Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere la massima risoluzione possibile di imaging in liquido, con un AFM commerciale operato e modulazione di ampiezza, nota anche come modalità di maschiatura. Questo metodo aiuta a spingere il limite del funzionamento standard dell'AFM in liquido, utilizzando la migliore combinazione di parametri per l'alta risoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata con la maggior parte degli AFM commerciali e, come tale, non richiede alcuna attrezzatura specializzata.

Il metodo qui presentato è rivolto a scienziati e tecnici che hanno già alcune conoscenze di base dell'AFM, ma vorrebbero ottenere di più dalla tecnica. Questo metodo non è rivolto a nessun tipo particolare di campione e può essere ampiamente applicato a campioni di fisica, biologia, chimica, scienze dei materiali e dei servizi. In generale, le persone che si avvicinano per la prima volta a questa tecnica avranno difficoltà, perché richiede un po' di pazienza per trovare i parametri migliori per un determinato campione.

Bagno sonicare gli strumenti e il disco che sostiene il substrato in acqua ultra pura. Seguito da isopropanolo, e di nuovo acqua ultra pura, ciascuno per 10 minuti. Quando si punta ad un'alta risoluzione, qualsiasi contaminazione può avere conseguenze dannose.

Indossare sempre i guanti e assicurarsi che tutte le superfici o gli strumenti che entrano in contatto con il campione, il cantilever o la cella AFM siano puliti accuratamente. Dopo la sonicazione, asciugare ciascuno degli strumenti e il disco del campione sotto un flusso di azoto. Utilizzare un disco d'acciaio come supporto per la mica, per visualizzare i singoli ioni metallici assorbiti.

Pulire fisicamente le superfici che non possono essere pulite mediante sonicazione strofinandole con fazzoletti a strato singolo a basso contenuto di lanugine imbevuti di acqua ultra pura, isopropanolo e acqua ultra pura in sequenza. Lasciare asciugare la superficie all'aria per un massimo di 30 minuti. Quindi, preparare una piccola quantità di colla epossidica mescolando accuratamente i reagenti e posizionare circa 10 microlitri di resina epossidica sul disco campione in acciaio pulito.

Posizionare il substrato di mica sulla resina epossidica e fissarlo al disco d'acciaio esercitando una pressione sul substrato. Lasciare indurire la resina epossidica per diverse ore a una temperatura elevata secondo le specifiche del produttore. Quindi, premere con decisione un pezzo di nastro adesivo largo 2,5 centimetri sul substrato, in modo che l'intera faccia sia coperta, e staccare delicatamente lo strato superiore.

Ripeti questo processo due o tre volte fino a quando la mica non è liscia allo specchio. Immergere il chip a sbalzo in un bagno di isapropanolo seguito da acqua ultra pura ciascuno per 60 minuti. Quindi, esporre la punta ai raggi UV per un massimo di cinque minuti in modo da favorire la formazione di siti di idratazione stabili.

Tempi di sovraesposizione più lunghi possono danneggiare la punta o aumentarne il raggio di curvatura. Inserire il cantilever nel supporto del cantilever dell'AFM e pipettare 25 microlitri di liquido di imaging sul cantilever e sulla punta per pre-bagnare la superficie. Ciò ridurrà la comparsa di bolle d'aria quando ci si avvicina al campione.

Fondere il disco del campione e il substrato sul tavolino del campione e aggiungere una goccia del liquido di imaging al campione. Quindi collegare il supporto a sbalzo all'AFM. Avvicinare il cantilever e il campione in modo da formare un ponte capillare tra i fluidi sulla punta a sbalzo e quelli sul campione.

Utilizzare il software AFM per allineare il laser di misura vicino all'estremità della punta del cantilever. Successivamente, trova la frequenza di residenza del cantilever dal picco principale nel suo spettro termico. Se la deflessione del cantilever è calibrata, l'installazione del picco di residenza con un semplice modello di oscillatore armonico produce la costante elastica del cantilever.

Quindi, sintonizzare il cantilever trovando la sua risposta in ampiezza quando viene azionato esternamente su una gamma di frequenze vicine alla frequenza di risonanza identificata nello spettro termico. Regolare l'ampiezza di guida in modo che l'ampiezza dell'oscillazione libera sia di circa cinque nanometri. Questo corrisponde tipicamente a 0,2-0,8 volt sulla maggior parte degli AFM.

Quindi, regolare il set point di ampiezza a circa l'80% dell'ampiezza libera. Quindi, imposta i guadagni di feedback relativamente alti. Dopo essersi assicurati che non si verifichino instabilità o squilli, impostare la velocità di scansione iniziale a circa un hertz e la dimensione della scansione a 10 nanometri.

Avvia l'avvicinamento della punta alla superficie utilizzando il software di controllo AFM. Valutare se la punta ha raggiunto la superficie senza iniziare l'immagine modificando leggermente il valore del set point. Se la punta è in superficie, l'effetto sull'estensione della zona ZPA dovrebbe essere trascurabile.

Una volta che la punta ha raggiunto la superficie, ritrarre la zona ZPA e riaccordare il cantilever. La frequenza di risonanza si sarà probabilmente spostata a un valore più basso a causa delle interazioni tra i campioni di punta. Ora, modificare il set point a circa l'80% dell'ampiezza libera appena sintonizzata e attivare il cantilever per condurre una scansione quadrata di 10 per 10 nanometri della superficie in modalità di modulazione di ampiezza per verificare che i parametri di imaging siano adatti.

Verificare che i profili di traccia e ritracciamento si sovrappongano. In caso contrario, riduci ulteriormente il set point e prova ad aumentare i guadagni. Se l'immagine diventa rumorosa, ridurre i guadagni.

Ripetere l'operazione con una grande regione quadrata da uno a cinque micrometri del campione, a condizione che ciò sia possibile. Su campioni morbidi o biologici, ciò potrebbe causare la contaminazione del puntale. Ridurre le dimensioni della scansione a un valore adatto alla visualizzazione delle funzioni di interesse.

Questo può essere fino a 20 per 20 nanometri. Quindi, ridurre l'ampiezza di azionamento del cantilever abbastanza da consentire al circuito di feedback di ritrarre automaticamente la zona ZPA, migliorando la punta dalla superficie. Mentre il cantilever è lontano dalla superficie, regolare l'ampiezza dell'azionamento in modo che l'ampiezza del cantilever sia di uno o due nanometri da picco a picco.

Ridurre progressivamente il set point a piccoli passi, fino a quando la zona ZPA si estende nuovamente verso la superficie e l'immagine originale viene recuperata. Mantenere l'ampiezza del set point tra il 75% e il 95% della nuova ampiezza libera. Quindi, regolare nuovamente i guadagni, poiché è possibile utilizzare guadagni più elevati ad ampiezze inferiori senza introdurre rumore significativo.

Ottimizza il sistema per trovare la migliore combinazione di ampiezza libera, set point e guadagno per un'alta risoluzione. Le condizioni ottimali del sistema dipendono dal campione, dalle proprietà di bagnatura del liquido e anche dal cantilever utilizzato. Per le interfacce solvofile, utilizzare cantilever con una costante elastica da 0,5 a due newton per metro.

Utilizzando questa tecnica, sono state ottenute immagini con risoluzione subnanometrica su un'ampia gamma di campioni. I campioni morbidi mostrati qui includono un doppio strato lipidico, membrane viola di halobacterium salinarum, un monostrato autoassemblato di dimolecole anfofile e cristalli di acquaporina da una membrana di lente bovina. In ogni caso, vengono evidenziate le caratteristiche di interesse.

Le piccole ampiezze di oscillazione e gli elevati punti di regolazione riducono al minimo la forza esercitata dalla punta sul campione, consentendo di visualizzare in soluzione senza danni i fragili autoassemblaggi di lipidi nel doppio strato, proteine in biomembrane native e molecole anfofile. I materiali cristallini più duri, come la calcite, la titanite di stronzio, il carburo di silicio e i singoli ioni metallici assorbiti su una superficie di mica possono essere visualizzati utilizzando questo approccio, perché in ogni caso è il liquido interfacciale che viene effettivamente visualizzato, non il cristallo stesso. Una volta padroneggiata, questa tecnica fornisce una risoluzione a livello molecolare o atomico in un liquido quasi ogni volta che viene eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante tenere presente che è il liquido interfacciale ad essere ripreso. Ciò significa utilizzare le condizioni di imaging morbido. La contaminazione del puntale, del campione o del liquido è solitamente la causa principale del mancato raggiungimento di un'alta risoluzione.

In caso di dubbi, è spesso una buona idea pulire tutte le superfici a contatto con il liquido e riutilizzare le soluzioni di imaging. Anche il rumore esterno è dannoso per l'alta risoluzione. Un pavimento a basse vibrazioni, lontano da un condotto di ventilazione è migliore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottimizzare i parametri di imaging per ottenere un AFM ad alta risoluzione. Naturalmente, come per qualsiasi tecnica all'avanguardia, possono essere necessarie diverse prove per capire come visualizzare al meglio un campione, quindi la pazienza è fondamentale.