Name: Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri la microscopia a forza atomica in modulazione di ampiezza per ottenere risoluzione sub-nanometrica in liquido. Questo metodo ottimizza i parametri di imaging su AFM commerciali standard per ricerche in biologia, fisica e scienza dei materiali.

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Il finanziamento previsto dal Ingegneria e Scienze Fisiche Research Council (sovvenzioni 1.452.230 e EP / M023915 / 1), Biotecnologia e Scienze Biologiche Research Council (Grant BB / M024830 / 1) e del Consiglio europeo (7 ° PQ CIG 631.186) sono ringrazia.

1. Pulizia degli attrezzi e altre superfici NOTA: quando l&#39;obiettivo per alta risoluzione, qualsiasi forma di contaminazione può avere conseguenze dannose. È pertanto necessario garantire che tutti gli strumenti utilizzati per manipolare il campione, punte substrato o AFM sono accuratamente puliti. Quanto segue si applica a qualsiasi superficie o lo strumento (ad esempio, pinzette) che possono entrare in contatto con il campione, a sbalzo, o cella AFM, compresa la fase di campione stesso. <ol><li> Bagno-ultrasuoni gli strumenti in acqua ultrapura (18,2 MW, &lt;5 organici ppm), seguita da isopropanolo (99,7% di purezza), seguita da acqua di nuovo ultrapura, ciascuno per 10 minuti. Se possibile, utilizzare isopropanolo sotto una cappa aspirante per ridurre l&#39;inalazione di fumi. </li><li> Secco sotto flusso di azoto. </li><li> Se full immersion non è possibile (ad esempio, per il supporto a sbalzo / elettronica), fisicamente pulire la superficie da pulire con un solo strato, tessuti basso rilascio di fibre (tessuti leggeri tergicristalli) imbevuto di ultrapuri acqua, isopropanolo e acqua ultrapura, in modo sequenziale. Lasciare asciugare la superficie in aria (di solito entro 15 a 30 minuti). </li></ol> 2. Preparazione del substrato NOTA: Il substrato indica la superficie solida di supporto direttamente i campioni, tipicamente in contatto fisico sia con lo scanner AFM e il campione. La maggior parte AFMs hanno un supporto magnetico e dischi in acciaio possono essere usati, ma lo stesso protocollo è adatto anche per sottofondi come vetrini. Qui si assume un disco in acciaio sulla quale figura un disco mica. L&#39;obiettivo di questa procedura è quello di limitare il più possibile fonti esterne di contaminazione che possono influenzare l&#39;imaging. I guanti devono essere indossati in ogni momento. <ol><li> Bath-Sonicare disco campione di acciaio in acqua ultrapura (18,2 MW), seguita da isopropanolo, ed infine con acqua ultrapura nuovo, ciascuno per 10 min. </li><li> Essiccare i dischi sotto un flusso di azoto. </li><li> Preparare una piccola quantità di colla epossidica con i reagenti mescolati a fondo e posto ~ 1081; l sul disco in acciaio. </li><li> Fissare il substrato (mica muscovite, SiO 2 cristallo, vetro, etc.) al disco in acciaio applicando pressione sul substrato. Lasciare che la resina epossidica per la cura per diverse ore ad una temperatura elevata (vedere indicazioni del costruttore). </li><li> Assicurarsi che nessun epossidico è direttamente esposta all&#39;aria, intorno ai bordi del substrato. Questo avverrà se eccessiva quantità di resina epossidica viene utilizzato e può diventare una fonte di contaminazione. <ol><li> Per un substrato di mica, premere saldamente ~ nastro adesivo larghezza 2,5 cm sul substrato, in modo che tutto il viso è coperto, ed uniformemente sfilarlo. Usare nastro leggermente adesivo e staccare la mica tirando parallelo alla superficie. Il materiale rimosso è visibile sul nastro. Ripetere questo processo 2-3 volte, fino a che la mica è liscio come uno specchio per gli occhi. </li><li> Per il vetro / SiO 2, se è necessaria un&#39;ulteriore modifica della superficie chimica, ripetere la routine vasca da sonicazione di passi 2.1-2.2. In alternativa, utilizzare Uunità di esposizione V (18 W lampade UV-C germicida) per 30-60 minuti, a seconda della potenza) per pirolizzare eventuali sostanze organiche che possono essere lasciati sulla superficie. Questa procedura rende anche la superficie più idrofila senza aumentare significativamente rugosità. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di sbalzo e Tip <ol><li> Immergere il chip cantilever in un bagno di isopropanolo, seguito da acqua ultrapura, ciascuno per 60 min. </li><li> Se la mensola / punta richiede una pulizia (ad esempio, dopo una conservazione prolungata in scatola gel), aggiungere un 30 min ammollo in acetone (&gt; 99,5% di purezza) prima del punto 1 (vedi anche la sezione di indirizzamento contaminazione). Lo stoccaggio di punte in scatole gel è, nella nostra esperienza, una fonte primaria di contaminazione che può avvenire molto rapidamente 59. </li><li> Esporre la punta UV brevemente leggeri (&lt;5 min) per favorire la formazione di siti idratazione stabili 60. Evitare tempi di sovraesposizione più lunghi in quanto può danneggiare la punta o incRease suo raggio di curvatura. </li><li> Inserire il cantilever nel supporto e pipetta del AFM cantilever ~ 50 ml di soluzione di imaging (la natura della soluzione dipenderà campione oggetto di indagine, ma in questo caso utilizzare una soluzione 10 mM di cloruro di rubidio in acqua ultrapura) sulla mensola e punta di pre-bagnato; questo limiterà la comparsa di bolle d&#39;aria quando si avvicina il campione. </li></ol> 4. Set-up di AFM cellulare <ol><li> Montare il disco del campione e il substrato sul palco del campione e aggiungere una goccia di liquido di imaging (liquido tipicamente 2-3 mm di spessore nel punto più alto). </li><li> Collegare il supporto cantilever per l&#39;AFM. </li><li> Portare il cantilever e campione in prossimità in modo da formare un ponte tra i fluidi capillare sul cantilever / punta e campione. </li></ol> 5. Inizializzazione misurazione e calibrazione di sbalzo <ol><li> Allineare il laser di misurazione (di solito rosso) vicino alla punta-end del cantilever. A seconda del modello AFM, farlo sia tramite comandi software o mediante regolazione manuale della posizione del laser. Acquisire spettro termica del cantilever in liquido (vedere Figura 1A). Il processo registra le fluttuazioni termiche del cantilever utilizzando il laser, al fine di trovare la frequenza di risonanza principale del cantilever (modi propri fondamentale). Nella maggior parte AFM moderno, questo viene fatto attraverso procedure automatizzate nei controlli del software, ma i dettagli possono variare da AFM a AFM. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig1.jpg" /> Figura 1: Ottimizzazione e calibrare il cantilever. A: spettro di rumore termico di deflessione verticale della mensola (nero) con una semplice misura oscillatore armonico (SHO) del modi propri fondamentali (rosso). Qui la risonanza è 18,7 kHz in acqua. Le prime tre frequenze di risonanza corrispondenti ai primi tre modi di vibrare di flessione sono highlighted con le frecce blu. B: Calibrazione di Leva Sensibilità Inverse ottico del cantilever. La deformazione lineare del cantilever premuto contro una superficie rigida (indeformabile) è utilizzato per misurare il fattore di conversione (InvOLS) tra deformazione misurata in volt e il corrispondente valore in nanometri. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="2"><li> Registrare una deflessione curva della distanza con il sbalzo su un substrato rigido (ad esempio, mica o vetro) e calibrare la deflessione imponendo che la pendenza della curva nella regione di deflessione lineare (come in Figura 1B) è l&#39;unità 61 - 63. NOTA: Questo processo trova il fattore di conversione tra la deformazione misurata sul fotorivelatore (in volt) e la reale deflessione del cantilever (in nanometri) - known come l&#39;inverso Optical leva Sensibilità (InvOLS). La calibrazione può danneggiare la punta, quindi è meglio per condurre dopo tutte le misurazioni sono state completate. Utilizzare il valore InvOLS derivato per un&#39;altra sbalzo dello stesso tipo durante un precedente esperimento per ottenere una stima (tipicamente&gt; 90% esatto) della ampiezza reale prima della calibrazione. </li><li> Montare il picco di risonanza nello spettro termico con un semplice armonico modello di oscillatore 64-66 a cedere la costante elastica del cantilever. Questa procedura è automatizzata in maggior parte dei software AFM e di solito non richiede conoscenze specialistiche del modello in questione. </li><li> Tune il cantilever. Trova la risposta di ampiezza del cantilever volta guidato esternamente (ad esempio, acusticamente o fototermica eccitazione) su una gamma di frequenze vicine alla frequenza di risonanza nominale. Impostare la frequenza di guida al vicino al massimo in questo spettro, leggermente a sinistra. Se la mensola è Acoustically guidato, molti massimi spuria può apparire quando la sintonizzazione. <ol><li> Selezionare un picco di risonanza più vicino possibile (e nel campo del) la risonanza identificato nello spettro termico utilizzando il software di controllo del AFM ma specifiche può dipendere dal tipo di software e versione che controlla l&#39;AFM. </li></ol></li></ol> 6. Approccio e Controllo iniziale del Campione <ol><li> Impostare l&#39;ampiezza di guida in modo che l&#39;ampiezza di oscillazione libera è di circa 5 nm. Ciò corrisponde in genere a 0,2-0,8 V sulla maggior parte AFMs (nel caso in cui le InvOLS non è calibrato). Regolare il setpoint di ampiezza al ~ 80% dell&#39;ampiezza libera. </li><li> Impostare i guadagni di retroazione relativamente alto (il valore assoluto dipende dalla AFM), ma garantire che non si verifichino instabilità o squilla. </li><li> Impostare la velocità di scansione iniziale e la dimensione di scansione per valori piccoli (ad esempio, rispettivamente a ~ 1 Hz e 10 nm). Questo aiuta a preservare la punta nel caso in cui sono scarsamente regolati alcuni parametri di feedbackevitando la scansione su grandi distanze. Il formato di scansione può essere successivamente aumentato ad un valore maggiore (ad esempio, 100 nm) se le condizioni di scansione appaiono idonei. </li><li> Determinare l&#39;altezza approssimativa della superficie (in alcuni casi questo deve essere fatto otticamente) prima del metodo. </li><li> Avviare approccio della punta alla superficie utilizzando il software di controllo AFM. I dettagli di questo processo dipenderanno dal modello di AFM e software utilizzati. <ol><li> Se ci sono problemi con l&#39;approccio quando si utilizza un cantilever morbido, condurre l&#39;approccio in modalità contatto. In questo caso, in modo che i guadagni sono inferiori a quelli in modalità AM, e impostare il valore di riferimento ad un valore relativamente basso (0,1-0,2 V dopo il centraggio del laser sul fotorivelatore) per preservare la punta. </li><li> Valutare se la punta ha raggiunto la superficie senza iniziare a