Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

L'obiettivo generale di questo approccio è lo screening rapido e affidabile dei produttori di esopolisaccaridi microbici e l'identificazione della loro impronta digitale di carboidrati. Questo è un passo essenziale per utilizzare la diversità inesplorata degli esopolisaccaridi. Il nostro metodo può aiutare ad accelerare la ricerca sui polimeri nel campo degli esopolisaccaridi microbici.

Consente la rapida identificazione di nuove varianti di polisaccaridi con proprietà diverse per applicazioni specifiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è la combinazione di diversi sistemi di rilevamento degli esopolisaccaridi in un concetto di screening modulare e completamente automatizzato. Questo lo rende estremamente veloce e affidabile.

Questa tecnica può essere eseguita anche manualmente in laboratori in cui non è disponibile una piattaforma di automatizzazione, quindi il suo utilizzo è molto flessibile e può essere adattato alle diverse esigenze di screening. Questa piattaforma di screening degli esopolisaccaridi, o EPS, ha una configurazione modulare, che consente una separazione del protocollo in due parti principali, lo screening automatizzato e l'impronta digitale dei carboidrati. Il primo compito è quello di coltivare i ceppi per lo screening e rimuovere le cellule mediante centrifugazione.

I ceppi vengono coltivati su glucosio come fonte di carbonio in piastre a 96 pozzetti ricoperte da una pellicola sigillante traspirante su un micro agitatore per piastre di titolazione a 30 gradi Celsius e 1.000 giri/min. Il giorno dello schermo, preparare il piano di lavoro del robot e il carosello di stoccaggio come descritto nel testo del protocollo. Rimuovere la pellicola sigillante traspirante dalle piastre e allocare le colture principali nelle posizioni del carosello da 1-1 a 1-4.

Avviare il programma robotico automatizzato. Per rimuovere le cellule dopo la coltivazione, trasferire le piastre a pozzetti profondi della coltura principale dal carosello alla centrifuga e centrifugare a 4, 300 x g e 20 gradi Celsius per 30 minuti. Per la precipitazione prima della filtrazione, spostare le piastre per microtitolazione e le piastre per microtitolazione con indicatore di pH, dalla giostra al piano di lavoro.

Trasferire anche le piastre di filtrazione, che garantiscono la completa rimozione di tutte le cellule batteriche, insieme alle piastre di raccolta nelle posizioni del piano di lavoro. Dopo la centrifugazione, trasferire 180 microlitri del surnatante della coltura principale nella piastra di filtrazione. Aspirare 150 microlitri dal surnatante della coltura principale ed erogare 50 microlitri nella piastra del microtitolo per la precipitazione prima della filtrazione e 100 microlitri nella piastra dell'indicatore di pH.

La precipitazione del surnatante con 2-propanolo viene eseguita per valutare la produzione di EPS. Utilizzare una pipetta multifase da 12,5 millilitri per aggiungere manualmente 150 microlitri di 2-propanolo a ciascun pozzetto. Dopo aver agitato le piastre di microtitolazione a temperatura ambiente per 10 minuti a 900 giri/min, osservare visivamente le formazioni di fibre o scaglie che indicano la produzione di EPS.

Dopo che le piastre di coltura principali sono state riposte nella giostra, esaminare i brodi di fermentazione, che dovrebbero mostrare una sedimentazione ridotta dopo la centrifugazione. L'aumento della viscosità è un'altra indicazione della produzione di EPS. Il secondo compito è quello di garantire la completa rimozione delle cellule dal brodo di fermentazione viscoso tramite una filtrazione a 96 pozzetti.

Centrifugare le piastre di filtrazione a 3.000 x g e 20 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi riportare le piastre nella loro posizione iniziale del carosello ed eseguire l'equilibratura della gel-filtrazione come descritto nel testo del protocollo. Quindi, pipettare 35 microlitri di filtrato al centro della piastra di filtrazione in gel bilanciata e 50 microlitri alla piastra di microtitolazione utilizzata per la precipitazione.

Spostare le piastre di filtrazione del gel nella centrifuga e spostare tutte le altre piastre dal piano di lavoro alle posizioni iniziali nella giostra. Dopo aver riposto tutte le piastre nella giostra, prendere nota dei surnatanti altamente viscosi come indicato dai residui nella piastra filtrante. Una mancanza di filtrato può portare a risultati falsi negativi nei seguenti moduli analitici.

Il terzo compito dello screening automatizzato è la rimozione degli zuccheri monomerici rimanenti dal terreno di coltura tramite una filtrazione su gel a 96 pozzetti. Centrifugare le piastre di filtrazione in gel a 1.000 x g e 20 gradi Celsius per due minuti. Preparare il piano di lavoro tramite il manipolatore robotizzato per la lavorazione dei filtrati di gel.

Per rilevare il glucosio rimanente dopo la filtrazione su gel, utilizza puntali da 50 microlitri per trasferire 25 microlitri di acqua doppiamente distillata in una piastra di microtitolazione fresca. Aspirare 20 microlitri di acqua distillata doppiamente, cinque microlitri di aria e 5 microlitri di gel-filtrato ed erogare nella stessa piastra. Prelevare puntali da 200 microlitri e aspirare 50 microlitri di miscela di reagenti per il dosaggio del glucosio dalla posizione del piano di lavoro 1-2 per avviare il primo saggio.

Spostare le piastre di microtitolazione nell'incubatrice. Dopo 30 minuti di incubazione, spostare le piastre dall'incubatore al lettore di microtitolazione e registrare l'assorbanza a 418 e 480 nanometri. Per determinare il contenuto totale di carboidrati con il metodo dell'acido fenolo-solforico, pipettare 20 microlitri di gel-filtrato nelle piastre per microtitolazione.

