I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre materiali biomimetici costituiti da aderenze ricombinanti pure, accoppiate a perle di polistirene, che possono quindi essere utilizzate per sezionare le interazioni biochimiche e funzionali tra le singole aderenze batteriche e i recettori della cellula ospite. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni tra patogeni e ospiti, come la misurazione degli effetti sulla segnalazione delle cellule ospiti e l'inibizione della citotossicità mediata dai patogeni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le aderenze purificate, a AEA, sono accoppiate direzionalmente e covalentemente a particelle polimeriche di dimensioni simili ai batteri e quindi imitano la visualizzazione della superficie batterica.

A dimostrare la procedura con me sarà TU A-C-E-D-A uno studente di dottorato del nostro laboratorio. L'accoppiamento direzionale dell'ammina Thal sarà dimostrato qui. Questo protocollo è adatto per l'accoppiamento di proteine contenenti cistina a perle polimeriche funzionalizzate con ammina utilizzando succinile SUL per p meli fenil butirrato, o SMPB Come agente reticolante, preparare tutti i reagenti necessari appena prima dell'uso come descritto nel testo del protocollo per iniziare la procedura per l'attivazione delle microsfere.

Miscelare una sospensione a perline invertendo delicatamente e quindi trasferire la quantità richiesta di sospensione a perline in un tubo sterile da 1,5 millilitri. Contenente un millilitro di PBS pH 7.0 sterile, pipettare delicatamente su e giù per lavare le perle e il pellet mediante centrifugazione in una microcentrifuga. Enorme rimuovere con cura la trappola con una pipetta e una cicatrice.

Reese sospende il pellet di perline in un millilitro di PBS sterile fresco e ripete la fase di lavaggio. Risospendere il pallino di perline. In 0,8 millilitri di PBS aggiungere 200 microlitri di SFO SMPB da 10 millimolari appena preparato.

Per ottenere una concentrazione finale di due millimolari, incubare la sospensione di perle per un'ora a 25 gradi Celsius su una ruota rotante mentre le perle sono in incubazione. Preparare la proteina per la successiva fase di accoppiamento in modo che possa essere immediatamente aggiunta alle perle attivate. Controllare la concentrazione proteica e regolarla alla concentrazione finale richiesta per la reazione di accoppiamento. Sei.

Per la riduzione delle proteine vengono solitamente utilizzati micromolari di proteine e PBS e un volume di un millilitro. Aggiungere una soluzione madre di TEP per ottenere una concentrazione finale di cinque millimolari. Incubare la soluzione per 30 minuti A temperatura ambiente, conservare alcuni microlitri della soluzione proteica per determinare la concentrazione proteica iniziale e un calcolo dell'efficienza di accoppiamento.

Avviare la procedura di accoppiamento delle proteine pellettando le perle attivate e lavando il pellet. Una volta in un millilitro di PBS fresco e sterile, risospendere il pellet nella soluzione proteica preparata per ottenere la concentrazione proteica desiderata. Incubare la sospensione di microsfere proteiche per due ore a 25 gradi Celsius su una ruota rotante Dopo due ore, disattivare i restanti gruppi attivati sulle perle aggiungendo una soluzione madre di Sistine a una concentrazione finale di 50 millimolari e incubando in sospensione per 30 minuti a 25 gradi Celsius su una ruota rotante.

Ha trattenuto le perle mediante centrifugazione. Conservare la bocchetta per determinare la concentrazione proteica e calcolare l'efficienza di accoppiamento. Lavare il pellet di perline due volte con un millilitro di PBS e Resus bend e un millilitro di PBS fresco per dare il prodotto finale un giorno prima del test di competizione seminare ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con un millilitro di cellule hela a una concentrazione di 150.000 cellule per millilitro.

Ciò consentirà alle cellule di raggiungere circa l'80% di fluenza di co prima di iniziare l'esperimento. Inoculare una coltura marina LB da cinque millilitri con una colonia fresca di V para emolitico e crescere durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Preparare una quantità sufficiente di molecola di adesione multivalente accoppiata a microsfere come dimostrato in precedenza.

Consentire 100 microlitri di 10 perline per pozzetto o una concentrazione finale di 500 nanomolari di proteine il giorno del test di gara. Misurare l'OD 600 della coltura batterica. Preparare i terreni di infezione diluendo le colture batteriche in DMM incolore senza additivi.

Preriscaldare a 37 gradi Celsius contenente il 10% di sospensione da volume a volume di battito. Per ottenere un MOI di 10, preparare un millilitro per pozzetto e dal 10 al 20% di volume in eccesso per campione. Togliete il vecchio terreno dai pozzetti e lavate il fermentato.