immagine cambiando leggermente il valore di setpoint (aumento della modalità di contatto o diminuzione in modalità AM). Se la punta è in superficie, l&#39;effetto sulla tha estensione della Z-piezo dovrebbe essere trascurabile. I movimenti vivi delle Z-piezo sono generalmente rappresentati graficamente nel software di controllo di più AFM. Se la variazione setpoint innesca un movimento visibile del piezo, questo indica una falsa impegnarsi. In quest&#39;ultimo caso, riavviare l&#39;approccio della posizione della punta corrente, utilizzando una leggermente superiore (contatto) o inferiore setpoint (AM). </li></ol></li><li> Una volta che la punta ha raggiunto la superficie, ritrarre la Z-piezo (di solito con la semplice pressione &#39;Stop&#39;) e risintonizzare il cantilever (ripetere il passaggio 5.4.); la frequenza di risonanza sarà probabilmente hanno spostato su un valore inferiore a causa di interazioni punta-campione. </li><li> Modificare il set point al ~ 80% dell&#39;ampiezza libera di recente accordato (a questa distanza punta-campione). </li><li> Inserire la mensola e condurre un 10 × 10 nm 2 scansione della superficie in modo AM per verificare che i parametri di imaging sono adatti. <ol><li> Verificare che la traccia (scansione da sinistra a destra) e ripercorrere (destra scansione a sinistra)profili sovrappongono. Se non altrimenti ridurre il valore di riferimento e provare ad aumentare il guadagno. </li><li> Abbassare i guadagni se l&#39;immagine diventa rumoroso. </li></ol></li><li> Ripetere l&#39;operazione con una grande - 1 × 1 micron 2 a 5 × 5 micron 2 - scansione del campione purché ciò sia possibile. Su campioni morbidi o biologici, ciò potrebbe comportare una contaminazione della punta. </li></ol> 7. ad alta risoluzione Imaging <ol><li> Ridurre il formato di scansione su un valore adatto per la visualizzazione delle caratteristiche (ad esempio, 100 × 100 nm 2 per cristalli proteici o 20 × 20 nm 2 per mica o di calcite). </li><li> Ridurre l&#39;ampiezza azionamento del cantilever sufficiente per il circuito di retroazione per ritrarre automaticamente il Z-piezo e quindi la punta dalla superficie. Mentre il cantilever è lontano dalla superficie, regolare l&#39;ampiezza azionamento in modo che l&#39;ampiezza cantilever è ~ 1-2 nm (picco-picco). </li><li> Utilizzando il software di controllo AFM, Progressivamente ridurre il setpoint alcune decine di mV alla volta fino al Z-piezo estende di nuovo verso la superficie e l&#39;immagine originale viene recuperato. Mantenere l&#39;ampiezza setpoint tra il 75% e il 95% della nuova ampiezza libera. </li><li> Regolare i guadagni utilizzando il software di controllo AFM; guadagni più elevati possono essere utilizzati ad ampiezze inferiori senza introdurre rumore significativo. <ol><li> Ripetere la 7,2-7,4 passaggi in modo da determinare la migliore combinazione di libera ampiezza setpoint e ottenere per alta risoluzione. Le condizioni ottimali dipendono campione (paesaggio solvatazione e proprietà bagnanti del liquido), ma anche cantilever (costante elastica, rigidità). </li><li> Esplora diverse combinazioni di ampiezze per ottimizzare le condizioni di imaging. Può essere necessario aumentare di nuovo l&#39;ampiezza libera 42. In tal caso, regolare prima il setpoint per un valore maggiore e quindi aumentare l&#39;azionamento (cioè, procedura inversa rispetto utilizzato per diminuire l&#39;ampiezza). </li><li> Tenere il setpoint ampiezza nella gamma di 0,5 nm - 1,5 nm (picco a picco) con rapporti setpoint mantenuto sopra 0,7 (tipicamente 0,75-0,95). Per le interfacce solvophilic, usare sbalzo con una costante elastica di 0,5 - 2 N / m. Questo è sufficiente per la punta per rimuovere la maggior parte del liquido interfacciale senza colpire la superficie. Una regola empirica è proposto in eq. 4 di riferimento 29. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Supponendo che il liquido imaging e la rigidità cantilever sono stati selezionati opportunamente, le fasi più critiche per la riuscita-alta risoluzione sono la regolazione dell&#39;ampiezza di imaging e la pulizia generale del sistema investigato. Ampiezze paragonabile allo spessore della regione interfacciale liquido (tipicamente inferiore a 2 nm) Sonde principalmente variazione delle proprietà del interfacciale solvente 42. Se l&#39;ampiezza di oscillazione è troppo grande, la punta vibrante attraverserà a lungo raggio, campi di forza non lineari 52 che precludono la stabilità del movimento cantilever, e inevitabilmente colpito il campione indipendentemente dalle condizioni di imaging 29, con conseguente deterioramento della risoluzione. A parte la perdita di risoluzione, armoniche superiori cominciano ad apparire nel movimento punta e il sistema diventa più complicato per modellare 55. In alternativa, se l&#39;ampiezza di imaging è troppo piccola oparte nly dell&#39;interfaccia è sondato (tipicamente strati specifici del liquido interfacciale) e l&#39;imaging stabile può essere raggiunto solo con cantilever rigidi (&gt; 10 N / m in acqua 53) per un soddisfacente rapporto segnale-rumore, con il rischio di campioni morbidi dannosi su grandi variazioni di altezza. La necessità di cantilever rigide è quello di superare il rumore termico che può diventare più significativo che il segnale misurato Quando si lavora con piccole ampiezze, le interazioni a lungo raggio tra la punta e il campione sono ancora presenti, ma sono in gran parte costante e non influenzano la ad alta risoluzione di contrasto nelle immagini ottenute. Pulizia dell&#39;ambiente imaging è di fondamentale importanza quando si tratta di alta risoluzione AFM. composti indesiderati nel sistema possono interferire con sia l&#39;imaging e la spettroscopia di forza. Ci sono due categorie principali di contaminazioni che tendono ad incidere esperimenti: (i) i contaminanti direttamente visibile quando l&#39;imaging ( <strong&gt; Figura 4B, 4C) e (ii) generale inspiegabile mancanza di alta risoluzione. Caso (i) tende a verificarsi solo in sistemi altamente idealizzate come all&#39;interfaccia acqua-mica dove aggregati molecolari adsorbiti che interferiscono con le interazioni punta-campione sono chiaramente in contrasto contro la superficie mica atomicamente piatta (Figura 4A). Prima di sostituire la punta e il campione, vale la pena acquisire curve spettroscopiche con una grande deformazione, efficace premendo forte la punta contro il campione ripetutamente. Questo normalmente danneggiare una nuova punta, ma può di tanto in tanto pulire un suggerimento sporco o indurre siti di idratazione stabili idonei per l&#39;imaging. Questo suggerimento, tuttavia, inevitabilmente attenuato e quindi essere adatto solo per il campione piatto, anche se la formazione immagine migliora. In caso di sospetta contaminazione su campioni rigidi, può valere la pena cercare di immagine con il secondo dei modi propri del cantilever, prima di eseguire la procedura in qualche modo distruttivo descritto sopra. Ciò richiede semplicemente swprurito la frequenza di guida per il secondo dei modi propri e riaggiustare l&#39;ampiezza / setpoint (vedi la discussione sulla risoluzione dei problemi di seguito). La rigidità efficace degli aumenti a sbalzo considerevolmente quando operava al secondo modi propri e di qualsiasi contaminante debolmente adsorbito può essere spinto via dalla punta mentre imaging. Questa strategia non sostituisce la necessità di un campione pulito e punta, ma offre alcune ulteriori possibilità di acquisire immagini soddisfacenti quando una punta / campione non è chiaramente l&#39;ideale. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig4.jpg" /> Figura 4: Esempi di contaminazione osservata quando l&#39;imaging mica muscovite che inibiscono l&#39;imaging ad alta risoluzione. A: Mica ripreso in 5 mM rbcL - particelle contaminanti sono visibili. B: La contaminazione assumendo la forma di aggregati dell&#39;ordine di decine di nanometri attraverso mentre l&#39;imaging in acqua ultrapura nominalmente. C: strutture auto-assemblate formate da contaminazioneparticelle Nant presumibilmente anfifilici in natura. Imaging è stato nuovamente condotto in acqua ultrapura nominalmente. D: sezioni sfalsate verticalmente corrispondenti alle linee tratteggiate in A, B e C illustrano la deviazione dalla superficie atomicamente piatta di mica. Barre di scala in A, B e C corrispondono a 300 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Caso (ii) è più comune e caratterizzata principalmente dal fatto frustrante che le caratteristiche sub-nanometrica semplicemente non possono essere risolte, indipendentemente dalle condizioni di imaging. La firma di questo tipo di situazione è di solito visibile in misura spettroscopia di forza che tendono a mostrare alcune incongruenze. Questi possono includere le curve scarsamente riproducibile e ampiezza vs curve a distanza che si discostano significativamente da una tipica forma sigmoidale 42. Se contaminanti, ionici o di altro tipo, sono Dispersed omogeneo per tutto il fluido, non possono presentarsi nella diagnostica per immagini topografica, ma potrebbe disturbare la struttura idratazione del campione 69, che è fondamentale per il mantenimento di un normale interazione punta-campione 29 e l&#39;ottenimento di alta risoluzione 70. Ci possono essere anche effetti diretti dei contaminanti sul campione, soprattutto in morbido, esperimenti biologici. Ad esempio, è noto che la presenza di alcoli (dalla procedura di pulizia) può fluidificare gel-fase lipidica bistrati 71 - 73, rendendo impossibile risoluzione livello sub-nanometri. Se ad alta risoluzione non è possibile, occorre prima presa nel processo di pulizia, concentrandosi in particolare su qualsiasi apparecchiatura che entra in contatto con la soluzione di imaging. composti Anche apparentemente stabili come la resina epossidica può solvato nella parte fluidi se non completamente indurito. Imaging ad alta risoluzione con AM-AFM è esigente, richiede pazienza espesso diverse prove prima di raggiungere le migliori condizioni di imaging possibili. Piccoli problemi sperimentali possono facilmente diventare abbastanza importante per impedire ad alta risoluzione e la risoluzione dei problemi abilità sono essenziali. Qui di seguito elenchiamo alcuni dei problemi più comuni che abbiamo incontrato con la nostra soluzione proposta. messa a punto a sbalzo La maggior parte dei AFMs commerciali usano eccitazione acustica per guidare il cantilever. In tal caso, messa a punto del cantilever, come descritto nel passaggio 5.4, in prossimità della sua frequenza di risonanza spesso fornisce prestazioni sufficienti per il funzionamento in aria. In ambienti liquidi, il liquido tende a indurre alcuni accoppiamento tra le varie parti meccaniche del AFM come circuito integrato a sbalzo e supporto. Questo può influenzare