High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

L'obiettivo generale di questa tecnica di microarray polimerico è quello di identificare polimeri sintetici in grado di modulare l'attaccamento dei batteri alle superfici abiotiche. Questo metodo può aiutare ad accelerare i progressi nella scoperta di biomateriali semplici ed economici che inibiscono l'attaccamento batterico ai dispositivi medici. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla ricerca convenzionale sui biomateriali di testare un materiale alla volta è la sua capacità di vagliare centinaia di polimeri contemporaneamente in un singolo asset.

Per iniziare, preparare le soluzioni polimeriche e aggiungerle ai pozzetti di una piastra a 384 pozzetti, secondo il protocollo di testo. Crea una routine per stampare polimeri in quadruplice copia composta da 1536 punti, disposti in 48 righe e 32 colonne, stampando 32 soluzioni polimeriche alla volta in modo che la stampante possa essere fermata dopo aver stampato ogni sezione per consentire la pulizia dei perni. Ora posiziona i vetrini rivestiti di agarosio sulla piattaforma e assicurati che il vuoto li tenga in posizione.

Per regolare la testina di stampa in modo che tutti i perni siano alla stessa altezza, abbassare manualmente la testina su un vetrino e verificare che i perni si spostino verso l'alto contemporaneamente. Posizionare la piastra a pozzetti sul supporto della piastra con il pozzetto A1 in alto a destra del supporto e assicurarsi che la piastra a pozzetti sia fissata saldamente. Verificare che il vetrino e la piastra del pozzetto siano in posizione quando richiesto.

Stampa una sezione alla volta, consentendo la pulizia dei perni tra le sezioni. Quindi utilizzare un tovagliolo di carta imbevuto di acetone per pulire a fondo i perni. Seguire con carta velina asciutta per assicurarsi che i perni siano completamente asciutti.

Quando i microarray sono completamente stampati, posizionarli in un supporto per vetrini e trasferirli in un forno sottovuoto, impostato a 40 gradi Celsius per asciugare, per rimuovere l'N&P nelle macchie del polimero. Quindi utilizzare la luce UV per sterilizzare le piastre per 30 minuti. Prima di inoculare i vetrini con i batteri, effettuare una misurazione della fluorescenza di fondo secondo il protocollo di testo.

Dopo aver coltivato e preparato gli inoculi per i microarray, secondo il protocollo di testo, posizionare i microarray polimerici sterilizzati UV in piastre rettangolari a quattro pozzetti e aggiungere sei millilitri di colture batteriche miste. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con una leggera agitazione per cinque giorni. Dopo l'incubazione, utilizzare PBS per sciacquare delicatamente i microarray due volte.

Quindi aggiungere un microgrammo per millilitro di DAPI in PBS e incubare per 30 minuti. Quindi, trasferire i microarray su una nuova piastra a quattro pozzetti, coprire i microarray con PBS e agitare delicatamente. Quindi cambiare il PBS una volta e ripetere il lavaggio.

Dopo il risciacquo, asciugare i microarray sotto un flusso d'aria, quindi applicare la pellicola sigillante e applicare i vetrini di copertura sui vetrini dei microarray. Quando la colla è asciutta, utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la superficie esterna. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, dotato di un soggettivo 20x, cattura singole immagini per ogni punto polimerico in campo chiaro e canali a strappy.

Per rivestire i vetrini coprioggetti con polimeri, preparare soluzioni di polimeri HIT in tetraidrofurano o in un altro solvente appropriato. Utilizzando una centrifuga, centrifugare i vetrini circolari di dimensioni adeguate con le soluzioni polimeriche a 2000 giri/min per dieci secondi. Asciugare i vetrini coprioggetto rivestiti in un forno ventilato a 40 gradi Celsius per una notte.

E usa la luce UV per sterilizzare i vetrini coprioggetto per 30 minuti prima di inoculare i batteri. Posizionare i vetrini coprioggetti sterilizzati con raggi UV in una piastra standard da 12 o 24 pozzetti e incubare con i batteri, come dimostrato in precedenza in questo video. Dopo l'incubazione, utilizzare un tampone cacodilato molare 0,1 per lavare due volte i vetrini coprioggetti rivestiti e quindi con il 2,5% in peso per volume di glutaraldeide e 0,1 tampone cacodilato molare, fissare i campioni per due ore.

