Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un'immagine con la risoluzione più elevata possibile in liquido, utilizzando un AFM commerciale operato in modalità di modulazione dell'ampiezza, nota anche come modalità tapping. Questo metodo contribuisce a spingere i limiti dell'operazione standard dell'AFM in liquido, utilizzando la migliore combinazione di parametri per un'elevata risoluzione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata con la maggior parte degli AFM commerciali e, di conseguenza, non richiede alcun equipaggiamento specializzato.

Il metodo qui presentato è rivolto a scienziati e tecnici che possiedono già alcune conoscenze di base sulla microscopia a forza atomica (AFM), ma desiderano ottenere risultati migliori dalla tecnica. Questo metodo non è specifico per un particolare tipo di campione ed è ampiamente applicabile a campioni provenienti da fisica, biologia, chimica, scienze dei materiali e scienze ingegneristiche. In generale, chi si avvicina per la prima volta a questa tecnica potrebbe incontrare difficoltà, poiché è necessaria una certa pazienza per individuare i parametri ottimali per un determinato campione.

Sottoporre a sonicazione in bagno gli strumenti e il disco che sostiene il substrato in acqua ultrapura, seguita da isopropanolo e nuovamente acqua ultrapura, per 10 minuti ciascuna. Quando si mira ad alta risoluzione, qualsiasi contaminazione può avere conseguenze dannose.

Indossare sempre guanti ed assicurarsi che tutte le superfici o gli strumenti che vengono a contatto con il campione, la mensola o la cella AFM siano accuratamente puliti. Dopo la sonificazione, asciugare ciascuno strumento e il disco del campione sotto un flusso di azoto. Utilizzare un disco di acciaio come supporto per la micca, al fine di ottenere immagini di singoli ioni metallici assorbiti.

Pulire fisicamente le superfici che non possono essere pulite per mezzo di ultrasuoni, strofinandole con tessuti monouso a basso rilascio di pelucchi imbevuti in acqua ultrapura, isopropanolo e acqua ultrapura, rispettivamente. Lasciare asciugare la superficie all'aria per un massimo di 30 minuti. Successivamente, preparare una piccola quantità di colla epossidica mescolando accuratamente i reagenti e depositare circa 10 microlitri di epossidica sul disco campione di acciaio pulito.

Posizionare il substrato di mica sull'epossidico e fissarlo al disco di acciaio applicando pressione sul substrato. Lasciare polimerizzare l'epossidico per diverse ore a una temperatura elevata, secondo le specifiche del produttore. Successivamente, premere saldamente un pezzo di nastro adesivo largo 2,5 centimetri sul substrato, in modo da coprire l'intera superficie, e staccare delicatamente lo strato superiore.

Ripetere questo processo due o tre volte fino a quando la mica non risulti liscia come uno specchio ad occhio nudo. Immergere il chip della mensola in un bagno di isopropanolo seguito da acqua ultrapura, ciascuno per 60 minuti. Successivamente, esporre la punta alla luce UV per un massimo di cinque minuti al fine di favorire la formazione di siti di idratazione stabili.

Tempi più lunghi di sovraesposizione possono danneggiare la punta o aumentarne il raggio di curvatura. Inserire la mensola nel supporto della mensola dell'AFM e pipettare 25 microlitri del liquido di imaging sulla mensola e sulla punta per bagnare preventivamente la superficie. Questo ridurrà la comparsa di bolle d'aria durante l'avvicinamento al campione.

Fondere il disco campione e il substrato sulla piattaforma del campione e aggiungere una goccia del liquido di imaging al campione. Successivamente, collegare il supporto della mensola al microscopio a forza atomica (AFM). Avvicinare la mensola e il campione fino a formare un ponte capillare tra i fluidi presenti sulla punta della mensola e quelli sul campione.

Utilizzare il software dell'AFM per allineare il laser di misurazione vicino all'estremità della punta del cantilever. Successivamente, individuare la frequenza di risonanza del cantilever a partire dal picco principale nel suo spettro termico. Se la deflessione del cantilever è stata calibrata, l'adattamento del picco di risonanza a un modello di oscillatore armonico semplice fornisce la costante elastica del cantilever.

Quindi, regolare la mensola agendo sulla sua risposta in ampiezza quando viene eccitata esternamente attraverso un intervallo di frequenze prossime alla frequenza di risonanza identificata nello spettro termico. Regolare l'ampiezza di eccitazione in modo che l'ampiezza di oscillazione libera sia di circa cinque nanometri. Questo valore corrisponde tipicamente a 0,2-0,8 volt nella maggior parte degli AFM.

Quindi, regolare il punto di set dell'ampiezza a circa l'80% dell'ampiezza libera. Successivamente, impostare i guadagni di retroazione relativamente alti. Dopo aver verificato che non si verifichino instabilità o oscillazioni, impostare la velocità iniziale di scansione a circa un hertz e la dimensione della scansione a 10 nanometri.

