Name: Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Impara la procedura di pulp-capping diretto nei topi per studiare la guarigione della polpa dentale e la formazione di dentina riparativa. Questo metodo consente di valutare le risposte biologiche in vivo.

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Questo studio è stato sostenuto da R01DE023348 (RHK) da NIDCR / NIH e la Research Grant Facoltà (RHK) dal Consiglio per la ricerca del Senato Accademico della divisione di Los Angeles della University of California.

I topi sono stati acquistati da Jackson Laboratory e conservati in un Vivarium priva di agenti patogeni e la Divisione di Medicina di Laboratorio UCLA animali (àlam). Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali approvate dal comitato per la ricerca degli animali del Cancelliere (ARC # 2016-037). 1. mouse anestesia <ol><li> Utilizzare otto settimane di età femminile topi C57 / BL6 (n = 3). </li><li> Anestetizzare i topi utilizzando soluzioni (5 mg / kg di peso del mouse) ketamina (80-120 mg / kg di peso del mouse) / xilazina e somministrare per via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg. </li><li> Preparare ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluzioni e somministrarli via intraperitoneale (ip) alla dose di 10 ml / kg. </li><li> Verificare che i topi sono completamente anestetizzati eseguendo un pinch punta. </li></ol> 2. Procedura Pulp-tappatura <ol><li> Posizionare il supporto bocca nella bocca del mouse. </li><li> Fissare il supporto bocca sul tavolo in modo che l&#39;haL&#39;annuncio è rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare il microscopio (10X) sulla parte superiore della bocca in modo che il primo molare superiore è completamente visibile. </li><li> Uso del ¼-tutto fresa in un manipolo ad alta velocità a 200.000 rpm, rimuovere la parte smalto del dente nel mezzo finché la polpa è visibile attraverso la dentina trasparente. Non esporre la polpa con la fresa. </li><li> Utilizzo di un K-file di endodonzia # 15 (diametro di 150 micron), forare attraverso la dentina ed esporre la polpa. NOTA: Particolare attenzione dovrebbe essere presa in modo che i detriti dentina non viene spinto nella polpa. Ciò può essere evitato ruotando il file K trimestrale e quindi tirando il K-FILE out. </li><li> Mescolare MTA con H 2 O sterile secondo le istruzioni del produttore. Consegnare e posizionare il MTA sulla polpa esposta con la punta di un esploratore. Utilizzare il lato posteriore del cono di carta (fine) per imballare la MTA nella polpa esposta con lievi colpetti. Il lato più spesso del punto di carta sia piatta e quindi consenteper il corretto condensazione del MTA nella polpa esposta. </li><li> Etch il dente per 15 s posizionando il mordenzante acido fosforico al 35% dove solo copre il dente. Fare particolare attenzione a limitare il posizionamento del mordenzante, in quanto può irritare i tessuti gengivali. NOTA: Il mordenzante viene in una siringa e viene utilizzato per irruvidire superfici dentali in modo che gli adesivi dentali possono fluire in mediare bonding micromeccanica sul dente. Poiché sono viscoso, può essere indipendente applicando piccole quantità direttamente sul dente. </li><li> Utilizzare aspirazione negativo-pressione per rimuovere il mordenzante. Utilizzare un batuffolo di cotone che viene leggermente imbevuto con H 2 O per rimuovere i residui del mordenzante. Ripetere questa operazione fino a quando il mordenzante viene completamente rimosso dal dente. </li><li> Utilizzando un panno di aria compressa, asciugare delicatamente il dente. </li><li> Applicare gli adesivi dentali utilizzando retro della punta di carta. </li><li> Rendere lo strato adesivo sottile con aria compressa per 3 s. </li><li> Cure gli adesivi dentali per 20 s utilizzando l&#39;unità di polimerizzazione-luce. </li><li> Posizionare il composito fluido in piccole quantità sul dente che è stato ricoperto con MTA. Utilizzare la punta di un esploratore di fluire il composito nelle scanalature dei denti. </li><li> Curare il composito per 30 s usando una unità