Sviluppo di un modello diretto Pulp-capping di valutazione dei polpa dentale guarigione delle ferite e riparativa dentina formazione nei topi

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare la procedura diretta di polp-capping nei topi. Questo metodo può aiutarti a rispondere a domande chiave nella biologia della cellulosa, come ad esempio come guarisce la polpa o come si forma la dentina riparativa, quando si posizionano i materiali di copertura della polpa intrappolati sulla polpa esposta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'effettiva procedura di incappucciamento diretto della polpa eseguita nell'uomo può essere eseguita anche nei topi, esattamente nello stesso modo.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono al miglioramento delle proprietà dei materiali per salvare i denti che altrimenti sarebbero destinati a trattamenti più invasivi, come la terapia canalare. Dopo aver adeguatamente anestetizzato il mouse per la procedura, posizionare il supporto per la bocca nella sua bocca e fissare l'altra estremità al tavolo in modo che la testa sia rivolta verso l'alto. Utilizzando una buona illuminazione e uno stereoscopio, osservare il primo molare mascellare.

Quindi, utilizzando la fresa a un quarto di giro in un manipolo ad alta velocità a 200.000 giri/min, rimuovere la regione centrale dello smalto del dente fino a quando la polpa è visibile attraverso la dentina trasparente. Fare attenzione a non penetrare nella polpa. Successivamente, utilizzando un no.

15 K-lima endodontica, perforare la dentina ed esporre la polpa. Non spingere detriti nella polpa; Questo può essere evitato ruotando la K-File trimestralmente, quindi estraendo la K-File. Ora, prepara l'MTA e, usando l'esploratore, consegna l'MTA, quindi impacchettalo nella regione esposta usando il lato posteriore della punta di carta e picchiettando delicatamente.

Successivamente, utilizzando una siringa caricata con il mordenzante di acido fosforico al 35%, coprire il dente con il mordenzante, evitando i tessuti gengivali, e lasciare agire il mordenzante per 15 secondi. Dopo 15 secondi, aspirare il mordenzante dal dente e utilizzare un applicatore di cotone inumidito con acqua per rimuovere eventuali residui di mordenzante. Succhiare e strofinare fino a rimuovere tutto il mordenzante.

Seguire applicando gli adesivi dentali utilizzando il retro della punta di carta. Assottigliare lo strato adesivo soffiandolo con aria compressa per alcuni secondi. Quindi polimerizzare l'adesivo per 30 secondi con la luce appropriata.

Ora, posiziona piccole quantità di composito sul dente usando la punta dell'esploratore per far fluire il composito nelle scanalature del dente. Una volta applicato, polimerizzare il composito per 30 secondi. Dopo l'eutanasia del topo e la rimozione dell'intera mascella, posizionare la mascella in paraformaldeide al 4% in PBS a pH 7,4.

Mantenere il fazzoletto a 4 gradi Celsius per una notte e la mattina seguente trasferirlo in etanolo al 70% per la conservazione fino a quando non può essere lavorato. Per eseguire una micro TAC della mascella, fissarla prima in una garza imbevuta di etanolo al 70%, quindi imballarla in una provetta per colture cellulari da 15 millilitri. Quindi montare il tubo sul tavolino di scansione micro CT.

Quindi, impostare la sorgente di raggi X in modo che fornisca una corrente di 145 microampere con 55 kilovolt di picco per 200 millisecondi. Utilizzando un filtro in alluminio da 0,5 millimetri, è possibile acquisire immagini con una risoluzione di 20 micron. Al termine delle scansioni, iniziare a decalcificare la mascella con il 5% di EDTA e il 4% di saccarosio in PBS, a un pH di 7,4.

Lascia andare questa reazione per due settimane a 4 gradi Celsius. Dopo aver incorporato la mascella, fare delle fette spesse cinque micron. Le aree di copertura della polpa di solito coincidono con la radice palatale distale, che può essere utilizzata come punto di riferimento.

Determina l'area di interesse precisa esaminando l'istologia al microscopio ottico e confrontando i risultati con le scansioni micro CT. Per la colorazione H&E, rimuovere la paraffina e reidratare i vetrini con due bagni in xilene per alcuni minuti ciascuno. Quindi passarli attraverso una serie di etanolo diluito in serie.

Ogni bagno deve essere applicato per un solo minuto. Seguire la reidratazione con un risciacquo. E poi applicare la soluzione di emotossilina per due minuti e mezzo.

Rimuovere il colorante con un risciacquo, quindi mettere i vetrini in etanolo al 95% per un minuto. Quindi, colorare i vetrini con una soluzione di eosina per un minuto, quindi risciacquarli. Invertire le fasi di idratazione per disidratare i tessuti macchiati, iniziando con l'etanolo.

Quindi, trattali con xilene. I vetrini possono quindi essere montati e visualizzati. Utilizzando le procedure descritte, il polp-capping è stato eseguito su topi di 8 settimane.

Sei settimane dopo, le loro mascelle sono state raccolte ed esaminate. Curiosamente, la colorazione H&E ha rivelato la formazione di dentina in tutta la camera pulpare e nei canali radicolari. Comparativamente, il molare non incappucciato non mostrava la stessa formazione di dentina.

Nel molare incappucciato, c'erano caratteristiche sia di formazione simile alla dentina che a quella ossea, poiché sia i tubuli dentinali che gli osteociti sono stati trovati nella dentina riparativa, suggerendo che la polpa danneggiata può essere mineralizzata sia dagli odontoblasti residenti che dagli osteoblasti immigrati. L'uso della colorazione immunoistochimica DMP1 ha ulteriormente confermato l'aumento delle attività delle cellule che formano la dentina riparatrice. Proprio come i veri studi clinici odontoiatrici, avere un assistente è estremamente utile.

Ad esempio, con un assistente, questa tecnica può essere eseguita in soli dieci minuti, una volta padroneggiata. È importante sottolineare che, quando si espone la polpa, ricordarsi di usare l'endofile, non la fresa. E quando consegnate l'MTA, fate attenzione.

Non dimenticare che lavorare con fissativi come la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso. Devono essere sempre prese precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale.