><li> Posizionare la piastra bene sul portatarga con l&#39;orientamento corretto, vale a dire., Ben A1 è in alto a destra del titolare e garantire la piastra ben viene fissata saldamente. </li><li> Utilizzando il regolatore in altezza, garantire che l&#39;altezza del supporto piastra è tale che quando la raccolta delle soluzioni polimeriche, i perni non toccare il fondo dei pozzetti. NOTA: Questo è importante per avvistamento polimero uniforme e anche per evitare fuoriuscite di soluzioni polimeriche nei pozzetti adiacenti, causando così la contaminazione incrociata. </li><li> Selezionare la scheda &#39;Start&#39; e scegliere il &#39;tipo Run&#39; &#39;Normale&#39;. Fare clic su &#39;Run&#39;, e confermare che slitta, pozzetti, ecc, sono in posizione quando richiesto. </li><li> Stampa 1 sezione alla volta (32 soluzioni alla volta; 12 sezioni), consentendo la pulizia dei perni tra le sezioni. Pulire i perni accuratamente con un tovagliolo di carta imbevuto di acetone, seguita da carta velina a secco per garantire i perni sono completamente asciutti. </li><li> Al termine della stampa dei microarray, metterli in un portavetrini e asciugare durante la notte in un vuoto a 45 ° C per rimuovere l&#39;NMP nei punti polimero. Dopo la sterilizzazione con luce UV per 30 minuti, i microarray sono pronti per l&#39;inoculazione di batteri. </li><li> Prima di inoculare diapositive con i batteri, effettuare una misurazione della fluorescenza di fondo (come descritto nella sezione 5). Utilizzare questa misura nel calcolo batterica vincolante. </li></ol> 4. L&#39;inoculazione di polimero microarray con i batteri NOTA: Garantire una buona tecnica asettica. Tutti movimentazione delle culture deve essere eseguita in un ambiente sterile: o utilizzando un becco Bunsen o in una cappa a flusso. Colture devono essere coltivate con la disponibilità di ossigeno, mezzo di crescita, e la temperatura adeguata alle esigenze di ciascuna specie. <ol><li> Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di Luria-Bertani brodo (LB: 10 g L -1 Bacto-triptone, 5 g L -1 NaCl, e 10 g L &lt;sup&gt; -1 estratto di lievito) con una colonia da una piastra. Incubare per una notte a 37 ° C, agitando a 200 rpm. </li><li> Preparare le scorte freezer di culture durante la notte con l&#39;aggiunta di glicerolo (10% globale di concentrazione) e conservare lo stock a -80 ° C. </li><li> Al fine di determinare il numero di cellule da campioni dei ceppi batterici scongelati, eseguire diluizioni seriali di ogni stock e far crescere i batteri durante la notte su terreni solidi. Determinazione accurata di numero di cellule in azioni assicura adeguata inoculazione di ogni specie 6. </li><li> Preparare inoculi per microarray. Singole culture specie sono coltivate come sopra e applicate direttamente ai microarray. BacMix-1 è una miscela batterica di Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), e Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 è una miscela batterica costituito da Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureola </em&gt;, K. pneumoniae e Enterococcus faecalis (E. faecalis). </li><li> Per produrre o cultura mista, mescolare pernottamenti in volumi uguali (3 ml ciascuna) e diluire quattro volte con fresca LB (a circa 50 ml di volume finale). </li><li> Posizionare microarrays polimero UV-sterilizzato in rettangolari piastre 4 pozzetti e incubare con 6 ml di colture batteriche miste a 37 ° C con agitazione (30 rpm) per 5 giorni. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, risciacquare delicatamente i microarrays due volte con tampone fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) e incubare con una soluzione di 1 mg ml -1 di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia in PBS per 30 min. </li><li> Lavare i vetrini microarray macchiati in un piatto ben fresco coprendo con PBS e vorticoso delicatamente, cambiando il PBS una volta. Essiccare sotto un flusso di aria. Applicare un vetrino di vetro alla diapositiva microarray e la tenuta in posizione con colla. Una volta che dry, sterilizzare la superficie esterna con il 70% (v / v) etanolo. </li><li> Gettare culture in base al loro livello di contenimento. </li></ol> 5. microarray Imaging e analisi <ol><li> Cattura immagini singole per ogni spot polimero in campo chiaro e DAPI (/ Em = 358 nm / 361 nm Ex) i canali. Eseguire manualmente con un microscopio a fluorescenza o utilizzando un microscopio a fluorescenza automatico (con una fase XYZ controllato da un software di acquisizione immagini) munito di un obiettivo 20X. NOTA: Fare riferimento al manuale di 18 per il funzionamento del software e regolando il microscopio per ottenere immagini utilizzando canali campo chiaro e DAPI. Assicurarsi che il tempo di guadagno e di esposizione per la cattura delle immagini per tutti i microarray sono gli stessi. </li><li> Ottenere l&#39;intensità media di fluorescenza di ogni spot nel canale DAPI scegliendo l&#39;area dello spot e quantificare la fluorescenza con un software di elaborazione delle immagini. </li><li> Per la fluorescenza di fondo di ogni spot, obtain immagini dei punti di polimero su un microarray replicare incubati solo con supporti senza batteri. Sottrarre la fluorescenza di sfondo dall&#39;intensità della macchia per ottenere la fluorescenza da batteri. </li><li> Calcolare il valore medio normalizzato dai quattro punti, che rappresenta ogni polimero, utilizzato per confrontare i batteri legame di vari polimeri 6. </li><li> Identificare i polimeri che presentano il minor batterica vincolante (fluorescenza basso) come polimeri &#39;hit&#39; 6. </li></ol> 6. Rivestimento di copertura scivola per la convalida &#39;Hit&#39; <ol><li> Per Coprioggetto cappotto con polimeri: <ol><li> Preparare soluzioni di polimeri HIT (~ 2% w / v) in tetraidrofurano (THF), o altro solvente appropriato. </li><li> cappotto Spin coprioggetto di vetro circolare di dimensioni adeguate con le soluzioni polimeriche usando un dispositivo a induzione far girare a 2000 rpm per 10 sec. NOTA: In assenza di un dispositivo a induzione di spin, coprioggetto o altri materiali possono essere rivestiti tuffo, anche se di rotazionerivestimento produce una superficie più uniforme. </li><li> Essiccare le coprioggetto rivestiti in forno ventilato a 40 ° C per una notte e sterilizzare usando la luce UV per 30 minuti prima di batteri inoculazione. </li></ol></li><li> Per Coprioggetto cappotto con Agarosio per i controlli negativi: <ol><li> Coprioggetto pulita o di trattamento al plasma per 10 minuti o l&#39;immersione in 1 M NaOH per 4 ore. </li><li> Immergere i coprioggetti in acetonitrile contenente 1% (3-amminopropil) triethoxysilane durante la notte. Pulire i coprioggetti con acetone 3 volte e messo in un forno (100 ° C) per 1 ora. </li><li> cappotto Dip i coprioggetti secchi con 1% soluzione acquosa di agarosio mantenuti in un bagno di acqua a 60 ° C. Posizionare i rivestito agarosio coprioggetto su superficie piana in condizioni ambientali senza polvere per 24 ore e sterilizzare usando la luce UV per 30 minuti prima di batteri inoculazione. </li></ol></li></ol> 7. Attaccamento e analisi di vetrino Utilizzando microscopio elettronico a scansione (SEM) <ol><li> Doposterilizzazione con luce UV per 30 minuti, porre i vetrini (polimero / vetro agarosio rivestite o non rivestite) in un 12-pozzetti standard o 24-pozzetti (a seconda delle dimensioni delle coprioggetto) e incubare con i batteri come descritto nel paragrafo 4. </li><li> Dopo incubazione con batteri, lavare i coprioggetti trattati e non due volte con 0,1 M tampone cacodilato (pH 7,4) e poi fissare con 2,5% (w / v) glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato (pH 7,4) per 2 ore. </li><li> campioni post-fix 1% (w / v) tetrossido di osmio per 1 ora a temperatura ambiente e disidratare con lavaggi etanolo sequenziali a 50, 70, 90 e 100% (v / v) per 30 minuti ciascuno. </li><li> Campioni a secco di CO 2 secondo protocolli standard 19. Il tempo di essiccazione dipenderà dalla natura del campione. </li><li> campioni Coat in una lega di oro / palladio (60/40%) utilizzando una spalmatrice polverizzazione da corrente a 30 mA e vuoto a 0,75 Torr. Esaminare con un microscopio elettronico come da protocolli standard 20. NOTA: Ensure adeguate misure di sicurezza per la gestione dei rischi derivanti dallo stoccaggio, la movimentazione e lo smaltimento di osmio tetrossido, in quanto è altamente tossico. </li><li> confrontare visivamente le immagini dei vetrini non rivestiti e quelli rivestiti con agarosio o polimeri &#39;hit&#39; per confermare batteriche / respingono le capacità di legame dei polimeri. NOTA: La resistenza di fissaggio deve essere facilmente visibile come una riduzione di cellule presenti. </li><li> Scegli il più promettente &#39;hit&#39; polimeri non vincolanti per gli studi di rivestimento con dispositivi medici (ad esempio, cateteri venosi centrali) 6. </li></ol> 8. La selezione di un solvente per il rivestimento di cateteri <ol><li> Valutare vari solventi per la loro compatibilità con la parte interiore del catetere, e la loro capacità di sciogliere il polimero &#39;colpito&#39;. Tagliare le parti di Cath-1 e in pezzi cilindrici 5 mm di lunghezza, e misurare con un calibro Vernier digitale. </li><li> Valutare vari solventi come acetAcido ic, ammoniaca, acetone, acetonitrile, etere dietilico, tetraidrofurano (THF), dimetilformammide (DMF), N-metil-2-pirrolidone (NMP), etanolo, metanolo, glicole etilenico, toluene e xilene. Immergere pezzi catetere nei solventi per 12 ore e valutare visivamente per l&#39;integrità del catetere e chiarezza di solvente. NOTA: scegliere un solvente che non causano i cateteri a gonfiarsi o disintegrare o si traducono in un solvente torbido. Il solvente deve sciogliere i polimeri &#39;hit&#39;. </li></ol> 9. Analisi di attaccamento batterica sui cateteri per Microscopia confocale <ol><li> Preparare 2,5% (w / v) soluzioni polimeriche in acetone, o altro solvente idoneo, come determinato al punto 8. Posizionare 5 pezzi mm catetere in un piccolo fiale di vetro (5 ml) e immergerli in 1 ml di soluzione di polimero per 2 minuti . Rimuovere la soluzione di polimero in eccesso e asciugare i pezzi catetere durante la notte in un forno sotto vuoto a 40 ° C. </li><li> Preparare inoculo mescolando scongelati batterica stgreggi per dare circa 10 6 cellule di ogni specie in 50 ml di LB 6. </li><li> Sterilizzare pezzi catetere rivestiti e non rivestiti con luce UV per 30 minuti e incubare con 1 ml inoculati LB in un 24-pozzetti, a 37 ° C per 3 giorni, con agitazione 6. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare i cateteri con PBS (2x, 2 ml), fissare i batteri con 10% paraformaldeide in PBS per 30 minuti, e lavare con PBS (1 ml). Colorare i batteri su pezzi catetere con DAPI (1 mcg ml - 1) per 20 minuti e lavare con PBS (1 ml). </li><li> Ottenere immagini confocale dei pezzi catetere utilizzando le seguenti impostazioni: 405nm diodo laser blu, campo rilevatore di 414-502 nm, hole pin - Airy1, immagine Dimensioni - 1.024 × 1.024 pixel, larghezza voxel - 105.2 nm, Z-stack spaziatura 0.5μ m , ingrandimento - 40X 1,25. </li><li> Completa il confocale da Z-stacking 50 immagini in tutta la lunghezza 100 micron del catetere. </li><li> Analizzare le immagini utilizzando suitabsoftware di analisi le: appiattire le immagini Z-stack nel piano Z, utilizzando la funzione di estendere la profondità di campo, per creare una singola immagine di un pezzo catetere. NOTA: Questa immagine dovrebbe quindi essere analizzata per ottenere l&#39;area del catetere coperta da batteri, dopo background-correzione usando la funzione &#39;appiattire sfondo&#39;. </li></ol> Analisi 10. dell&#39;Allegato batterica su cateteri da SEM <ol><li> Preparare 10% soluzione polimerica (w / v) in acetone. </li><li> Premere un puntale (per 200 microlitri micropipetta) nella porzione intermedia del pezzo tagliato del catetere per tenerlo e immergere il pezzo nella soluzione polimerica per circa 30 sec. Essiccare il pezzo rivestito in condizioni ambiente per 30 min. Applicare un secondo rivestimento immergendo nuovamente nella soluzione polimerica e asciugare per una notte in condizioni ambientali. </li><li> Dopo il trattamento UV e l&#39;incubazione con i batteri lavare i pezzi (n = 3) con PBS (2x, 1 ml) e trasferirli in piastre da 48 pozzetti contenenti 10% formaldeide in PBS per 30 min. Dopo il fissaggio, lavare i pezzi con PBS (1 ml), asciugare per una notte a temperatura ambiente, montare su stub con dischi in carbonio conduttive, e il cappotto oro utilizzando un dispositivo a induzione polverizzazione (vedi punto 7.5). </li><li> Ottenere immagini utilizzando un microscopio elettronico a scansione 6. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.

Attachment di batteri ad una superficie è un processo complesso determinato da una vasta gamma di fattori dipende dalle specie batteriche, le proprietà della superficie, il mezzo circostante e l&#39;ambiente fisico. Sebbene alcuni gruppi chimici sono noti per influenzare vincolanti batteriche (poliglicoli, per esempio, resistere tipicamente allegato 11), correlando l&#39;impatto biologico di polimeri con le loro strutture chimiche è difficile, rendendo progettazione razionale di polimeri per funzioni specifiche impegnative. In assenza di meccanismi dettagliati di attacco, altri studi hanno tentato di imitare le superfici repellenti presenti naturalmente, con lungo e ottimizzazione vasta processi 21. Il metodo high-throughput miniaturizzato qui presentata supera queste sfide per facilitare lo screening parallelo di centinaia di polimeri per identificare i cavi per ulteriori studi. I risultati del metodo microarray principalmente servono a identify probabili candidati piombo. La Figura 2 illustra 22 candidati con bassa vincolante di almeno una specie, mentre la figura 3 illustra la netta riduzione della capacità di legame. Tutte le 22 polimeri a basso vincolante mostrati in figura 2 sono stati portati avanti in esperimenti di scale-up, durante i quali il migliore (in termini di repellenza e rivestimento proprietà) sono stati determinati per essere PU83, PA13 e PA515 (figure 4 e 5). Poliacrilati offrono una maggiore flessibilità in termini di metodi di polimerizzazione e quindi il poliacrilato basso vincolante, PA13, è stato scelto per studi di rivestimento del catetere (figure 6 e 7). Più dettagliate ulteriori lavori su altri candidati è stata effettuata ed è stato riportato altrove 6. Attraverso una serie di iterazioni sperimentali abbiamo trovato un certo numero di passi minori sono stati fondamentali per il successo e la riproducibilità. Oltre ad agevolare l&#39;adesione dellapolimeri ai vetrini, utilizzando un agarosio sotto-rivestimento fornisce un fondo pulito, come agarosio è