fotopolimerizzabile per polimerizzare esso. Verificare che il composito è completamente guarito e duro con l&#39;esploratore. </li></ol> 3. Post-op cura <ol><li> Somministrare Carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea (SC) immediatamente dopo la procedura pulp-capping. </li><li> Mettere i topi su una piastra elettrica a bassa potenza per tenere gli animali al caldo prima che si svegliano. </li><li> Riportare i topi per vivaio per l&#39;edilizia abitativa. </li></ol> 4. Tissue Procurement <ol><li> Dopo 5 - 6 settimane eutanasia i topi mediante dislocazione cervicale in una condizione di anestesia completa con isoflurano. </li><li> Rimuovere con attenzione il mascellare superiore fuori dalla base del cranio e metterlo in un tubo da 50 ml. Fissare il entire mascellare che contiene sia il dente pasta-livellata e dente uncapped controlaterale in 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4, a 4 ° C per una notte, e quindi memorizzare in una soluzione di etanolo al 70%. NOTA: Paraformaldeide è tossico e cancerogeno. L&#39;uso corretto paraformaldeide deve essere monitorata come descritto nelle procedure operative standard (SOP). </li><li> Eseguire la scansione del mascelle mouse utilizzando la scansione μCT. Per fissare il mascelle durante la scansione, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e metterli nel tubo di coltura cellulare da 15 ml. </li></ol> 5. μCT Scansione <ol><li> Preparare i campioni per la scansione μCT. In breve, avvolgere i campioni con una garza imbevuta con il 70% di etanolo e fissarli in un generico coltura cellulare tubo conico da 15 ml. Montare il tubo sul palco scansione μCT, come indicato nelle istruzioni del produttore. </li><li> Impostare la sorgente di raggi X per una corrente di 145 μA, una tensione di 55 kVp, e un tempo di esposizione di 200 ms. </li><li> Eseguire acquisizione di immagini con lo scanner μCT con una risoluzione di 20 micron e con un filtro Al 0,5 mm. </li><li> Ricostruire l&#39;immagine e visualizzarla 11. </li><li> Una volta che la scansione μCT, avviare la decalcificazione con 5% EDTA e 4% di saccarosio in PBS (pH 7,4) per 2 settimane. </li></ol> 6. Trattamento dei tessuti e la colorazione <ol><li> Incorporare i tessuti decalcificati in paraffina. Prima di embedding, tagliare mascellare effettuando un taglio sagittale immediatamente anteriore al primo molare. Mentre incorporamento, posizionare questa superficie verso il basso, in modo tale che la sezione longitudinale del primo molare è la superficie di taglio. </li><li> Utilizzando il microtomo, preparare 5 scivoli micron di spessore. Le aree polpa-tappatura solito coincidono con la radice distopalatal (DP), che può essere utilizzato come punto di riferimento. Determinare l&#39;area precisa di interesse esaminando l&#39;istologia sotto il microscopio ottico e confrontando le immagini μCT. </li><li> Per colorazione H &amp; E, deparaffinize e reidratare i vetrini con xilene (2x) ed etanolo in serie diluito (100% EtOH 2x, il 95% EtOH 2x, e il 70% EtOH 1x). </li><li> Sciacquare i vetrini con acqua corrente. </li><li> Macchia con la soluzione ematossilina per 2,5 minuti e risciacquare con acqua di rubinetto. </li><li> Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 min. </li><li> Macchia con la soluzione Eosina per 1 minuto e sciacquare con acqua di rubinetto. </li><li> Disidratare con etanolo serialmente diluito (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, e il 100% EtOH 3x) e xilene (3x). </li><li> Montare i vetrini con soluzione di montaggio. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Attualmente, ci sono diversi modelli sperimentali differenti disponibili per convalidare gli effetti in vivo di materiali dentali, ponteggi, o fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali odontogena polpa dentale (DPSCs) 13. Questi modelli includono ectopica trapianto autologo di DPSCs in un organo, come la capsula renale, o il trapianto sottocutaneo di DPSCs in topi immunocompromessi con ponteggi 14,15. Tuttavia, questi metodi sono limitate dal fatto che il loro effe...