Guarire le cellule aggiungendo a ciascun pozzetto un millilitro di preriscaldamento PBS sterile a 37 gradi Celsius. Rimuovere il PBS e aggiungere un millilitro di terreno di infezione per pozzetto. Aggiungere soluzioni contenenti perline di controllo e batteri come controlli positivi e perline di adesione e nessun batterio come negativo. Controlli.

Aggiungere il multimetro multipolare contenente lo 0,1% di TRITTON X 100 come controlli di lisi. Imposta ogni condizione sperimentale, inclusi i controlli triplicati. Incubare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius per il tempo desiderato.

Viene valutata la citotossicità. Quattro ore dopo l'infezione. Rimuovere 200 microlitri da ciascun pozzetto utilizzato nella piastra da 24 pozzetti e trasferirli in una nuova piastra da 96 pozzetti.

Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 1.500 g per cinque minuti e trasferire 100 microlitri da ciascun pozzetto in una nuova piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri del terreno utilizzato durante gli esperimenti di infezione a tre pozzetti freschi della piastra da 96 pozzetti da utilizzare come spazi vuoti. Eseguire il test di rilascio della lattato deidrogenasi utilizzando un kit di rilevamento della citotossicità LDH e seguendo le istruzioni del produttore.

Innanzitutto, calcola la quantità di reagente necessaria con incrementi di 25. Ad esempio, per 100 campioni. Mescolare 11,25 millilitri di reagente A con 250 microlitri di reagente B capovolto per evitare la formazione di schiuma e non vortici.

Quindi, metti la miscela in un serbatoio. Quindi aggiungere 100 microlitri della miscela di reagenti a ciascun campione e incubare la piastra a temperatura ambiente a 10, 20 e 30 minuti. Leggere l'assorbanza a 490 nanometri su un lettore di piastre.

Successivamente, calcolare la percentuale di citotossicità, come descritto nel manoscritto, le misurazioni dell'adesione batterica vengono effettuate un'ora dopo l'infezione. Rimuovere il terreno dallo strato cellulare e lavare accuratamente lo strato cellulare con PBS sterile di preriscaldamento per rimuovere eventuali cellule non attaccate. Lavare almeno tre o quattro volte con un millilitro di PBS ogni volta che si liscia sulle cellule ospiti aggiungendo a ciascun pozzetto un millilitro di una soluzione sterile di Triton X 100 all'1% in volume in PBS, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Pipettare ogni campione su e giù più volte prima di trasferire il contenuto di ciascun pozzetto per separarlo. Provette da 1,5 millilitri. Preparare diluizioni seriali decuplicate dei campioni in una piastra PBS sterile, 100 microlitri di ciascun campione su agar LB marino e distribuire utilizzando uno spandiconcime di cellule, ottimizzare la diluizione su piastra a seconda dei ceppi batterici e del punto temporale per questa configurazione sperimentale.

Una diluizione da 10 a 5 o da 10 a sesta piega darà un numero adeguato di CFU. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte del giorno successivo, enumerare i batteri contando le colonie. Nei test di competizione, le cellule heela sono state infettate con il ceppo paraemolitico V.

Scarso indicato con positivo o lasciato non infetto in presenza di diverse entità concorrenti. L'infezione in vitro con uno scarso ha provocato livelli molto elevati di lisi cellulare che è stata inibita da MAM sette perle accoppiate, ma non da MA'AM una accoppiata o GST. Enumerazione del paralitico v attaccato a cellule HELOC non trattate o a cellule incubate con MAM.

Sette perle di controllo MAM one o GST hanno rivelato che MAM. Sette perline ma non MAM uno o perline di controllo GST. Superare il para emolitico per l'attaccamento ai recettori della superficie cellulare ospite.

Aderenze accoppiate al fluoro. Quattro perle marcate possono imitare l'adesione batterica alle cellule ospiti e sono potenti strumenti per l'imaging cellulare. Il tubo a destra contiene una sospensione di perle biomimetiche blu fluorescenti. Mam.

Sette perle blu fluorescenti accoppiate sono state utilizzate per caratterizzare il processo di attaccamento mediato da MAM sette alle cellule epiteliali. L'attaccamento di MAM seven alle cellule ospiti ha provocato riarrangiamenti di actina e la formazione di fibre di stress che sono state visualizzate utilizzando Rumine Phin per colorare la f actina. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la purificazione per affinità abbinata alla proteomica o al western blot per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quali fattori cellulari dell'ospite sono coinvolti nei processi di segnalazione a valle dell'attaccamento batterico.