Post-fissare i vetrini coprioggetti con tetrossido di osmio all'1% per un'ora a temperatura ambiente. Prima di disidratarli in una serie di etanolo per 30 minuti ad ogni concentrazione. Quindi, con un rivestimento sputter e una miscela di leghe da oro a platino dal 60 al 40%, rivestire i campioni utilizzando una corrente di 30 milliampere e un vuoto di 0,75 torr.

Dopo aver scattato le immagini con il SEM, confronta visivamente le immagini dei vetrini coprioggetti non rivestiti e quelli rivestiti con agarosio o i polimeri HIT per confermare le capacità di legame o repulsione batterica dei polimeri. Per valutare la compatibilità dei vari solventi con la parte di fine welling del catetere, nonché la loro capacità di sciogliere il polimero HIT, immergere i pezzi del catetere nei solventi e incubare per 12 ore prima di valutare visivamente l'integrità del catetere e la chiarezza del solvente. Per analizzare l'attacco batterico sui cateteri mediante SEM, preparare una soluzione polimerica al 10% in acetone.

Premere una punta per micropipetta da 200 microlitri nella parte centrale del pezzo tagliato del catetere per tenerlo premuto e inserire il pezzo nella soluzione polimerica per circa 30 secondi. Asciugare il pezzo rivestito in condizioni ambientali per 30 minuti, quindi applicare un secondo rivestimento immergendo nuovamente il catetere nella soluzione polimerica e asciugare per una notte in condizioni ambientali. Dopo aver incubato i pezzi di catetere rivestiti e non rivestiti in LB inoculato, secondo il protocollo di testo, utilizzare un millilitro di PBS per lavare i cateteri.

Quindi utilizzare il 10% di paraformaldeide in PBS per fissare i batteri per 30 minuti. Dopo un lavaggio con PBS, utilizzare DAPI per colorare i batteri sui pezzi del catetere per 20 minuti. Prima del lavaggio con un millilitro di PBS.

Osservare la disposizione dei campioni nella camera. Utilizzando le seguenti impostazioni, acquisire immagini confocali dei pezzi del catetere. Completa l'imaging confocale impilando 50 immagini su una lunghezza di 100 micrometri del catetere.

Dopo il trattamento UV e l'incubazione con batteri, utilizzare un millilitro di PBS per lavare i pezzi due volte e trasferirli in piastre da 48 pozzetti contenenti il 10% di formaldeide in PBS per 30 minuti. Dopo aver fissato i campioni, eseguire un altro lavaggio con PBS e asciugare per una notte a temperatura ambiente. Quindi montare su tronchetti con dischi in carbonio conduttivo e utilizzare un rivestimento sputter per rivestire d'oro.

Prima dell'imaging, utilizzando un microscopio elettronico a scansione. Questa figura mostra l'adesione batterica a un numero di polimeri come determinato dall'analisi dei microarray. Le macchie stampate senza polimero fungono da controllo negativo poiché l'agarosio resiste fortemente al legame batterico e quindi la fluorescenza è molto bassa.

I polimeri mostrati sono leganti in lega, anche se nella maggior parte dei casi le proprietà repellenti di un polimero variano in modo significativo tra le specie batteriche testate. Ciò riflette le ampie differenze tra i meccanismi di attaccamento tra le diverse specie. I polimeri a basso legame sono facilmente identificabili rispetto all'agarosio.

È probabile che i polimeri ad alto legame vengano identificati in un array e possano essere utilizzati come controlli positivi per esperimenti successivi. Per i polimeri che non mostrano autofluorescenza nel canale DAPI, è possibile effettuare un confronto qualitativo delle immagini spot. Sono stati eseguiti esperimenti di scale-up per testare il rivestimento di superfici più grandi per confermare le proprietà repellenti ai batteri di 22 polimeri appropriati identificati.

Di seguito sono riportati i campioni più performanti utilizzati per rivestire i vetrini di copertura analizzati da SEM. Queste figure mostrano le fette di catetere analizzate mediante microscopia confocale e SEM. Entrambi i metodi microscopici hanno il vantaggio di consentire la conta diretta delle cellule sulla superficie, fornendo dati inequivocabili, poiché la riduzione dell'attaccamento cellulare è facilmente visibile.

Seguendo questa procedura, il siero o i componenti del sangue potrebbero essere testati per determinare il loro impatto sul legame batterico. Un modello animale potrebbe essere utilizzato per valutare il potenziale dei rivestimenti polimerici per uso clinico. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche e organismi patogeni può essere pericoloso.

E dovrebbero essere messi in atto i controlli necessari durante la manipolazione e lo smaltimento per mitigare i rischi personali e ambientali.