la risonanza apparente del cantilever, spesso illustrato da uno spettro di frequenza sbalzo che presenta molti picchi taglienti e valli comunemente descritti come &quot;foresta dei picchi&quot;. Come risultato, è spesso difficile trovare corrisponfrequenza di azionamento ct. Questi picchi esistono anche in ambienti di gas, ma a causa del valore elevato fattore di qualità del cantilever, l&#39;ampiezza a risonanze è considerevolmente più grande 74,75. Nel liquido selezionando il picco appropriato per guidare il cantilever può non essere facile e può richiedere tentativi ed errori. In pratica, il picco di frequenza con variazione più ripida ampiezza nella &quot;foresta dei picchi&quot; attorno alla frequenza di risonanza è di solito la cosa migliore pur non essendo necessariamente esattamente sulla risonanza e spesso fornisce una frequenza di pilotaggio adeguata per ottenere immagini ad alta risoluzione. la distorsione dell&#39;immagine Imaging deriva è spesso un problema quando si cerca ad alta risoluzione e rende le immagini appaiono distorte (tipicamente allungato). La sua origine è generalmente termico, sia perché lo scanner / AFM non ha raggiunto la temperatura di funzionamento di equilibrio, o perché parte del campione liquido evapora rapidamente (ad esempio, imaging in alcoli<html> ). In tutti i casi, la deriva diventa trascurabile in equilibrio termico. È quindi utile per fissare la temperatura del campione, se possibile. Altrimenti, è opportuno lasciare la AFM per analizzare un campione bianco (scansione grande formato al tasso di scansione lenta) per diverse ore prima di condurre l&#39;esperimento. Se l&#39;evaporazione non è un problema, questa procedura è fatto meglio dopo il punto 6 della procedura, avendo cura di prima ritirare la punta a breve distanza (ad esempio, 20 micron) dalla superficie. Di tanto in tanto, la deriva rimarrà anche dopo vasta termalizzazione. Questo di solito indica che la mensola o il suo chip è in parte trascinando il campione, mentre per immagini, una cosa che può accadere su campioni coesivi molli come film sottili o se la punta / a sbalzo / chip non è opportunamente collocato. Sul chip che ospitano più di un cantilever / punta, è spesso utile per rompere il cantilever, che non sono in uso, piuttosto che lasciare che trascinano sulla superficie. Forza ionica S copi &quot;&gt; Poiché imaging è dominato dal liquido interfacciale, a volte è utile aggiungere del sale per immagini ad alta risoluzione della superficie carica in acqua. Il ruolo del sale è duplice. In primo luogo, esso modifica il paesaggio idratazione della superficie ripreso su adsorbimento, che spesso migliora il contrasto. in secondo luogo, aiuta schermo forti interazioni elettrostatiche tra la punta e del campione (ad esempio, su mica). in generale, gli ioni più grandi, potassio, rubidio e cesio consentono immagini migliori per le loro proprietà di idratazione specifiche 76, e il fatto che spesso assorbono principalmente in uno stato di idratazione unico 77. Bad sbalzo / punta Se si sospetta che il cantilever è una fonte di contaminazione (vedi sintomi descritti in precedenza), si deve prima controllato al microscopio ottico. Se conservato in una scatola di gel, il cantilever può raccogliere tracce di polimeri gel o olio di silicone 59 che può apparire, In casi estremi, come macchie scure, sul retro del cantilever (come in Figura 5A). Photothermal oscillazione del cantilever può indurre macchie simili, ma sono dovuti alla degradazione / surriscaldamento del rivestimento sbalzo dal laser guida. La contaminazione tende a appare casualmente sul cantilever. A più lungo (12 ore) di pulizia con isopropanolo e, quindi, con acqua ultrapura può rimuovere eventuali particelle indesiderate dal cantilever. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig5.jpg" /> Figura 5: Confronto tra un nuovo cantilever e uno identico che è stato ampiamente utilizzato su superfici dure e lasciato in una scatola di gel per un periodo prolungato. A: Top; immagine ottica di nuova mensola che è stato pulito (vedi procedura). Parte inferiore; ottico d&#39;immagine che dimostra la comparsa di contaminazione visibile (freccia blu) dalla scatola del gel. B: confronto tra rispettivi spettri termica cantilever.Ampliamento del primo picco di risonanza del vecchio sbalzo è chiaro (freccia verde) e alcuni modi di ordine superiore sono migliorate (freccia blu). Spectra è stato spostato verticalmente e presentata su scala log-log per chiarezza. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Se la risoluzione sub-nanometrica richiesto non viene raggiunto, nonostante immagini accettabili a risoluzione inferiore, è possibile che la punta AFM è diventato chimicamente modificato durante il suo ambiente di storage. Questo può essere trattata mediante esposizione del chip cantilever ad un ossidante ultravioletti per 120 sec, che aiuta la creazione di gruppi idrofili superficiali sulla punta 60. Si deve prestare attenzione però, come il tempo esatto necessario possono variare a seconda della geometria della punta e di potenza UV, e sovraesposizione può provocare ottundimento della punta e risoluzione ridotta. rumore termico &lt;/ P&gt; Immagini ad alta risoluzione richiede grande sensibilità alle variazioni di forza e distanze (tipicamente le forze sub-PN e sub-Ångström distanze 78). Per cantilever morbidi, il moto termomeccanica del cantilever a causa della sua intrinseca moto browniano (vibrazione termica) può essere un problema. In prima approssimazione, con un cantilever di rigidezza k, non è possibile misurare le caratteristiche più piccole di quelle <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation1.jpg" /> , L&#39;ampiezza del rumore termico, dove k è la costante di Boltzmann B e T è la temperatura. In pratica, utilizzando cantilever con frequenze di risonanza più elevate diffonde il rumore in una gamma di frequenza più ampio, e riduce la rumorosità complessiva nella banda di misura 79. l&#39;imaging dei modi propri Superiore A volte può essere utile per operare il cantilever in seconda dei modi propria causa della rigidità effettiva crescita (vedi la discussione di contaminazione). In pratica, questo è fatto semplicemente guidando cantilever alla seconda modi propri (il secondo picco di risonanza alla frequenza più elevata, vedere Figura 1A). Con l&#39;adattamento del cantilever, è sufficiente selezionare il secondo dei modi propri al posto della risonanza principale e passare al punto 5.4. Si noti che i InvOLS saranno diverse quando il cantilever viene azionato nel secondo modi propri; tipicamente ~ 1/3 dei InvOLS misurati in fase 5.2 per un cantilever rettangolare. Il limite principale di questa tecnica è che richiede un paesaggio solvatazione stabile alla superficie del campione. Il campione dovrebbe essere sufficientemente robuste per consentire perturbare il liquido interfacciale senza indurre fenomeni significativi e deformazione del campione stesso. Questo può essere difficile a molto morbido e campioni instabili così grandi biomolecole. Inoltre, piccola ampiezza AFM come descritto qui non possono ottenere informazioni sulla meccanica properties di un campione, come la punta a sbalzo trascorre la maggior parte del suo tempo nel fluido interfacciale. Per questo, può essere utile utilizzare altre vie, come Quantitative nanomeccanici Mapping 80 o fare uso di alte armoniche di movimento a sbalzo. Armoniche più alte sono generalmente migliorate quando l&#39;imaging a fluido (con bassa qualità-fattori) 29,81 - 83 e in grado di fornire simultaneamente la topografia e la rigidità dei campioni 25,81 - 84, ma sono generalmente dannosi per alta risoluzione. Altre limitazioni inerenti a tutte le tecniche di microscopia a scansione di sonda sono ancora valide qui, in particolare il fatto che i risultati contengono inevitabilmente informazioni sulla punta di misurazione. L&#39;uso di piccole ampiezze è anche non ideale per campioni con grandi variazioni di altezza; l&#39;anello di retroazione inevitabilmente reagire più lentamente quando le variazioni di altezza sono più grandi l&#39;ampiezza di imaging, quindi rischiando campione e punta danni. L&#39;uso of morbida cantilever attenua questo problema in una certa misura. Il principale vantaggio del metodo qui presentato è il fatto che esso fornisce la più alta risoluzione possibile con AFM in liquido, ma può essere implementata in qualsiasi AFM commerciale, a condizione che la rumorosità della macchina sono sufficientemente bassi. risoluzione paragonabile su strumenti commerciali è di solito realizzato in modalità contatto, o occasionalmente in FM-AFM con cantilever rigide. Lavorare in AM-mode e con cantilever relativamente morbide permette una scelta più ampia di campioni, ed è più facile da implementare rispetto FM-AFM sulla maggior parte dei sistemi. Questo approccio si basa sullo sfruttamento delle forze di solvatazione esistenti all&#39;interfaccia tra qualsiasi solido e liquido per migliorare la risoluzione e ottenere informazioni chimiche locale. Si può in linea di principio essere utilizzato in condizioni ambientali, contando solo sugli strati d&#39;acqua (tipicamente diversi spesse nanometri) costruendo sulla maggior parte delle superfici a causa dell&#39;umidità dell&#39;aria. I principi alla base delstrategia ad alta risoluzione restano invariati ma la maggior parte della punta è in aria, con solo un ponte capillare tra il vertice punta e il campione 85. Ad alta risoluzione è stata dimostrata su campioni rigidi in queste condizioni 86,87. Le condizioni di imaging sono comunque diverse da quelle di liquido immerso a causa di un elevato fattore Q di oscillazione del cantilever. In pratica, abbiamo trovato difficile ottenere un funzionamento stabile in campioni morbidi o irregolari, presumibilmente a causa di cambiamenti temporali del ponte capillare e incrementato Q-fattori per un dato rigidità sbalzo. Il protocollo qui descritto offre una metodologia per ottenere immagini ad alta risoluzione a livello molecolare di campioni in un liquido con la maggior parte moderni AM-AFM commerciali. Noi forniamo la logica scientifica dietro la nostra scelta di parametri di imaging e di sottolineare il ruolo delle forze di solvatazione. Discutiamo anche problemi comuni e, in particolare, la contaminazione. Le interazioni specifiche punta-campione can variare notevolmente a seconda del contenuto della soluzione di imaging, la geometria a sbalzo e materiale, e la chimica del campione. Una comprensione pratica della natura delle forze dominanti presenti durante la scansione è quindi essenziale adattare questo protocollo per nuovi sistemi e garantire risultati affidabili. Quando ottimizzato, l&#39;approccio sperimentale è efficace per guadagnare in-situ intuizioni livello molecolare locali di campioni in soluzione.