altamente resistente alla colonizzazione batterica. Allo stesso modo la coerenza nel polimero stessi visto, sia all&#39;interno della stessa matrice e tra gli array, è vitale e quindi la stampa delle matrici deve essere attentamente controllato. regolazione accurata dei perni della testina di stampa e di riempimento anche uniforme del piatto 384 pozzetti sono tenuti a garantire macchia uniforme. Come alcuni dei polimeri che abbiamo usato in mostra un grado di autofluorescenza, prendendo i dati fluorescenza di fondo per ogni diapositiva prima di incubazione con i batteri era vitale. Per tenere conto di variazioni e di ottenere sono invitati robusti replica i dati di microarray. La macchia impiegato qui (DAPI) non ha selettività per specie batteriche, vincolanti non specificamente al DNA. Pertanto, buona tecnica asettica è essenziale una volta colture batteriche sono introdotti come contaminanti possono passare inosservati, confondendo l&#39;interprezione dei risultati. Lo stesso vale per esperimenti successivi utilizzando la microscopia elettronica a scansione, dove è possibile solo distinguere aste e cocchi ma non genere o specie. Dopo lo screening microarray, polimeri promettenti dovrebbero essere scelti per un ulteriore convalida. Nell&#39;esempio qui presentato, sette polimeri di interesse sono stati identificati dal loro netta riduzione della fluorescenza sul microarray e loro inibizione di fissaggio è stata confermata da loro rivestimento su superfici di grandi dimensioni. Figure 4 e 5 mostrano la riduzione legame realizzato su vetrino, un mezzi pratici per testare il comportamento dei polimeri come rivestimenti di massa piuttosto che come macchie di microarray. Successivamente, questi polimeri sono stati rivestiti su dispositivi medici per quantificare con riduzione attacco batterico. È importante che il solvente scelto (vedi sezione protocollo 8) per questi studi rivestimento è benigna al substrato desiderato (qui, il catetere) mentre conservanoing capacità di sciogliere il polimero di interesse, per permettere rivestimento. Qui, abbiamo utilizzato acetone che, così come le proprietà menzionate, ha un punto di ebollizione basso ed evapora rapidamente per lasciare un rivestimento uniforme. I mezzi di convalida scelto dipenderà dalla specifica applicazione in fase di studio. Come osservazione delle cellule al microscopio elettronico e fluorescenza permette la quantificazione diretta di attaccamento singola cella, abbiamo scelto queste tecniche come complemento per il test colorazione microarray di massa. I risultati sono mostrati nelle figure 6 e 7, che dimostrano l&#39;importanza di tali metodi gratuiti. Le immagini confocali in figura 6 fornisce chiare immagini delle singole celle, mentre il SEM ha il vantaggio di consentire una valutazione della superficie del polimero, che è qui liscia ed uniforme. Questi metodi sono limitati dal campo di vista dei microscopi utilizzati, e quindi è important a prendere una serie di istantanee di avere fiducia nei risultati. Il metodo sopra descritto non può quantificare l&#39;adesione batterica su tutta la superficie, solo dedurre la copertura da un certo numero di piccole regioni. Crediamo che questo sia sufficiente per l&#39;applicazione descritta. Riduzione batterica vincolante potrebbe essere valutata enumerando batteri aderito superficiali sui pezzi interi catetere patinati e non patinati con metodi come descritto altrove 22. Tuttavia tali metodi richiedono superfici biomateriali schermati avere una superficie uniforme, che è difficile da mantenere quando saggi sono eseguiti con dispositivi medici, che spesso hanno una geometria complessa. Chiaramente, qualsiasi dispositivo destinato ad uso clinico deve passare attraverso sostanziale ulteriori test per garantire la sicurezza e l&#39;efficacia negli esseri umani. Il metodo qui presentato rappresenta l&#39;inizio di questo processo e ulteriore lavoro deve includere conferma di attività in vivo. In questo caso, lo studio c venosaatheters, il lavoro iniziale potrebbe indagare il legame di componenti del sangue e cellule intere al polimero. L&#39;effetto dei componenti del sangue sulla batterica vincolante dovrebbe essere considerata, eventualmente ripetendo i saggi di legame in presenza di siero inattivato o di sangue de-fibrinated 23. La prova definitiva della tecnologia sarà in un modello in vivo, come una infezione modello di impianto sottocutaneo 24. Dimostriamo il potenziale del metodo microarray polimero per lo screening di polimeri di superficie che alterano. Tali polimeri (entrambi resistenti e promuovere batterica vincolante) hanno un gran numero di applicazioni in medicina, l&#39;industria alimentare e delle biotecnologie, che significa questo metodo può essere utile in molti settori della ricerca. Anche se il lavoro qui utilizza batteri, il metodo potrebbe essere adattato ad altri tipi di cellule e analogamente altri microarray chimici.

