Antimicrobica caratterizzazione di materiali avanzati per applicazioni di Bioingegneria

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria dei materiali, come le proprietà antimicrobiche, che sono molto desiderabili per molte applicazioni di bioingegneria. Questa tecnica può essere utilizzata come protocollo coerente in tutti i laboratori per aiutare i ricercatori meno esperti che richiedono procedure dettagliate da seguire per ottenere risultati accurati. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a cercare protocolli antimicrobici e ci siamo resi conto che non esistevano protocolli dettagliati su questo in letteratura.

In questo studio, quattro materiali avanzati con diverse nature chimiche e un materiale di controllo, saranno testati per l'attività antimicrobica. Preparare ogni materiale tagliandolo in dischi di 10 mm di diametro. Successivamente, sterilizzare ogni campione mediante immersione in etanolo al 70% per 10 minuti, seguito da radiazioni ultraviolette per un'ora per lato.

Tre diversi microrganismi saranno utilizzati per testare l'attività antimicrobica dei materiali avanzati. I batteri gram positivi, Staphylococcus aureus, i batteri gram negativi, Escherichia coli, e il lievito, Candida albicans. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, risospendere alcune colonie di ciascun microrganismo in 25 ml di brodo di soia triptico, o TSB, contenuto in una provetta da centrifuga sterile.

Agitare per un minuto per ottenere una miscelazione uniforme. Misurare l'assorbanza a 540 nm per ogni coltura di microrganismi con uno spettrofotometro. Regolare la concentrazione di ciascun microrganismo su un numero adeguato di unità formanti colonie, o CFU per millilitro.

Agitare la sospensione microbica per cinque secondi per migliorare la dispersione del microrganismo e immergere brevemente un batuffolo di cotone sterile in questa sospensione microbica. Rimuovere il liquido in eccesso dal tampone premendo il tampone contro la parete della provetta contenente la coltura. Strisciare uniformemente ogni sospensione di brodo microbico con il batuffolo di cotone sterile sulla superficie di un agar di soia triptico, o piastra TSA, su tre piani per coprire l'intera superficie con il microrganismo.

Lasciare asciugare le piastre per cinque minuti dopo l'inoculazione. Lasciare le sospensioni di brodo microbico sul piano di lavoro per utilizzarle in seguito per controllare la concentrazione e la purezza della sospensione microbica. Sterilizzare un paio di pinzette immergendole in un bicchiere con etanolo al 96% e poi fiammeggiandole con un bruciatore ad alcool.

Utilizzare le pinzette sterili per posizionare i dischi campione da testare al centro delle piastre TSA. Incubare le piastre TSA in posizione capovolta a 37 gradi Celsius per 24 ore. Per analizzare i risultati del test di diffusione, misurare il diametro della zona di inibizione e il diametro del disco del campione con un calibro digitale o scattando una fotografia e utilizzando un software di elaborazione delle immagini adatto.

Questa procedura è necessaria per verificare che le concentrazioni microbiche determinate in precedenza siano corrette e garantire l'assenza di contaminazione microbica ambientale. Utilizzando una micropipetta con puntali autoclavati idonei e condizioni asettiche, erogare TSB sterile in provette sterili per microcentrifuga. Includi un campione che verrà utilizzato come controllo negativo.

Eseguire sei diluizioni seriali decimali con le sospensioni di brodo microbico utilizzate in precedenza per striare le piastre TSA. Utilizzando una spatola Drigalski pre-sterilizzata, stendere 100 l di ciascuna diluizione selezionata su una piastra TSA. Distribuire 100 l di terreno TSB senza microrganismi su una piastra TSA come controllo negativo.

Incubare le piastre TSA a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo, contare il numero di colonie per verificare che le CFU per millilitro siano simili a quelle determinate in precedenza. Controllare la piastra di controllo negativa per verificare che non vi sia contaminazione microbica ambientale.

Inizia questa procedura coltivando i diversi microrganismi da testare in TSB, in un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, misurare l'OD540 di ciascuna coltura notturna, quindi diluire ciascuna coltura in 20 mL di TSB in una provetta da centrifuga pre-sterilizzata da 50 mL a una concentrazione di circa dieci al sesto CFU per millilitro. Posizionare quattro dischi di ciascun tipo di materiale e quattro dischi di controllo in pozzetti separati di una piastra sterile a 48 pozzetti.

Pipettare 150 l di sospensione microbica su ciascuna superficie del disco. Incubare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo che la piastra a 48 pozzetti è stata incubata per 24 ore, pipettare 850 l di PBS sterile sulla superficie di ciascuno dei quattro dischi campione e dei quattro dischi di controllo e mescolarlo con la sospensione microbica.

Raccogliere ogni miscela di sospensione microbica PBS e ogni disco dalla piastra a 48 pozzetti e trasferirla in una provetta pre-sterilizzata da 15 mL. Agitare le miscele e i dischi di sospensione microbica PBS per un minuto. Sonicare a 50 Hz per cinque minuti e agitare di nuovo per un minuto per assicurarsi che nessun microrganismo vitale rimanga aderente alla superficie del materiale.

Eseguire diluizioni seriali decimali delle colture sonicate e delle provette sterili per microcentrifuga contenenti TSB. Distribuire 100 l di ciascuna diluizione su una piastra TSA e incubare le piastre aerobicamente a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, contare il numero di colonie ed esprimere questo numero in CFU per millilitro.

I risultati del metodo di contatto vengono quindi analizzati come descritto nel protocollo di testo. I risultati dei test di diffusione del disco di agar mostrano un'attività non antimicrobica per il primo materiale e un aumento dell'attività antibatterica contro S.aureus ed E.coli per gli altri tre materiali. Questo grafico mostra l'alone normalizzato per ogni disco materiale contro S.aureus ed E.coli dopo 24 ore di incubazione.

I risultati del metodo di contatto indicano anche un'attività non antimicrobica per il primo materiale e un aumento dell'attività antibatterica contro i batteri gram positivi e gram negativi per gli altri tre materiali. C è il batterio vitale recuperato dal disco di controllo dopo 24 ore di incubazione. Questo grafico mostra la percentuale di perdita di vitalità per i quattro materiali rispetto a S.aureus ed E.coli sulle superfici dei materiali.

Il campione M1 non ha mostrato attività antimicrobica. Sebbene non sia mostrato qui, nessuno dei quattro materiali è in grado di inibire la crescita del lievito, Candida albicans, con altri metodi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare l'attività antimicrobica con questi due metodi complementari.