Fin dalla sua invenzione, tre decenni fa, microscopia a forza atomica (AFM) 1 si è affermata come una tecnica di scelta per indagare campioni su scala nanometrica, specialmente dove una media di oltre superfici macroscopiche non è possibile ed è necessario informazioni locali. In una misurazione tipica AFM, la deviazione di un cantilever flessibile viene usato per quantificare la forza di interazione tra un piccolo numero di molecole e una punta ultrasharp montato all&#39;estremità del cantilever. A seconda del tipo di interazioni ed i tempi considerati, una vasta gamma di informazioni possono essere derivate, incluse le proprietà viscoelastiche delle membrane biologiche molli 2,3, la forza di un singolo agente chimico o legame molecolare 4,5, i dettagli atomistici di un superficie di 6-8, la magnetica 9, capacitivo 10, lo svolgimento di 11, termiche e chimiche 12,13 14 immobili di campioni <sup&gt; 15. Parte del successo della AFM è la sua capacità di lavorare su una vasta gamma di materiali 16 e in molteplici ambienti come vuoto 17, gas o liquidi 11,18 19,20, perché non si basa su una forza specifica tra la sonda e il campione . In pratica, tuttavia, il funzionamento del AFM in condizioni diverse ambientale può essere difficile e molti risultati pubblicati sono ancora ottenuti in aria. Un&#39;ulteriore difficoltà deriva dal fatto che è di solito necessario azionare il AFM in modalità dinamica (punta vibrante) al fine di preservare sia punta e del campione, evitando grandi forze di attrito. Anche se più impegnativo, il funzionamento dinamico può in linea di principio di fornire ulteriori informazioni sul campione analizzato, e senza perdita di risoluzione spaziale. Negli ultimi dieci anni, il campo di AFM dinamica nel liquido ha visto importanti sviluppi, dal avvento del video-rate AFM 21 - 23, a misure multifrequenza <sup&gt; 24,25 e sub-nanometrica di imaging delle strutture di idratazione alle interfacce 26 - 31. Operazione AFM mentre immerso nel liquido viene ora utilizzato di routine in biologia e biofisica 32-36, la ricerca polimerica 37, elettrochimica 38-40 e solido-liquido interfacce caratterizzazione 41-44. La presenza di liquido attorno al cantilever vibrante altera considerevolmente la sua dinamica 45 nonché l&#39;interazione tra la punta e il campione 29,42. Se usato in modo appropriato, il liquido può essere sfruttata per migliorare la risoluzione delle immagini 26,29, con un tipico miglioramento di quasi un ordine di grandezza rispetto ai migliori risoluzione ottenuta in condizioni ambientali 46. In AFM, la più alta risoluzione spaziale ottenibile per una particolare misura dipende sia la qualità del AFM stessa e la natura di tha sondato l&#39;interazione 20,47,48. Attualmente, la maggior parte di fascia alta, AFMs disponibili in commercio presentano livelli di rumore che sono vicino a quello del limite termico 12 in modo che il fattore determinante per la risoluzione è di solito l&#39;interazione punta-campione. E &#39;efficace il gradiente spaziale di questa interazione che determina la risoluzione: misurazioni basate su corto raggio, in rapida decomposizione interazione producono risultati risoluzione superiore a quella in cui le interazioni a lungo raggio sono in gioco. Nel liquido, forze solvatazione possono migliorare la risoluzione delle immagini perché tendono a scomparire sopra solo pochi diametri molecolari del liquido (tipicamente &lt;1 nm) quando si allontana dalla superficie del campione 49. Queste forze hanno origine dall&#39;interazione tra le molecole del liquido e la superficie del campione. Un liquido con una forte affinità per la superficie tenderà ad essere più ordinata e meno mobile liquida massa all&#39;interfaccia con il campione 29,42,50. Di conseguenza,ci vorrà più energia per una punta AFM vibrante per spostare molecole liquide di interfaccia di rinfuse liquide 42, rendendo la misura molto sensibile a variazioni locali nelle proprietà del liquido di interfaccia su nanoscala -la solvatazione paesaggio. Per sfruttare forze solvatazione, alcuni aspetti pratici devono essere presi in considerazione. Innanzitutto, l&#39;ampiezza di oscillazione della punta deve essere paragonabile alla gamma delle forze di solvatazione, tipicamente &lt;1 nm. In secondo luogo, il liquido usato deve formare un paesaggio solvatazione ben definita sulla superficie del campione. Macroscopico, ciò equivale a richiedere un liquido &#39;bagnante&#39; per il campione in esame. Ad esempio, in acqua è più facile ottenere una risoluzione a livello molecolare su mica idrofila che idrofobica sul 42,51 grafite. Infine, la costante elastica del cantilever sostenere la punta deve essere scelta opportunamente 52,53. Quando si lavora in questi concondizioni, l&#39;AFM non solo fornisce immagini a livello molecolare dell&#39;interfaccia, ma deriva anche informazioni riguardo l&#39;affinità campione di liquido locale, che può essere utilizzato per ottenere informazioni chimiche sulla superficie del campione 54. I modi più comuni dinamiche di funzionamento per AFM in liquido sono modulazione di ampiezza (AM, anche &#39;modalità tapping&#39;) AFM e la frequenza di modulazione (FM) AFM. Nel primo caso 55, la punta raster-scansione del campione mentre la sua ampiezza di vibrazione è mantenuta costante da un anello di retroazione che continuamente ri-regola la distanza punta-campione. Una immagine topografica del campione è ottenuta dalla correzione applicato dal circuito di retroazione. In FM-AFM 28,41,56, è la frequenza di oscillazione del cantilever / punta che viene mantenuta costante mentre la punta scansiona il campione. Entrambe le tecniche offrono una risoluzione topografica paragonabile a liquido 36,57. La quantificazione della interazione punta-campione tende ad essere più straightforward e preciso in FM-AFM, ma AM-AFM è più facile da implementare, più robusto, e permette di lavorare con cantilever morbidi, qualcosa di utile per studiare i campioni facilmente deformabili o delicati. Significativamente, AM-AFM è più diffusa tra gli utenti AFM, in parte per ragioni storiche, ma anche a causa del fatto che è tecnicamente più facile da controllare. Sebbene l&#39;ampiezza è mantenuta costante dal circuito di retroazione durante l&#39;imaging AM-AFM, la fase che intercorre tra l&#39;oscillazione punta e l&#39;oscillazione di guida è permesso di modificare liberamente. La fase-lag può fornire informazioni utili sulle interazioni punta-campione, essendo legata all&#39;energia dissipata durante l&#39;oscillazione della punta all&#39;interfaccia con il campione 58. Quindi fase di immagini può essere acquisita contemporaneamente all&#39;imaging topografica, ed è spesso complementari in evidenza l&#39;eterogeneità di una superficie del campione. Imaging fase è stata utilizzata per vari mappatura delle interazioni, compresa la dimappatura rect di energia adesione 42, proprietà viscoelastiche 58 e il paesaggio idratazione di un&#39;interfaccia 44. Praticamente, ottenendo immagini ad alta risoluzione in liquido rimane non banale a causa del gran numero di parametri da controllare, e l&#39;assenza di un semplice protocollo sistematico che funziona in ogni situazione. La qualità dell&#39;immagine dipende tipicamente dalla geometria a sbalzo e l&#39;elasticità, la chimica punta, l&#39;ampiezza di oscillazione, e la rigidità di esempio, tra gli altri 55. misure AFM sono, per definizione, perturbativi al sistema. Come risultato, cambiare le variabili di imaging e condizioni ambientali senza considerazioni proprie può portare a difficoltà di riproducibilità e / o osservazioni misrepresentative ea falsi risultati. Qui, vi presentiamo il nostro protocollo per ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni duri e molli in soluzione, utilizzando strumenti commerciali gestite in amplitude-modulazione. Il nostro obiettivo è quello di offrire una procedura pratica per ottimizzare i principali parametri che possono influenzare la risoluzione su diversi campioni, spiegando in ogni caso le motivazioni per le nostre scelte dai principi fisici alla base del processo di imaging. Noi dettaglio un approccio step-by-step, dalla pulizia del substrato e preparazione, a scelta del cantilever, regolazione dei parametri di imaging e di risoluzione dei problemi comuni. Spiegando la logica scientifica dietro le nostre scelte e le procedure per alta risoluzione dovrebbe aiutare fare scelte razionali quando adattare la metodologia, e servire come punto di partenza per i sistemi di imaging nuovi. In tutto questo testo usiamo AM per fare riferimento al modo di funzionamento di modulazione di ampiezza di un AFM. Ci riferiamo al parametro di retroazione mantenuta costante sia durante la deflessione a sbalzo (modalità contatto) o ampiezza di oscillazione (modalità AM) al valore di riferimento. In modalità AM, il cantilever è guidato dall&#39;esternomediante un&#39;oscillazione acustica o da un laser pulsato focalizzata alla base del cantilever. L&#39;ampiezza azionamento è l&#39;intensità del segnale oscillatorio esterna. Il valore assoluto dell&#39;ampiezza motrice necessaria per ottenere una data ampiezza di oscillazione del cantilever dipende da molti parametri come il metodo di azionamento (acustica, fototermico o magneticamente), fissazione cantilever e parametri (rigidità, geometria) e l&#39;allineamento laser. L&#39;esatto valore dell&#39;ampiezza unità non è pertinente ma è regolata in ogni esperimento in modo da fornire un adeguato (e quantificabile) ampiezza di oscillazione del cantilever. Quando il cantilever guidato è lontano dal campione e senza smorzamento della sua vibrazione avviene attraverso interazioni punta-campione, la sua ampiezza di oscillazione è detta ampiezza di oscillazione libera. Come la punta vibrante avvicina alla superficie del campione, la sua ampiezza comincia a diminuire. Se il feedback è attivata, la Z-piezo sarà constantly regolare nuovamente la sua estensione in modo che alla chiglia l&#39;ampiezza setpoint impostato, costante. Il valore di riferimento è normalmente sempre più piccolo l&#39;ampiezza libera. È comune per riferirsi al rapporto setpoint, il rapporto tra l&#39;ampiezza del valore di riferimento (imaging ampiezza) sopra l&#39;ampiezza libera. Più piccolo è il rapporto di setpoint, il più duro le condizioni di imaging sono.