Le carie dentali sono una delle malattie orali più diffuse e la principale causa di interventi chirurgici alla dentizione in quasi tutti gli individui1,2. La prognosi degli interventi chirurgici e dei restauri di un dente dipende in gran parte da una corretta risposta pulpare e da una guarigione della ferita. Infatti, le carie dentali che penetrano in profondità attraverso lo smalto e la dentina portano spesso all'esposizione del tessuto pulpare sottostante che è spesso "tappato" con materiali dentali, come l'idrossido di calcio (Ca(OH)2) o i cementi idraulici calcio-silicato (HCSC), compresi gli aggregati di triossido minerale (MTA). L'obiettivo finale di tale procedura di polp-capping è quello di accelerare la guarigione delle ferite pulpali rigenerando la dentina riparativa, una barriera fisica che funziona come un "sigillo biologico" per proteggere il tessuto pulpare sottostante e per aumentare l'aspettativa di vita del dente e la salute orale generale. Tuttavia, il meccanismo alla base della guarigione delle ferite pulpari e della formazione riparativa della dentina non è completamente compreso.
Per comprendere meglio i meccanismi di guarigione delle ferite pulpali e la formazione riparativa della dentina in vivo, sono stati precedentemente utilizzati diversi animali, tra cui scimmie, cani e maiali3-5. Tra questi, i ratti sono spesso usati perché sono di dimensioni relativamente più piccole rispetto agli altri animali, ma i loro denti sono abbastanza grandi da eseguire l'incappucciamento diretto della polpa senza alcuna difficoltà tecnica6-10. Questi modelli animali sono alternative ideali agli studi sull'uomo per esaminare le risposte pulpari e la formazione riparativa della dentina. Tuttavia, il loro utilizzo è limitato a studi osservazionali a livello cellulare e forniscono scarsamente informazioni meccanicistiche durante la formazione riparativa della dentina a livello molecolare.
I recenti progressi tecnici nell'ingegneria genetica hanno fornito strumenti di ricerca inestimabili e indispensabili: topi che ospitano un gene sovraespresso o eliminato, che sono strumentali allo studio dei meccanismi molecolari delle malattie umane in vivo. Il numero di diversi ceppi di topi transgenici o knockout che sono strategicamente inducibili in modo specifico per le cellule è in continua crescita nella comunità scientifica. Pertanto, l'esame della guarigione delle ferite pulpali e della rigenerazione riparativa della dentina in questi topi aiuterebbe notevolmente ad accelerare la nostra comprensione di questi processi a livello molecolare. Tuttavia, l'uso dei topi è notevolmente attenuato, poiché l'esecuzione di una procedura di incappucciamento della polpa su un dente di topo è tecnicamente impegnativa a causa delle sue dimensioni in miniatura. Qui, presentiamo il nostro metodo riproducibile di eseguire il capping diretto della polpa nei topi per la valutazione della guarigione delle ferite pulpali e la formazione riparativa della dentina in vivo.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio BM-LED</td><td>MEIJI Techno</td><td></td><td>Microscope&nbsp;</td></tr><tr><td>Optima MCX-LED&nbsp;</td><td>Bien Air Dental</td><td>1700588-001</td><td>Motore elettrico a motore</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Henry schein salute animale</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>Fresa rotonda da 1/4</td><td>Brasseler</td><td>001092T0</td><td></td></tr><tr><td>Lima K endodontica</td><td>Roydent</td><td>98947</td><td></td></tr><tr><td>ProRoot MTA</td><td>Dentsply</td><td>PROROOT5W</td><td>MTA</td></tr><tr><td>Punto carta</td><td>Henry schein</td><td>100-3941</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Etch</td><td>Ultradent prodotto Inc.</td><td></td><td>Mordenzante all'acido fosforico</td></tr><tr><td>OptiBond SoloPlus</td><td>Kerr</td><td>29669</td><td>Adesivi</td></tr><tr><td>Coltolux LED</td><td>Coltene/whaledent Inc.</td><td>C7970100115</td><td>Unità di illuminazione polimerizzante</td></tr><tr><td>Tinta di caratterizzazione</td><td>Bisco</td><td>T-14012</td><td>Composito fluido</td></tr><tr><td>Skyscan</td><td>Breuker</td><td>1275</td><td>uCT scanner</td></tr><tr><td>Microm</td><td>Thermo</td><td>HM355S</td><td>Microtomo</td></tr><tr><td>Ematossilina-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>7221</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16</td><td>Soluzione di montaggio</td></tr></tbody></table>