<html> Microarrays polimeri sono miniaturizzati piattaforme high-throughput in cui fino a 7.000 polimeri 1 sono stampati su vetrini per l&#39;analisi in parallelo con le cellule procariote o eucariote 2. Il metodo presentato qui si basa su ciò che abbiamo prima descritto nel 2010 3. Questo sistema di screening è stato applicato a numerosi tipi di cellule tra cui epatociti umani 4, cellule staminali 5, tubulare renale cellule epiteliali 2, batteri e agenti patogeni 3,6 protozoi 7. In ogni caso, i polimeri che promuovono o resistere legame delle cellule in fase di studio sono stati identificati 8. Complessi di DNA con polimeri sintetici policationici sono stati utilizzati anche nel formato microarray per high-throughput screening di candidati gene trasfezione 9. Così come screening per le interazioni cellula-substrato, microarrays polimeri sono stati utilizzati anche per valutare le proprietà del materiale 10. &quot;&gt; La capacità di polimeri sintetici per modulare attacco di batteri su una superficie è ben definito 3,6,11. Numerosi fattori, tra cui carica, idrofobicità e rugosità superficiale della superficie polimerica sono noti per influenzare batteriche. Gli approcci convenzionali vincolanti biomateriali scoperta che resistono legame di batteri attraverso la sequenza o empiricamente progettare e testare un materiale alla volta sono, costosi e processi in termini di tempo ad alta intensità di manodopera. microarray polimeri offrono una valida alternativa per aggirare tali limitazioni. batteri superficiali associati crescere come popolazione complesso definito un biofilm - tali biofilm sono altamente resistenti a molti stress ambientali e antibiotici. Ciò è in parte dovuto alla loro matrice extracellulare densa (composto da proteine, polisaccaridi e acidi nucleici) 12 e in parte a causa della maggiore presenza di robusti &quot;persistor&quot; cellule in biofilm 13. although i precisi meccanismi di associazione di superficie e la successiva formazione di biofilm sono difficili da caratterizzare, in genere si ritiene che ci sono tre diverse fasi di crescita della superficie 14 - 16. , Attaccamento reversibili iniziale è seguita da forte adesione delle cellule, la creazione di un biofilm per la produzione di una proteina extracellulare e della matrice polisaccaride e la proliferazione cellulare. Infine, i rilasci biofilm maturi cellule planctonici, che possono avviare nuove infezioni altrove a vita libera. Batteri-repellente polimeri che impediscono l&#39;attacco iniziale di batteri, e quindi impediscono prime fasi di formazione del biofilm, potenzialmente rappresentano un&#39;ottima soluzione per minimizzare le infezioni. Dato l&#39;aumento della resistenza agli antibiotici (e anche l&#39;intrinseca maggiore resistenza dei batteri di superficie associati 12), mezzi antibiotici libera di ridurre le infezioni sono di particolare interesse. In un ambiente ospedaliero, polimero batteri-repellenterivestimenti possono avere una applicazione medica diretta nella riduzione delle infezioni nosocomiali, che comunemente si formano intorno dispositivi impiantati 17. Qui, un metodo ad alta produttività per la proiezione di 381 polimeri per l&#39;attività repellente contro una serie di batteri patogeni associati alle infezioni nosocomiali, seguita da convalida colpo e successivo rivestimento e dosaggio dei materiali dei cateteri venosi centrali, è descritto (Figura 1). In breve, i polimeri sono stati avvistati su agarosio rivestite vetrini di stampa a contatto e, dopo l&#39;essiccazione e la sterilizzazione, gli array miniaturizzati sono state incubate con clinicamente importanti colture batteriche. Dopo l&#39;incubazione, i microarray sono state delicatamente lavati e le cellule batteriche aderenti erano macchiate e visualizzate mediante fluorescenza. Successivamente, polimeri che inibito batterica vincolanti sono stati studiati su scala più vasta stendendo su copertura in vetro scivola e visualizzati al microscopio elettronico. respingono selezionatipolimeri prestati sono stati poi rivestiti su cateteri commerciali e dimostrato di ridurre l&#39;attaccamento dei batteri di quasi 100 volte.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma</td><td>05066&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per la preparazione del silano</td><td>Sigma</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>Polimeri</td><td>Sintetizzato internamente</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>NMP</td><td>Sigma</td><td>494496</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>Oxoid</td><td>CM1018</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrofurano</td><td>Sigma</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>(3- vetrini rivestiti di trietossisilano</td><td>Sigma</td><td>Silane-prep</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di cacodilato</td><td>Sigma</td><td>97068</td><td></td></tr><tr><td>Catetere 1</td><td>Catetere</td><td>CS12123E</td><td></td>Arrow International</tr><tr><td>2</td><td>Baxter Healthcare</td><td>ECS1320</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>Sigma</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampante a contatto</td><td>Genetix</td><td>Qarraymini</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a microarray</td><td>IMSTAR</td><td>Pathfinder</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Speedline Technologies</td> Microscopio confocale <td>6708D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Media Cybernetics</td><td>Image-Pro Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Philips</td><td>XL30CP</td><td></td></tr><tr><td>Sputter coater</td><td>Bal-Tec</td><td>SCD050</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput identificazione di batteri polimeri repellente per dispositivi medici

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

I dispositivi medici sono spesso associati a infezioni nosocomiali, che mettono a dura prova i pazienti e il sistema sanitario, oltre a contribuire alla resistenza antimicrobica. Una possibile strada per la riduzione delle infezioni associate ai dispositivi è l'identificazione di rivestimenti polimerici repellenti ai batteri per questi dispositivi, che impedirebbero il legame batterico nella fase iniziale di attacco. Qui viene descritto un metodo per l'identificazione di tali polimeri repellenti, basato sullo screening parallelo di centinaia di polimeri utilizzando un microarray. Questo metodo ad alto rendimento ha portato all'identificazione di una gamma di polimeri promettenti che hanno resistito al legame di varie specie batteriche clinicamente rilevanti individualmente e anche come comunità multi-specie. Un polimero, PA13 (polimetilmetacrilato-co-dimetilacrilammide)), ha dimostrato una significativa riduzione dell'adesione di un certo numero di isolati ospedalieri quando è stato rivestito su due cateteri venosi centrali disponibili in commercio. Il metodo descritto potrebbe essere applicato per identificare i polimeri per un'ampia gamma di applicazioni in cui la modifica dell'attaccamento batterico è importante.