<table><tbody><tr><td>Multimode IIIA AFM</td><td>Brucker</td><td>NA</td><td>Una delle macchine utilizzate</td></tr><tr><td>Cypher ES AFM</td><td>Asylum Resarch</td><td>NA</td><td>Una delle macchine utilizzate</td></tr><tr><td>AFM cantilever/tip</td><td>Nanoworld</td><td>Arrow UHF-AUD</td><td>migliore per alta frequenza</td></tr><tr><td>AFM cantilever/tip</td><td>Olympus</td><td>RC800-PSA</td><td>versatile ed economico</td></tr><tr><td>acqua ultrapura</td><td>Milipore</td><td>NA</td><td>i sistemi di filtraggio da laboratorio possono indurre contaminazione</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td>200-664-3&nbsp;</td><td>prodotto chimico standard, nessuna ulteriore purificazione</td></tr><tr><td>Sali monovalenti</td><td>Sigma-Aaldrich</td><td></td><td>chimico standard, nessuna ulteriore purificazione</td></tr><tr><td>Lipidi</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>bistrati lipidici formati utilizzando protocolli standard</td></tr><tr><td>Cristalli</td><td>MTI</td><td></td><td>cristalli lucidati</td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>Scotch Magic Tape</td><td>Il nastro traslucido funziona meglio. La trasparenza si attacca troppo forte</td></tr></tbody></table>

sub-nanometrica resolution imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

La microscopia a forza atomica (AFM) è diventata una tecnica consolidata per l'imaging su scala nanometrica di campioni in aria e in liquido. Studi recenti hanno dimostrato che, quando vengono utilizzate in modalità di modulazione di ampiezza (tapping), è possibile ottenere immagini con risoluzione atomica o molecolare su un'ampia gamma di campioni morbidi e duri in liquidi. In queste situazioni, piccole ampiezze di oscillazione (SAM-AFM) migliorano la risoluzione sfruttando il liquido solvatato sulla superficie del campione. Sebbene la tecnica sia stata applicata con successo in campi diversi come la scienza dei materiali, la biologia e la biofisica e la chimica delle superfici, ottenere immagini ad alta risoluzione in liquidi può ancora rimanere difficile per gli utenti inesperti. Ciò è in parte dovuto al gran numero di variabili da controllare e ottimizzare come la scelta del cantilever, la preparazione del campione e la corretta manipolazione dei parametri di imaging. Qui, presentiamo un protocollo per ottenere immagini ad alta risoluzione di campioni duri e morbidi in fluido utilizzando SAM-AFM su uno strumento commerciale. Il nostro obiettivo è quello di fornire una guida pratica passo dopo passo per ottenere immagini ad alta risoluzione, compresa la pulizia e la preparazione dell'apparato e del campione, la scelta del cantilever e l'ottimizzazione dei parametri di imaging. Per ogni fase, spieghiamo il razionale scientifico alla base delle nostre scelte per facilitare l'adattamento della metodologia al sistema specifico di ogni utente.