sviluppo di un modello diretto pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

La polpa dentale è un organo vitale di un dente completamente protetto da smalto e dentina. Quando la polpa è esposta a causa di lesioni cariogene o iatrogene, viene spesso ricoperta con materiali biocompatibili per accelerare la guarigione delle ferite pulpare. L'obiettivo finale è quello di rigenerare la dentina riparativa, una barriera fisica che funziona come un "sigillo biologico" e protegge il tessuto pulpare sottostante. Sebbene questa procedura di incappucciamento diretto della polpa sia stata a lungo utilizzata in odontoiatria, il meccanismo molecolare alla base della guarigione delle ferite pulpari e della formazione riparativa della dentina è ancora poco compreso. Per indurre la dentina riparativa, l'incappucciamento della polpa è stato eseguito sperimentalmente in animali di grandi dimensioni, ma meno nei topi, presumibilmente a causa delle loro piccole dimensioni e delle conseguenti difficoltà tecniche. Qui, presentiamo un metodo dettagliato e passo dopo passo per eseguire una procedura di incappucciamento della polpa nei topi, inclusa la preparazione di una cavità simile a quella di Classe I, il posizionamento di materiali per l'incappucciamento della polpa e la procedura di restauro utilizzando il composito dentale. Il nostro modello murino di polp-capping sarà determinante nello studio dei meccanismi molecolari fondamentali della guarigione delle ferite pulpali nel contesto della dentina riparativa in vivo, consentendo l'uso di topi transgenici o knockout che sono ampiamente disponibili nella comunità di ricerca.

Qui, abbiamo dimostrato le procedure passo-passo per eseguire polpa di tappatura su topi denti. Uno degli aspetti chiave della polpa di tappatura nei topi è di avere l'apparato adeguato. A questo proposito, avendo il microscopio con un ingrandimento di potenza 10X è essenziale (Figura 1A). Per creare una preparazione di Classe-I-come nel dente, abbiamo utilizzato una fresa da ¼ di giro in un manipolo elettrico ad alta velocità a 200.000 giri al minuto (Figura 1B)...

Descriviamo un metodo passo-passo di eseguire incappucciamento diretto su topi denti per la valutazione della polpa guarigione della ferita e la formazione dentina riparativa in vivo.

Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare la procedura diretta di polp-capping nei topi. Questo metodo può aiutarti a rispondere a domande chiave nella biologia della cellulosa, come ad esempio come guarisce la polpa o come si forma la dentina riparativa, quando si posizionano i materiali di copertura della polpa intrappolati sulla polpa esposta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'effettiva procedura di incappucciamento diretto della polpa eseguita nell'uomo può essere eseguita anche nei topi, esattamente nello stesso modo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono al miglioramento delle proprietà dei materiali per salvare i denti che altrimenti sarebbero destinati a trattamenti più invasivi, come la terapia canalare. Dopo aver adeguatamente anestetizzato il mouse per la procedura, posizionare il supporto per la bocca nella sua bocca e fissare l'altra estremità al tavolo in modo che la testa sia rivolta verso l'alto. Utilizzando una buona illuminazione e uno stereoscopio, osservare il primo molare mascellare.Quindi, utilizzando la fresa a un quarto di giro in un manipolo ad alta velocità a 200.000 giri/min, rimuovere la regione centrale del

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Un modello murino di guarigione della ferita cutanea che può essere utilizzato per valutare composti terapeutici in contesti fisiologici e fisiopatologici.