Avviare l'avvicinamento della punta alla superficie utilizzando il software di controllo del microscopio a forza atomica (AFM). Valutare se la punta ha raggiunto la superficie senza iniziare a effettuare l'immagine, modificando leggermente il valore del punto di regolazione. Se la punta si trova sulla superficie, l'effetto sull'estensione della zona ZPA dovrebbe essere trascurabile.

Una volta che la punta ha raggiunto la superficie, ritrarre la zona ZPA e ritarare la mensola. La frequenza di risonanza si sarà probabilmente spostata verso un valore inferiore a causa delle interazioni tra punta e campione. A questo punto, modificare il punto di regolazione a circa l'80% dell'ampiezza libera appena tarata e avvicinare la mensola per effettuare una scansione di 10 per 10 nanometri quadrati della superficie in modalità di modulazione dell'ampiezza, al fine di verificare che i parametri di imaging siano adeguati.

Verificare che i profili di tracciamento e di ritracciamento siano sovrapposti. In caso contrario, ridurre ulteriormente il valore di settaggio e provare ad aumentare i guadagni. Se l'immagine diventa rumorosa, ridurre i guadagni.

Ripetere l'operazione su una regione del campione di dimensioni comprese tra uno e cinque micrometri quadrati, se possibile. Su campioni morbidi o biologici, ciò potrebbe causare contaminazione della punta. Ridurre le dimensioni della scansione a un valore adatto per visualizzare le caratteristiche di interesse.

Questo può essere basso fino a 20 per 20 nanometri. Successivamente, ridurre l'ampiezza di eccitazione del cantilever sufficientemente perché il circuito di retroazione ritragga automaticamente la zona ZPA, sollevando la punta dalla superficie. Mentre il cantilever è lontano dalla superficie, regolare l'ampiezza di eccitazione in modo che l'ampiezza del cantilever sia da uno a due nanometri picco-picco.

Ridurre progressivamente il valore di riferimento a piccoli passi, finché la zona ZPA non si estende nuovamente verso la superficie e l'immagine originale non viene recuperata. Mantenere l'ampiezza del valore di riferimento tra il 75% e il 95% della nuova ampiezza libera. Successivamente, riregolare i guadagni, poiché a ampiezze più basse è possibile utilizzare guadagni più elevati senza introdurre rumore significativo.

Ottimizzare il sistema per individuare la migliore combinazione di ampiezza libera, punto di regolazione e guadagno per una risoluzione elevata. Le condizioni ottimali del sistema dipendono dal campione, dalle proprietà di bagnabilità del liquido e anche dal cantilever utilizzato. Per le interfacce solvofiliche, utilizzare cantilever con una costante elastica compresa tra 0,5 e 2 newton al metro.

Utilizzando questa tecnica, sono state ottenute immagini con risoluzione sub-nanometrica su un'ampia gamma di campioni. I campioni teneri mostrati qui includono un doppio strato lipidico, membrane viola da halobacterium salinarum, uno strato autoassemblato di dimolecole anfipatiche e cristalli di acquaporina da una membrana del cristallino bovino. In ogni caso, le caratteristiche di interesse sono evidenziate.

Le piccole ampiezze di oscillazione e i punti di regolazione elevati minimizzano la forza esercitata dalla punta sul campione, consentendo di ottenere immagini in soluzione degli assemblaggi fragili di lipidi nel doppio strato, delle proteine nelle biomembrane native e delle molecole anfifiliche senza provocarne danni. Materiali cristallini più duri, come calcite, titanito di stronzio, carburo di silicio e ioni metallici singoli assorbiti su una superficie di micace possono essere analizzati con questo approccio, poiché in ogni caso è il liquido interfaciale ad essere effettivamente immaginato, e non il cristallo stesso. Una volta padroneggiata, questa tecnica fornisce quasi sempre una risoluzione a livello molecolare o atomico in ambiente liquido quando viene eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante tenere presente che il liquido in fase interfaciale è quello che viene immaginato. Ciò implica l'uso di condizioni di imaging delicate. La contaminazione della punta, del campione o del liquido è solitamente la causa principale del mancato raggiungimento di un'elevata risoluzione.

In caso di dubbio, è spesso consigliabile pulire tutte le superfici a contatto con il liquido e riutilizzare le soluzioni per l'acquisizione di immagini. Anche il rumore esterno è dannoso per l'alta risoluzione. Un pavimento a bassa vibrazione, lontano da un condotto di ventilazione, è preferibile.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottimizzare i parametri di acquisizione per ottenere una microscopia a forza atomica ad alta risoluzione. Ovviamente, come per qualsiasi tecnica all'avanguardia, possono essere necessari diversi tentativi per capire come acquisire al meglio un campione, quindi la pazienza è fondamentale.