Il protocollo descritto nel paragrafo precedente è stato applicato con successo diversi AFMs commerciali per ottenere immagini molecular- o livello atomico. Tutte le immagini sono state ottenute con ampiezze di lavoro tra 0,5 nm e 1,5 nm rettificato a seguito singolarmente la procedura passi 7,1-7,4. I risultati potrebbero essere ottenuti in un ampio campo di molle (figura 2) e (3) Figura campioni rigide. In ogni caso, le caratteristiche di interesse sono evidenziate. Uno dei grandi vantaggi della tecnica è che piccole ampiezze di oscillazione e set-punti alti minimizzano la forza esercitata dalla punta sul campione, permettendo fragili auto-assiemi di lipidi (Figura 2A), proteine (Figura 2B e D), e molecole anfifiliche (Figura 2C) per essere ripreso senza danni in soluzione. Materiali più duri cristallini quali minerali (figure 3A, B, D) eioni metallici singoli adsorbiti su una superficie (Figura 3C) possono essere esposte utilizzando l&#39;approccio perché in ogni caso, è il liquido interfacciale che effettivamente ripreso con il protocollo descritto. Le forze di solvatazione sono comparabili sui campioni figure 2 e 3 indicati: tutti i campioni sono idrofili (più in generale, &quot;solvophilic&quot; nel caso delle figure 2C, 3B, 3D) rispetto alla soluzione di imaging. Coerentemente, cantilever con rigidità paragonabili (0,2 - 0,8 N / m) sono stati usati in tutti i casi. Sia il campione e la punta dovrebbe essere solvophilic garantire che le molecole di liquido formano una struttura solvatazione ben definita che può essere ripreso. Questo non è sempre una condizione sufficiente, ma nella maggior parte dei casi e relativamente piccole molecole di liquido, liquido stesso re-strutture in un modo che imita la simmetria del campione. Il driver principale del-alta risoluzione è la variazione locale nel affinità dei adsorbite molecole di solventeper le superfici (Ångström scala, nel caso delle figure 2A, 3A, 3C). La tecnica è quindi più adatto ai materiali in cui la struttura del solvente varia in gran parte attraverso la superficie. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig2.jpg" /> Figura 2: interfacce molli ripresi dal AM-AFM in soluzioni acquose. A: Dipalmitoyl-fosfatidilcolina (DPPC) doppio strato lipidico in fase gel ripreso in in 150 mM KCl. I lipidi headgroups esagonale ricco sono distinguibili sia in fase di topografia e, insieme a contrasto locale che indica le variazioni site-specific in idratazione. B: membrane viola di Halobacterium salinarum ripreso in 150 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7.4. Diversi trimeri proteine ​​batteriorodopsina sono evidenziati. La fase presenta un contrasto diverso da topografia a causa di siti di idratazione locali sulle proteine. trimeri proteine ​​individuali<html> può essere compilata (linee tratteggiate). C: colorante Amphiphilic (Z907) molecole adsorbite sulla superficie di una nanoparticella TiO 2 in una Cella di Grätzel. L&#39;immagine è stata acquisita in solfone etil-isopropilico. L&#39;aspetto spugnoso è creato dalle molecole di colorante adsorbito. D: cristallo Aquaporin nelle membrane delle lenti bovine autoctone imaged nello stesso buffer come B. Un tetramero aquaporin è evidenziato. Sub-struttura corrispondente al loop inter-elicoidali sono visibili nella topografia mentre la fase mostra un contrasto sorprendentemente diverso a causa del comportamento unusual vicino alla proteina. Le immagini sono adattate da refs 36 (B), ref 38 (C) e ref 67 (D). La barra di scala è 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm in (C), e 15 nm (D) La scala colore indica rispettivamente una variazione di altezza e la fase di 200 pm e 15 ° (A), 600 pm e 4 ° (B), 2,5 nm e 2,5 ° (C), e 1,6 nm e 9,5 ° (D).carico / 54924 / 54924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54924/54924fig3.jpg" /> Figura 3: immagini rappresentative AM-AFM di campioni duri nelle soluzioni fluide. A: Calcite cristallo [ <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/54924/54924equation2.jpg" /> ] Superficie ripreso in una soluzione di acqua ultrapura equilibrata. B: titanato di stronzio ripreso ottenuto in dimetil solfossido (DMSO). Ad alta risoluzione non era possibile in acqua. C: moscovita mica ripreso a 3 mM rbcL - singoli ioni assorbiti Rb + sono visibili sui siti del reticolo della mica in entrambe le scansioni di fase e di altezza. D: carburo di silicio in ripreso in DMSO. Il regime cristallografiche attesi sono mostrati in immagini B e D. Le immagini sono adattate da ref 68 (A), ref 42 (B e D),e ref 44 (C). La barra della scala è di 3 nm (A, B, D) e 5 nm (C). La scala colore indica rispettivamente una variazione di altezza e la fase di 250 pm e 14 ° (A), 600 pm e 5,5 ° (B), 800 pm e 15 ° (C), e 500 pm e 3,5 ° (D). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54924/54924fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Vi presentiamo un metodo per ottenere immagini a risoluzione sub-nanometrica con (modalità tapping) modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in un liquido. Il metodo è dimostrata su microscopi commerciali a forza atomica. Spieghiamo la logica alla base delle nostre scelte di parametri e di suggerire strategie per l&#39;ottimizzazione risoluzione.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un'immagine con la risoluzione più elevata possibile in liquido, utilizzando un AFM commerciale operato in modalità di modulazione dell'ampiezza, nota anche come modalità tapping. Questo metodo contribuisce a spingere i limiti dell'operazione standard dell'AFM in liquido, utilizzando la migliore combinazione di parametri per un'elevata risoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata con la maggior parte degli AFM commerciali e, di conseguenza, non richiede alcun equipaggiamento specializzato.Il metodo qui presentato è rivolto a scienziati e tecnici che possiedono già alcune conoscenze di base sulla microscopia a forza atomica (AFM), ma desiderano ottenere risultati migliori dalla tecnica. Questo metodo non è specifico per un particolare tipo di campione ed è ampiamente applicabile a campioni provenienti da fisica, biologia, chimica, scienze dei materiali e scienze ingegneristiche. In generale, chi si avvicina per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché è necessaria una certa pazienza per individuare i parametri ottimali per un determinato campione.Sottoporre a sonicazione in bagno gli strumenti e il disco che sostiene il substrato in acqua ultrapura, seguita da isopropanolo e nuovamente acqua ultrapura, per 10 minuti ciascuna. Quando si mira ad alta risoluzione, qualsiasi contaminazione può avere conseguenze dannose.Indossare sempre guanti ed assicurarsi che tutte le superfici o gli strumenti che vengono a contatto con il campione, la mensola o la cella AFM siano accuratamente puliti. Dopo la sonificazione, asciugare ciascuno strumento e il disco del campione sotto un flusso di azoto. Utilizzare un disco di acciaio come supporto per la micca, al fine di ottenere immagini di singoli ioni metallici assorbiti.Pulire fisicamente le superfici che non possono essere pulite per mezzo di ultrasuoni, strofinandole con tessuti monouso a basso rilascio di pelucchi imbevuti in acqua ultrapura, isopropanolo e acqua ultrapura, rispettivamente. Lasciare asciugare la superficie all'aria per un massimo di 30 minuti. Successivamente, preparare una piccola quantità di colla epossidica mescolando accuratamente i reagenti e depositare circa 10 microlitri di epossidica sul disco campione di acciaio pulito.Posizionare il substrato di mica sull'epossidico e fissarlo al disco di acciaio applicando pressione sul substrato. Lasciare polimerizzare l'epossidico per diverse ore a una temperatura elevata, secondo le specifiche del produttore. Successivamente, premere saldamente un pezzo di nastro adesivo largo 2,5 centimetri sul substrato, in modo da coprire l'intera superficie, e staccare delicatamente lo strato superiore.Ripetere questo processo due o tre volte fino a quando la mica non risulti liscia come uno specchio ad occhio nudo. Immergere il chip della mensola in un bagno di isopropanolo seguito da acqua ultrapura, ciascuno per 60 minuti. Successivamente, esporre la punta alla luce UV per un massimo di cinque minuti al fine di favorire la formazione di siti di idratazione stabili.Tempi più lunghi di sovraesposizione possono danneggiare la punta o aumentarne il raggio di curvatura. Inserire la mensola nel supporto della mensola dell'AFM e pipettare 25 microlitri del liquido di imaging sulla mensola e sulla punta per bagnare preventivamente la superficie. Questo ridurrà la comparsa di bolle d'aria durante l'avvicinamento al campione.Fondere il disco campione e il substrato sulla piattaforma del campione e aggiungere una goccia del liquido di imaging al campione. Successivamente, collegare il supporto della mensola al microscopio a forza atomica (AFM). Avvicinare la mensola e il campione fino a formare un ponte capillare tra i fluidi presenti sulla punta della mensola e quelli sul campione.Utilizzare il software dell'AFM per allineare il laser di misurazione vicino all'estremità della punta del cantilever. Successivamente, individuare la frequenza di risonanza del cantilever a partire dal picco principale nel suo spettro termico. Se la deflessione del cantilever è stata calibrata, l'adattamento del picco di risonanza a un modello di oscillatore armonico semplice fornisce la costante elastica del cantilever.Quindi, regolare la mensola agendo sulla sua risposta in ampiezza quando viene eccitata esternamente attraverso un intervallo di frequenze prossime alla frequenza di risonanza identificata nello spettro termico. Regolare l'ampiezza di eccitazione in modo che l'ampiezza di oscillazione libera sia di circa cinque nanometri. Questo valore corrisponde tipicamente a 0,2-0,8 volt nella maggior parte degli AFM.Quindi, regolare il punto di set dell'ampiezza a circa l'80% dell'ampiezza libera. Successivamente, impostare i guadagni di retroazione relativamente alti. Dopo aver verificato che non si verifichino instabilità o oscillazioni, impostare la velocità iniziale di scansione a circa un hertz e la dimensione della scansione a 10 nanometri.Avviare l'avvicinamento della punta alla superficie utilizzando il software di controllo del microscopio a forza atomica (AFM). Valutare se la punta ha raggiunto la superficie senza iniziare a effettuare l'immagine, modificando leggermente il valore del punto di regolazione. Se la punta si trova sulla superficie, l'effetto sull'estensione della zona ZPA dovrebbe essere trascurabile.Una volta che la punta ha raggiunto la superficie, ritrarre la zona ZPA e ritarare la mensola. La frequenza di risonanza si sarà probabilmente spostata verso un valore inferiore a causa delle interazioni tra punta e campione. A questo punto, modificare il punto di regolazione a circa l'80% dell'ampiezza libera appena tarata e avvicinare la mensola per effettuare una scansione di 10 per 10 nanometri quadrati della superficie in modalità di modulazione dell'ampiezza, al fine di verificare che i parametri di imaging siano adeguati.Verificare che i profili di tracciamento e di ritracciamento siano sovrapposti. In caso contrario, ridurre ulteriormente il valore di settaggio e provare ad aumentare i guadagni. Se l'immagine diventa rumorosa, ridurre i guadagni.Ripetere l'operazione su una regione del campione di dimensioni comprese tra uno e cinque micrometri quadrati, se possibile. Su campioni morbidi o biologici, ciò potrebbe causare contaminazione della punta. Ridurre le dimensioni della scansione a un valore adatto per visualizzare le caratteristiche di interesse.Questo può essere basso fino a 20 per 20 nanometri. Successivamente, ridurre l'ampiezza di eccitazione del cantilever sufficientemente perché il circuito di retroazione ritragga automaticamente la zona ZPA, sollevando la punta dalla superficie. Mentre il cantilever è lontano dalla superficie, regolare l'ampiezza di eccitazione in modo che l'ampiezza del cantilever sia da uno a due nanometri picco-picco.Ridurre progressivamente il valore di riferimento a piccoli passi, finché la zona ZPA non si estende nuovamente verso la superficie e l'immagine originale non viene recuperata. Mantenere l'ampiezza del valore di riferimento tra il 75% e il 95% della nuova ampiezza libera. Successivamente, riregolare i guadagni, poiché a ampiezze più basse è possibile utilizzare guadagni più elevati senza introdurre rumore significativo.Ottimizzare il sistema per individuare la migliore combinazione di ampiezza libera, punto di regolazione e guadagno per una risoluzione elevata. Le condizioni ottimali del sistema dipendono dal campione, dalle proprietà di bagnabilità del liquido e anche dal cantilever utilizzato. Per le interfacce solvofiliche, utilizzare cantilever con una costante elastica compresa tra 0,5 e 2 newton al metro.Utilizzando questa tecnica, sono state ottenute immagini con risoluzione sub-nanometrica su un'ampia gamma di campioni. I campioni teneri mostrati qui includono un doppio strato lipidico, membrane viola da halobacterium salinarum, uno strato autoassemblato di dimolecole anfipatiche e cristalli di acquaporina da una membrana del cristallino bovino. In ogni caso, le caratteristiche di interesse sono evidenziate.Le piccole ampiezze di oscillazione e i punti di regolazione elevati minimizzano la forza esercitata dalla punta sul campione, consentendo di ottenere immagini in soluzione degli assemblaggi fragili di lipidi nel doppio strato, delle proteine nelle biomembrane native e delle molecole anfifiliche senza provocarne danni. Materiali cristallini più duri, come calcite, titanito di stronzio, carburo di silicio e ioni metallici singoli assorbiti su una superficie di micace possono essere analizzati con questo approccio, poiché in ogni caso è il liquido interfaciale ad essere effettivamente immaginato, e non il cristallo stesso. Una volta padroneggiata, questa tecnica fornisce quasi sempre una risoluzione a livello molecolare o atomico in ambiente liquido quando viene eseguita correttamente.Quando si tenta questa procedura, è importante tenere presente che il liquido in fase interfaciale è quello che viene immaginato. Ciò implica l'uso di condizioni di imaging delicate. La contaminazione della punta, del campione o del liquido è solitamente la causa principale del mancato raggiungimento di un'elevata risoluzione.In caso di dubbio, è spesso consigliabile pulire tutte le superfici a contatto con il liquido e riutilizzare le soluzioni per l'acquisizione di immagini. Anche il rumore esterno è dannoso per l'alta risoluzione. Un pavimento a bassa vibrazione, lontano da un condotto di ventilazione, è preferibile.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottimizzare i parametri di acquisizione per ottenere una microscopia a forza atomica ad alta risoluzione. Ovviamente, come per qualsiasi tecnica all'avanguardia, possono essere necessari diversi tentativi per capire come acquisire al meglio un campione, quindi la pazienza è fondamentale.

