High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

L'obiettivo generale di questa tecnica di microarray polimerico è identificare polimeri sintetici in grado di modulare l'adesione dei batteri alle superfici abiotiche. Questo metodo può contribuire ad accelerare i progressi nella scoperta di biomateriali semplici ed economici che inibiscono l'adesione batterica ai dispositivi medici. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla ricerca convenzionale sui biomateriali, che prevede la prova di un materiale alla volta, è la capacità di analizzare centinaia di polimeri contemporaneamente in un'unica prova.

Per iniziare, preparare le soluzioni polimeriche e aggiungerle alle pozzette di una piastra a 384 pozzette, seguendo il protocollo descritto. Creare una procedura per stampare i polimeri in quadruplicato, costituita da 1536 punti, disposti in 48 righe e 32 colonne, stampando 32 soluzioni polimeriche alla volta in modo da poter fermare la stampante dopo ogni sezione per consentire la pulizia dei perni. Posizionare ora le lamelle rivestite di agarosio sulla piattaforma e assicurarsi che vi sia un'adeguata tenuta a vuoto per mantenere le lamelle in posizione.

Per regolare la testina in modo che tutti i perni siano alla stessa altezza, abbassare manualmente la testina su un vetrino e verificare che i perni si sollevino contemporaneamente. Posizionare la piastra a pozzetti sul supporto con il pozzetto A1 in alto a destra del supporto ed assicurarsi che la piastra sia fissata saldamente. Verificare che il vetrino e la piastra a pozzetti siano in posizione quando richiesto.

Stampare una sezione alla volta, prevedendo la pulizia dei perni tra le diverse sezioni. Quindi utilizzare un tovagliolo di carta imbevuto di acetone per pulire accuratamente i perni, seguito da carta assorbente asciutta per assicurarsi che i perni siano completamente asciutti.

Una volta completata la stampa delle microarray, posizionarle in un portavetrini e trasferirle in un forno sotto vuoto impostato a 40 gradi celsius per asciugarle ed eliminare l'N&P nelle gocce polimeriche. Successivamente, utilizzare la luce UV per sterilizzare le piastre per 30 minuti. Prima di inoculare i vetrini con i batteri, effettuare una misurazione della fluorescenza di fondo seguendo il protocollo indicato nel testo.

Dopo la coltura e la preparazione degli inoculari per i microarray, secondo il protocollo descritto nel testo, posizionare i microarray polimerici sterilizzati con raggi UV in piastre rettangolari a quattro pozzetti e aggiungere sei millilitri di colture batteriche miste. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con agitazione delicata per cinque giorni. Al termine dell'incubazione, risciacquare delicatamente i microarray due volte con PBS.

Quindi aggiungere un microgrammo per millilitro di DAPI in PBS e incubare per 30 minuti. Successivamente, trasferire i microarray in una nuova piastra a quattro pozzetti, coprire i microarray con PBS quindi agitare delicatamente. Poi sostituire il PBS una volta e ripetere il lavaggio.

Dopo il risciacquo, asciugare le microarray sotto un flusso d'aria, quindi applicare il film sigillante e fissare coprioggetti in vetro alle lamelle delle microarray. Quando la colla è asciutta, utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la superficie esterna. Utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo 20x, acquisire singole immagini per ciascun punto polimerico nei canali campo chiaro e strappy.

Per rivestire i coprioggetti con polimeri, preparare soluzioni di polimeri HIT in tetraidrofurano o un altro solvente appropriato. Utilizzando un spin coater, eseguire il rivestimento a centrifuga di coprioggetti circolari in vetro di dimensioni adatte con le soluzioni polimeriche a 2000 giri al minuto per dieci secondi. Asciugare i coprioggetti rivestiti in un forno a circolazione d'aria a 40 gradi Celsius durante la notte.

E utilizzare la luce UV per sterilizzare i vetrini per 30 minuti prima dell'inoculo con batteri. Posizionare i vetrini sterilizzati con UV in una piastra standard da 12 o 24 pozzetti e incubare con i batteri come dimostrato in precedenza in questo video. Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini rivestiti due volte con tampone cacodilato 0,1 molare e quindi fissare i campioni per due ore con glutaraldeide al 2,5% peso/volume in tampone cacodilato 0,1 molare.

Fissare i vetrini con tetroxido di osmio al 1% per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente disidratarli in una serie di etanolo per 30 minuti a ciascuna concentrazione. Quindi rivestire i campioni con un miscuglio di oro e platino in rapporto 60 a 40% utilizzando un sputter coater con una corrente di 30 milliampere e un vuoto di 0,75 torr.