Rimuovere manualmente le piastre dalla giostra e posizionarle nella stazione di movimentazione dei liquidi. Includere la piastra di calibrazione con 20 microlitri di diverse concentrazioni di glucosio in triplicati. Posizionare un contenitore per i rifiuti in posizione 1, una scatola per puntali da 300 microlitri in posizione 2 e un trogolo da 250 millilitri con 110 millilitri di acido fenolo-solforico appena preparato in posizione 3.

Utilizzare una pipetta a 8 canali con puntali da 300 microlitri per trasferire 180 microlitri di acido fenolo-solforico in ciascuna fila di tutte le piastre. Coprire tutte le micro piastre di titolazione con i coperchi e mescolare agitando per cinque minuti a 900 giri/min a temperatura ambiente. Incubare per 35 minuti a 80 gradi Celsius in forno per la reazione del colore.

Dopo aver raffreddato le piastre sotto una cappa aspirante, misurare l'estinzione a 480 nanometri. I ceppi provenienti dallo screening automatizzato sono designati come EPS-positivi se soddisfano almeno due dei seguenti tre criteri. Controllo della viscosità, rilevamento del polimero e calcolo del glucosio equivalente.

L'equivalente di glucosio viene calcolato utilizzando questa equazione. L'impronta digitale dei carboidrati della piattaforma di screening contiene le ultime tre attività che vengono eseguite manualmente. Il filtrato rimanente dei risultati positivi del secondo compito fornisce la base per il gel-filtrato del quinto compito.

Il sesto compito è la microidolisi a 96 pozzetti del gel-filtrato. A tale scopo, utilizzare prima una pipetta a 12 canali da 50 microlitri per trasferire 20 microlitri di gel-filtrato su una nuova piastra per PCR. Quindi utilizzare una pipetta multifase da 1,25 millilitri per aggiungere 20 microlitri di acido trifluoroacetico a quattro molari in ciascun pozzetto.

Coprire la piastra PCR con un tappetino in elastomero termoplastico e posizionare la piastra PCR in uno speciale dispositivo di serraggio. Miscelare le soluzioni invertendo il dispositivo di serraggio 10 volte. Dopo aver centrifugato la piastra per PCR e averla fissata nel dispositivo di bloccaggio, posizionare il dispositivo di bloccaggio fissato in un bagno di sabbia preriscaldato e incubare a 121 gradi Celsius per 90 minuti.

Utilizzando una pipetta a 12 canali da 200 microlitri, aggiungere una soluzione di ammoniaca al 3,2% per regolare il pH a circa otto. Coprire la piastra PCR con un tappetino in elastomero termoplastico e agitarla manualmente utilizzando il dispositivo di bloccaggio. Il compito finale consiste nell'analizzare l'impronta digitale dei carboidrati tramite il metodo HTPMP (1-fenil-3-metil-5-pirazolone) ad alto rendimento.

Per iniziare questa procedura, utilizzare una pipetta a 12 canali da 50 microlitri per trasferire 25 microlitri di idrolizzato neutralizzato in una nuova piastra PCR. Aggiungere 75 microlitri di reagente-miscela di derivatizzazione e coprire la piastra con un tappetino in elastomero termoplastico. Posizionare la piastra per PCR in un ciclatore per PCR a 70 gradi Celsius per 100 minuti, quindi raffreddarla a 20 gradi Celsius.

Trasferire un'aliquota da 20 microlitri in una nuova piastra per microtitolazione, quindi utilizzare una pipetta a 12 canali da 200 microlitri per aggiungere 130 microlitri di acido acetico da 19,23 millimolari a ciascuna linea. Miscelare direttamente tramite aspirazione ed erogazione almeno sei volte e trasferire tutto il liquido in una piastra filtrante da 0,2 micrometri con una piastra di raccolta del microtitolo. Centrifugare la piastra a 1.000 x g per cinque minuti, rimuovere la piastra filtrante e sigillare la piastra di raccolta del microtitolo con un tappetino in silicone.

Posizionare la piastra del micro titolo nell'UHPLC-UV-ESI-MS per la determinazione dell'impronta digitale dei carboidrati. Questa tabella mostra i risultati di tre nuovi ceppi esemplari identificati con successo con questa piattaforma di screening. Nella parte sinistra della tabella vengono visualizzati i risultati dei moduli di screening automatizzati relativi alla formazione della viscosità, alla produzione di polimeri e all'equivalente di glucosio dall'idrolisi totale, che sono stati utilizzati come parametri di valutazione per l'analisi dettagliata delle impronte digitali dei carboidrati.

L'impronta digitale dei carboidrati basata su zuccheri calibrati, zuccheri sconosciuti, dimeri e sostituenti è riportata nella parte destra della tabella. Utilizzando queste informazioni, la composizione monomerica può essere calcolata e confrontata con strutture polimeriche già note. Inoltre, può essere eseguito uno screening mirato per interessanti composizioni monomeriche e carboidrati rari.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita per 386 varietà in sole cinque ore. A seguito di questa procedura, possono essere inclusi ulteriori saggi come il piruvato già esistente o ulteriori saggi per acetati o fosfato per rispondere a ulteriori domande sulla dichiarazione degli esopolisaccaridi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica, grazie alla sua elevata sensibilità, ha aperto la strada alla nostra ricerca nel campo dei produttori di esopolisaccaridi microbici geneticamente ingegnerizzati per esplorare l'effetto di vie biosintetiche esopolisaccaridiche alterate sulla struttura chimica residente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare nuovi produttori di esopolisaccaridi in modo molto veloce e affidabile.