La figura 2 mostra attaccamento batterica (intensità di fluorescenza normalizzato) per un numero di polimeri come determinato mediante analisi microarray. Macchie stampate senza polimero (solo NMP) sono il controllo negativo, come agarosio resiste fortemente vincolante 6 batterica - fluorescenza registrata è molto bassa. I polimeri mostrate sono tutti a basso legame sebbene nella maggior parte dei casi, le proprietà repellenti di un polimero varia significativamente tra specie batteriche testate. Ciò riflette le ampie differenze tra i meccanismi di attacco tra le specie diverse. La selezione di un polimero appropriato è pertanto dipende dall&#39;applicazione, ma i polimeri a basso vincolante sono facilmente identificabili dal confronto con agarosio. polimeri alti vincolante sono suscettibili di essere identificati in un array, e possono essere utilizzati come controlli positivi per successivi esperimenti. Per i polimeri che non mostrano auto-fluorescenza nel canale DAPI, co qualitativamparison delle immagini spot può essere fatta visivamente (come mostrato in figura 3, evidenziando un rappresentante ad alto legame polimero e tre esempio polimeri a bassa vincolanti). Tale confronto, fornendo meno informazioni rispetto all&#39;analisi statistica, può essere un utile convalida visiva dei valori di intensità calcolati. Con 22 polimeri appropriati identificati utilizzando il microarray, esperimenti di scale-up vengono effettuati per confermare la loro proprietà batteri repellente quando viene utilizzato per il rivestimento di grandi superfici. Sono riportati gli esempi migliori risultati, utilizzate per scivola copertura in vetro cappotto (analizzati al SEM (figure 4 e 5)) e fette catetere (analizzati al microscopio confocale (Figura 6) e SEM (Figura 7)). Entrambi i metodi microscopici hanno il vantaggio di consentire la conta delle cellule diretti sulla superficie, fornendo dati inequivocabile; riduzione adesione cellulare è facilmente visible. Tali rivestimenti che meglio mantenuto il loro proprietà repellenti su scale-up, così come essere suscettibili di tecniche di rivestimento su larga scala, sono stati studiati ulteriormente. I risultati riportati illustrano i polimeri migliori risultati di ogni fase. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig1.jpg" /> Figura 1:. Passi coinvolti nella identificazione dei polimeri batteri repellenti mediante microarrays polimerici per applicazioni biomediche SEM = microscopia elettronica a scansione. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig2.jpg" /> Figura 2:. Batterica impegna una serie di polimeri, determinata mediante analisi microarray basso batterica vincolante è visto su una serie di poliacrilati / acrilammidi (PA) e poliuretani (PU). I risultati di microarray polimeri sondato con diversi s batteriche<html> sono mostrati; pecies (BacMix-1 e BacMix-2 C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, e due consorzi). Batterica legame espresso come correzione del fondo media DAPI fluorescenza intensità (normalizzato). barre di errore rappresentano la deviazione standard. Adattato da riferimento 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig3.jpg" /> Figura 3:. Immagini di esempio di macchie polimerici fluorescenza (DAPI) e microscopia in campo chiaro immagini di BacMix-2 che mostrano attaccamento batterica di polimeri rappresentativi. Un polimero fortemente vincolante è incluso per il confronto di diversi polimeri non vincolanti (PU-20, PA-336 e PU-179). Barra di scala = 100 micron. Adattato da riferimento 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig4.jpg" /> Figura 4: esperimenti di scale-up con ormeggi copertura in vetro immagini SEM mostrano attaccamento batterica su vetro non rivestito e vetro rivestito con polimeri &#39;hit&#39; (esempi scelti dalla Tabella 1).. Barre di scala = 20 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig5.jpg" /> Figura 5:. Batterica legame quantificato mediante conteggio delle cellule da immagini SEM Confronto di cellule attaccate per unità di superficie di superfici rivestite con le migliori polimeri &#39;hit&#39;. Agarose è stata utilizzata come superficie &#39;non vincolante&#39; un controllo, con vetro come superficie vincolante controllo. Le barre di errore rappresentanodeviazione standard. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig6.jpg" /> Figura 6: Confronto tra batterica vincolante su fette catetere patinati e non patinati immagini confocale a confronto catetere non trattata (cath-1) (A) e il catetere rivestito con PA13 (B), dopo incubazione con BacMix-2.. Le immagini scattate con un obiettivo 40X (Scala bar = 20 micron). Adattato da riferimento 6. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54382/54382fig7.jpg" /> Figura 7:. Confronto tra batterica vincolante su fette cateteri rivestiti e non rivestiti immagini SEM mostrano confronto catetere greggia (cath-1) (A) e il catetere rivestito con PA13 (B), dopo incubazione con un cocktail batterica costituito da BacMix-2 Scale. bar = 101; m. Adattato da riferimento 6. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Polimero </td><td> monomero 1 </td><td> monomero 2 </td><td> monomero 3 </td><td colspan="3"> Rapporto di monomeri </td></tr><tr><td> PA465 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> HEA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA475 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> HEMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA513 </td><td> MEMA </td><td> DEAEMA </td><td> MMA </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> PA515 </td><td> MEMA </td><td> DEAEA </td><td> MMA </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PA13 </td><td&gt; MMA </td><td> DMAA </td><td> - </td><td> 9 </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU1 </td><td> PEG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU16 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU161 </td><td> PEG2000 </td><td> MDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU7 </td><td> PEG900 </td><td> BICH </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU83 </td><td> PEG900 </td><td> HMDI </td><td> BD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU227 </td><td> PPG-PEG-1900 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU129</td><td> PPG425 </td><td> BICH </td><td> DMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU10 </td><td> PTMG2000 </td><td> BICH </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU179 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> NMAPD </td><td> 2.5 </td><td> 5.2 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> PU20 </td><td> PTMG2000 </td><td> MDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr><tr><td> PU5 </td><td> PTMG2000 </td><td> HDI </td><td> - </td><td> 4.9 </td><td> 5.2 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Composizione dei batteri non vincolanti &#39;hit&#39; polimeri in figura 2.

Viene descritto un metodo di microarray ad alto rendimento per l'identificazione di polimeri che riducono il legame batterico sulla superficie dei dispositivi medici.

High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di microarray polimerico è identificare polimeri sintetici in grado di modulare l'adesione dei batteri alle superfici abiotiche. Questo metodo può contribuire ad accelerare i progressi nella scoperta di biomateriali semplici ed economici che inibiscono l'adesione batterica ai dispositivi medici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla ricerca convenzionale sui biomateriali, che prevede la prova di un materiale alla volta, è la capacità di analizzare centinaia di polimeri contemporaneamente in un'unica prova.Per iniziare, preparare le soluzioni polimeriche e aggiungerle alle pozzette di una piastra a 384 pozzette, seguendo il protocollo descritto. Creare una procedura per stampare i polimeri in quadruplicato, costituita da 1536 punti, disposti in 48 righe e 32 colonne, stampando 32 soluzioni polimeriche alla volta in modo da poter fermare la stampante dopo ogni sezione per consentire la pulizia dei perni. Posizionare ora le lamelle rivestite di agarosio sulla piattaforma e assicurarsi che vi sia un'adeguata tenuta a vuoto per mantenere le lamelle in posizione.Per regolare la testina in modo che tutti i perni siano alla stessa altezza, abbassare manualmente la testina su un vetrino e verificare che i perni si sollevino contemporaneamente. Posizionare la piastra a pozzetti sul supporto con il pozzetto A1 in alto a destra del supporto ed assicurarsi che la piastra sia fissata saldamente. Verificare che il vetrino e la piastra a pozzetti siano in posizione quando richiesto.Stampare una sezione alla volta, prevedendo la pulizia dei perni tra le diverse sezioni. Quindi utilizzare un tovagliolo di carta imbevuto di acetone per pulire accuratamente i perni, seguito da carta assorbente asciutta per assicurarsi che i perni siano completamente asciutti.Una volta completata la stampa delle microarray, posizionarle in un portavetrini e trasferirle in un forno sotto vuoto impostato a 40 gradi celsius per asciugarle ed eliminare l'N&P nelle gocce polimeriche. Successivamente, utilizzare la luce UV per sterilizzare le piastre per 30 minuti. Prima di inoculare i vetrini con i batteri, effettuare una misurazione della fluorescenza di fondo seguendo il protocollo indicato nel testo.Dopo la coltura e la preparazione degli inoculari per i microarray, secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare i microarray polimerici sterilizzati con raggi UV in piastre rettangolari a quattro pozzetti e aggiungere sei millilitri di colture batteriche miste. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con agitazione delicata per cinque giorni. Al termine dell'incubazione, risciacquare delicatamente i microarray due volte con PBS.Quindi aggiungere un microgrammo per millilitro di DAPI in PBS e incubare per 30 minuti. Successivamente, trasferire i microarray in una nuova piastra a quattro pozzetti, coprire i microarray con PBS quindi agitare delicatamente. Poi sostituire il PBS una volta e ripetere il lavaggio.Dopo il risciacquo, asciugare le microarray sotto un flusso d'aria, quindi applicare il film sigillante e fissare coprioggetti in vetro alle lamelle delle microarray. Quando la colla è asciutta, utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la superficie esterna. Utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 20x, acquisire singole immagini per ciascun punto polimerico nei canali campo chiaro e strappy.Per rivestire i coprioggetti con polimeri, preparare soluzioni di polimeri HIT in tetraidrofurano o un altro solvente appropriato. Utilizzando un spin coater, eseguire il rivestimento a centrifuga di coprioggetti circolari in vetro di dimensioni adatte con le soluzioni polimeriche a 2000 giri al minuto per dieci secondi. Asciugare i coprioggetti rivestiti in un forno a circolazione d'aria a 40 gradi Celsius durante la notte.E utilizzare la luce UV per sterilizzare i vetrini per 30 minuti prima dell'inoculo con batteri. Posizionare i vetrini sterilizzati con UV in una piastra standard da 12 o 24 pozzetti e incubare con i batteri come dimostrato in precedenza in questo video. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini rivestiti due volte con tampone cacodilato 0,1 molare e quindi fissare i campioni per due ore con glutaraldeide al 2,5% peso/volume in tampone cacodilato 0,1 molare.Fissare i vetrini con tetroxido di osmio al 1% per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente disidratarli in una serie di etanolo per 30 minuti a ciascuna concentrazione. Quindi rivestire i campioni con un miscuglio di oro e platino in rapporto 60 a 40% utilizzando un sputter coater con una corrente di 30 milliampere e un vuoto di 0,75 torr.Dopo aver acquisito le immagini con il SEM, confrontare visivamente le immagini dei vetrini non rivestiti e di quelli rivestiti con agarosio o con i polimeri HIT per confermare la capacità dei polimeri di legare o respingere i batteri. Per valutare la compatibilità di diversi solventi con la parte terminale del catetere, nonché la loro capacità di sciogliere il polimero HIT, immergere i pezzi di catetere nei solventi e incubare per 12 ore prima di valutare visivamente l'integrità del catetere e la chiarezza del solvente. Per analizzare l'adesione batterica sui cateteri mediante SEM, preparare una soluzione di polimero al 10% in acetone.Inserire la punta di una pipetta microlitrica da 200 microlitri nella parte centrale del pezzo tagliato del catetere per tenerlo fermo e immergere il pezzo nella soluzione polimerica per circa 30 secondi. Lasciare asciugare il pezzo rivestito in condizioni ambiente per 30 minuti, quindi applicare un secondo strato immergendo nuovamente il pezzo del catetere nella soluzione polimerica e farlo asciugare tutta la notte in condizioni ambiente. Dopo l'incubazione dei pezzi di catetere rivestiti e non rivestiti in LB inoculato, secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare un millilitro di PBS per lavare i cateteri.Quindi, utilizzare paraformaldeide al 10% in PBS per fissare i batteri per 30 minuti. Dopo un lavaggio con PBS, usare DAPI per colorare i batteri sulle sezioni del catetere per 20 minuti. Prima di lavare con un millilitro di PBS.Osservare la disposizione dei campioni nella camera. Utilizzando le seguenti impostazioni, acquisire immagini confocali dei pezzi del catetere. Completare l'acquisizione confocale eseguendo uno z-stacking di 50 immagini su una lunghezza di 100 micrometri del catetere.Dopo il trattamento con raggi UV e l'incubazione con batteri, utilizzare un millilitro di PBS per lavare i pezzi due volte e trasferirli in piastre a 48 pozzetti contenenti formaldeide al 10% in PBS per 30 minuti. Dopo la fissazione dei campioni, eseguire un ulteriore lavaggio con PBS e lasciare asciugare tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, montare su supporti con dischi di carbonio conduttivo e ricoprire con oro mediante sputter coater.Prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzando un microscopio elettronico a scansione. Questa figura mostra l'adesione batterica a diversi polimeri determinata mediante analisi con microarray. I punti stampati senza polimero fungono da controllo negativo poiché l'agarosio resiste fortemente al legame batterico e quindi la fluorescenza è molto bassa.I polimeri visualizzati presentano un legame con la lega, anche se nella maggior parte dei casi le proprietà repellenti di un polimero variano notevolmente tra le diverse specie batteriche testate. Questo riflette le ampie differenze nei meccanismi di adesione tra le varie specie. I polimeri a basso legame sono facilmente identificabili mediante confronto con l'agarosio.I polimeri ad alto legame sono probabilmente identificabili in un array e possono essere utilizzati come controlli positivi per esperimenti successivi. Per i polimeri che non mostrano autofluorescenza nel canale DAPI, è possibile effettuare un confronto qualitativo delle immagini dei punti a occhio nudo. Sono stati eseguiti esperimenti in scala maggiore per testare il rivestimento di superfici più ampie, al fine di confermare le proprietà repulsive nei confronti dei batteri di 22 polimeri appropriati identificati.Qui mostrati ci sono i campioni con le migliori prestazioni utilizzati per rivestire coprioggetti di vetro, analizzati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Queste immagini mostrano sezioni di catetere analizzate mediante microscopia confocale e SEM. Entrambi i metodi microscopici offrono il vantaggio di permettere conte diretti delle cellule sulla superficie, fornendo dati inequivocabili poiché la riduzione dell'adesione cellulare è facilmente visibile.Seguendo questa procedura, è possibile sottoporre a test il siero o i componenti del sangue per determinare il loro impatto sul legame batterico. Un modello animale potrebbe essere utilizzato per valutare il potenziale delle rivestimenti polimerici per l'uso clinico. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche e organismi patogeni può essere pericoloso.E devono essere previsti controlli necessari durante la manipolazione e lo smaltimento per ridurre al minimo i rischi per la persona e per l'ambiente.

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