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Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

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Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.

Microscopia a forza atomica combinata con la spettroscopia infrarossa come strumento per sondare la chimica del singolo batterio

La microscopia a forza magnetica (MFM) impiega una sonda di microscopia a forza atomica magnetizzata verticalmente per misurare la topografia del campione e l'intensità del campo magnetico locale con risoluzione su scala nanometrica. L'ottimizzazione della risoluzione spaziale e della sensibilità MFM richiede il bilanciamento dell'altezza di sollevamento decrescente con l'aumento dell'ampiezza dell'azionamento (oscillazione) e trae vantaggio dal funzionamento in un vano portaoggetti in...

Ottimizzazione della risoluzione e della sensibilità al microscopio a forza magnetica per visualizzare domini magnetici su scala nanometrica

L'ispezione di campioni su larga scala con risoluzione su scala nanometrica ha un'ampia gamma di applicazioni, in particolare per i wafer semiconduttori nanofabbricati. I microscopi a forza atomica possono essere un ottimo strumento per questo scopo, ma sono limitati dalla loro velocità di imaging. Questo lavoro utilizza array a sbalzo attivi paralleli in AFM per consentire ispezioni ad alta produttività e su larga scala.

Microscopia a forza atomica con sonda attiva con array a sbalzo Quattro-Parallel per l'ispezione di campioni su larga scala ad alta produttività

Qui, mostriamo il protocollo di imaging per l'osservazione delle interazioni biomolecolari con il rilevamento della risonanza fototermica (PORT), dove abbiamo ottimizzato i parametri di imaging, identificato i limiti del sistema e studiato potenziali miglioramenti nell'imaging dell'assemblaggio del motivo del DNA a tre punte.

Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

Abbiamo sviluppato un self-contained cella liquido, che permette l'imaging mediante liquidi usando un microscopio elettronico a trasmissione. Processi dinamici di nanoparticelle nei liquidi può essere rivelato in tempo reale con risoluzione sub-nanometrica.

Rivelare processi dinamici dei materiali in liquidi con liquido di trasmissione microscopia elettronica cellulare

Scopri la microscopia a forza atomica in modulazione di ampiezza per ottenere risoluzione sub-nanometrica in liquido. Questo metodo ottimizza i parametri di imaging su AFM commerciali standard per ricerche in biologia, fisica e scienza dei materiali.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

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