Modello murino di guarigione delle ferite

Qui, presentiamo un protocollo per indurre localmente la parodontite apicale nei topi. Mostriamo come praticare un foro nel dente del topo ed esporre la sua polpa, al fine di causare infiammazione locale. Sono inoltre dimostrati metodi di analisi per studiare la natura di questa infiammazione, come la micro-TC e l'istologia.

Indurre la parodontite apicale nei topi

Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l'altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

Descriviamo l'isolamento, la dispersione e la placcatura delle cellule primarie della polpa dentale (DP) con neuroni trigeminali (TG) coltivati in cima ai filtri transwell sovrastanti. Le risposte cellulari delle cellule DP possono essere analizzate con l'immunofluorescenza o l'analisi RNA/proteina. L'immunofluorescenza dei marcatori neuronali con microscopia confocale consente l'analisi delle risposte di escrescenza neurite.

Un metodo di co-cultura per studiare l'escrescenza neurite in risposta ai segnali paracrini dentali

Questo protocollo dimostra i dettagli passo-passo su come estrarre il primo molare mandibolare nel topo. Fornisce un metodo alternativo per i ricercatori che si concentrano sulla guarigione e la rigenerazione della mandibola.

L'istituzione di un modello murino di guarigione dell'orbita di estrazione molare mandibolare

Questo articolo presenta un protocollo semplificato per stabilire un modello di pulpite nei topi utilizzando un innovativo bavaglio orale, seguito da una successiva analisi istologica.

Istituzione di un modello di esposizione alla polpa murina con un nuovo bavaglio orale per la ricerca sulla pulpite

Questo studio presenta due tecniche sperimentali cruciali: la costruzione di un modello di ferita murina per valutare la chiusura della ferita e la preparazione di sospensioni unicellulari dalla pelle murina per preservare la vitalità cellulare.

Modelli di ferita nel topo e preparazione di sospensioni a cellula singola

La microdurezza è una proprietà meccanica e un parametro informativo per la valutazione della fisiopatologia dei tessuti duri. Qui, dimostriamo un protocollo standardizzato (preparazione del campione, lucidatura, superficie piana e siti di indentazione) per l'analisi della microdurezza nell'osso dentale e alveolare in modelli di malattia orale dei roditori, vale a dire, fluorosi dentale e riassorbimento osseo parodontale indotto dalla legatura.

Misurazioni di microdurezza su dente e osso alveolare in modelli di malattia orale dei roditori

Le ferite rappresentano una sfida sanitaria globale. Questo studio ha sviluppato una cabina fotografica standardizzata utilizzando la planimetria digitale per ridurre al minimo la variabilità della misurazione della ferita. Il monitoraggio delle ferite nei topi per 14 giorni ha rivelato un aumento iniziale dell'area e del perimetro della ferita, seguito da una chiusura graduale. Questa metodologia può aiutare a valutare la cinetica di chiusura della ferita in modelli preclinici.

Planimetria digitale per la valutazione della cinetica di chiusura della ferita in un modello murino

Piccole tecniche di imaging consentono di animali esami diagnostici seriali e interventi terapeutici in vivo. Recentemente, l'ambito di applicazione è notevolmente ampliato e comprende attualmente la valutazione dello sviluppo del tumore del colon, la guarigione delle ferite e il monitoraggio di infiammazione. Questo protocollo illustra le diverse potenziali applicazioni di endoscopia murino.

Murino Endoscopia per In Vivo Guarigione Imaging Multimodale di Cancerogenesi e valutazione della ferita intestinale e infiammazione

Impara la procedura di pulp-capping diretto nei topi per studiare la guarigione della polpa dentale e la formazione di dentina riparativa. Questo metodo consente di valutare le risposte biologiche in vivo.

Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi (Video) | JoVE Journal

Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

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