Dopo aver acquisito le immagini con il SEM, confrontare visivamente le immagini dei vetrini non rivestiti e di quelli rivestiti con agarosio o con i polimeri HIT per confermare la capacità dei polimeri di legare o respingere i batteri. Per valutare la compatibilità di diversi solventi con la parte terminale del catetere, nonché la loro capacità di sciogliere il polimero HIT, immergere i pezzi di catetere nei solventi e incubare per 12 ore prima di valutare visivamente l'integrità del catetere e la chiarezza del solvente. Per analizzare l'adesione batterica sui cateteri mediante SEM, preparare una soluzione di polimero al 10% in acetone.

Inserire la punta di una pipetta microlitrica da 200 microlitri nella parte centrale del pezzo tagliato del catetere per tenerlo fermo e immergere il pezzo nella soluzione polimerica per circa 30 secondi. Lasciare asciugare il pezzo rivestito in condizioni ambiente per 30 minuti, quindi applicare un secondo strato immergendo nuovamente il pezzo del catetere nella soluzione polimerica e farlo asciugare tutta la notte in condizioni ambiente. Dopo l'incubazione dei pezzi di catetere rivestiti e non rivestiti in LB inoculato, secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare un millilitro di PBS per lavare i cateteri.

Quindi, utilizzare paraformaldeide al 10% in PBS per fissare i batteri per 30 minuti. Dopo un lavaggio con PBS, usare DAPI per colorare i batteri sulle sezioni del catetere per 20 minuti. Prima di lavare con un millilitro di PBS.

Osservare la disposizione dei campioni nella camera. Utilizzando le seguenti impostazioni, acquisire immagini confocali dei pezzi del catetere. Completare l'acquisizione confocale eseguendo uno z-stacking di 50 immagini su una lunghezza di 100 micrometri del catetere.

Dopo il trattamento con raggi UV e l'incubazione con batteri, utilizzare un millilitro di PBS per lavare i pezzi due volte e trasferirli in piastre a 48 pozzetti contenenti formaldeide al 10% in PBS per 30 minuti. Dopo la fissazione dei campioni, eseguire un ulteriore lavaggio con PBS e lasciare asciugare tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, montare su supporti con dischi di carbonio conduttivo e ricoprire con oro mediante sputter coater.

Prima dell'acquisizione delle immagini, utilizzando un microscopio elettronico a scansione. Questa figura mostra l'adesione batterica a diversi polimeri determinata mediante analisi con microarray. I punti stampati senza polimero fungono da controllo negativo poiché l'agarosio resiste fortemente al legame batterico e quindi la fluorescenza è molto bassa.

I polimeri visualizzati presentano un legame con la lega, anche se nella maggior parte dei casi le proprietà repellenti di un polimero variano notevolmente tra le diverse specie batteriche testate. Questo riflette le ampie differenze nei meccanismi di adesione tra le varie specie. I polimeri a basso legame sono facilmente identificabili mediante confronto con l'agarosio.

I polimeri ad alto legame sono probabilmente identificabili in un array e possono essere utilizzati come controlli positivi per esperimenti successivi. Per i polimeri che non mostrano autofluorescenza nel canale DAPI, è possibile effettuare un confronto qualitativo delle immagini dei punti a occhio nudo. Sono stati eseguiti esperimenti in scala maggiore per testare il rivestimento di superfici più ampie, al fine di confermare le proprietà repulsive nei confronti dei batteri di 22 polimeri appropriati identificati.

Qui mostrati ci sono i campioni con le migliori prestazioni utilizzati per rivestire coprioggetti di vetro, analizzati mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Queste immagini mostrano sezioni di catetere analizzate mediante microscopia confocale e SEM. Entrambi i metodi microscopici offrono il vantaggio di permettere conte diretti delle cellule sulla superficie, fornendo dati inequivocabili poiché la riduzione dell'adesione cellulare è facilmente visibile.

Seguendo questa procedura, è possibile sottoporre a test il siero o i componenti del sangue per determinare il loro impatto sul legame batterico. Un modello animale potrebbe essere utilizzato per valutare il potenziale delle rivestimenti polimerici per l'uso clinico. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche e organismi patogeni può essere pericoloso.

E devono essere previsti controlli necessari durante la manipolazione e lo smaltimento per ridurre al minimo i rischi per la persona e per l'ambiente.