Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di immobilizzare le strutture cellulari delle cellule vegetali mediante sostituzione ad alta pressione, congelamento e congelamento rapido per la successiva visualizzazione mediante microscopia elettronica a trasmissione. Ciò si ottiene preparando con cura un campione di tessuto per il congelamento codificandolo con un crioprotettore per garantire che il tessuto venga danneggiato al minimo durante il congelamento ad alta pressione. In una seconda fase, il campione viene rapidamente congelato ad alta pressione, che immobilizza i componenti cellulari e limita la formazione di ghiaccio cristallino, ottenendo cellule con morfologia intatta.

Successivamente viene eseguita una rapida sostituzione libera per sostituire l'acqua cellulare con solventi organici e per introdurre fissativi come il tetrossido di osmio, legando e stabilizzando così le ultra strutture cellulari. Si ottengono risultati che dimostrano che il congelamento ad alta pressione e la sostituzione rapida del congelamento preservano efficacemente le strutture cellulari e la morfologia delle piante sulla base della microscopia elettronica a trasmissione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la fissazione chimica convenzionale è che H-P-F-Q-F-S immobilizza il contenuto cellulare in millisecondi, riducendo al minimo la formazione di artefatti.

In generale, il protocollo QFS è impegnativo per un principiante, quindi si consiglia che due persone lavorino insieme fino a quando gli utenti non si sentono a proprio agio con la procedura. I dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti criogenici e occhiali, devono essere sempre indossati quando si maneggia l'azoto liquido Riempire una scatola isolata contenente supporti per fiale criogeniche con azoto liquido in modo che i supporti siano completamente coperti. L'uso fissativo durante la sostituzione rapida del congelamento o QFS è l'1% di osmio, tetrossido e lo 0,1% di acetato di orinatoio in acetone.

Dopo aver preparato un grande volume di soluzione seguendo tutte le avvertenze di sicurezza, aliquote di 1,5 millilitri vengono erogate in fiale criogeniche e conservate congelate in azoto liquido. Posizionare il numero appropriato di fiale criogeniche etichettate contenenti la sostituzione del gelo o il mezzo FS nell'alluminio, due supporti nell'azoto liquido. Con questo protocollo, è possibile inserire in un'unica fiala fino a quattro dischi, ciascuno contenente un singolo campione, circa un'ora o un'ora e mezza prima della preparazione del campione.

Il congelatore ad alta pressione deve essere acceso e preparato per il funzionamento. Questo protocollo richiede anche la pasta di lievito come crioprotettore extracellulare per riempire lo spazio intorno al campione. Nel portacampioni mescolare un po' di lievito di birra con un volume approssimativamente uguale di metanolo al 10% usando uno stuzzicadenti fino a ottenere una pasta liscia.

Con una consistenza del preparato per pancake, la quantità di pasta necessaria dipende dal numero di campioni per 10 campioni o meno, la pasta può essere miscelata in una provetta da microcentrifuga. Per preparare un campione per il congelamento ad alta pressione o HPF, rimuovere una foglia di interesse dalla pianta e posizionarla delicatamente su un pezzo di cera dentale o su un'altra superficie di taglio. Usa un punzone da 0,2 millimetri per tagliare un campione dalla foglia.

La parte più critica di questa procedura è la preparazione del campione per il caricamento in questo portacampioni. Se il campione è mal maneggiato, nessun altro passaggio riscatterà il costo del danno Lavorando al microscopio da dissezione. Trova il lato di 0,2 millimetri del portacampioni di tipo A e ricoprilo con pasta di lievito.

Posizionare il disco fogliare nel portacampioni, stendere la pasta con un pennello fine per assicurarsi che il disco sia completamente riempito e che la pasta sia a livello del bordo del supporto. Posizionare il portacampioni nel portacampioni, che deve essere asciutto e a temperatura ambiente, coprire il campione con un portacampioni di tipo B su una superficie piana verso il basso. Posizionare la scatola isolata preparata in precedenza sopra la macchina.

Portare il campione nel portacampioni al congelatore ad alta pressione. Inserire il portacampioni contenente il campione nel congelatore ad alta pressione. Avviare un ciclo di congelamento premendo il pulsante automatico del getto, che dovrebbe completarsi in un secondo o due lavorando il più rapidamente possibile.

Rimuovere il portacampioni dalla macchina e posizionare la punta. Conservare il campione nell'azoto liquido nella scatola isolata. Immergere le punte di due paia di pinze nell'azoto liquido per raffreddarle dopo il congelamento.

I supporti devono essere maneggiati solo con pinze raffreddate ad azoto liquido che lavorano sotto l'azoto liquido. Aprire il portacampioni ruotandolo in senso antiorario e rimuovere il portacampioni dal supporto con una pinza raffreddata ad azoto liquido, assicurandosi che il disco sia sempre nell'azoto liquido o nel vapore. Aprire una fiala criogenica contenente terreni FS e posizionare il coperchio sul lato della scatola.

Tenere la fiala criogenica con una pinza preraffreddata e utilizzare l'altra pinza per posizionare il disco nella fiala criogenica. Riavvitare il coperchio della fiala criogenica facendo attenzione a non intrappolare azoto liquido nella fiala. L'azoto liquido si espande di 700 volte durante il riscaldamento e qualsiasi azoto liquido intrappolato può causare esplosioni durante questo periodo.

Ripetere questo processo fino a quando tutti i campioni desiderati non sono stati congelati. Nella stessa fiala possono essere inseriti più dischi fogliari contenenti lo stesso tipo di campione. Per iniziare i preparativi per la sostituzione libera, immergere completamente un blocco riscaldante in alluminio in azoto liquido per 10 minuti o fino a quando il nucleato non si ferma nell'ebollizione.

Nel frattempo, posizionare uno strato di ghiaccio secco sul fondo del contenitore da utilizzare come camera QFS. È possibile utilizzare un contenitore di polistirolo o un secchiello per il ghiaccio con ghiaccio secco tritato o pellet. Per questa procedura è necessaria una sonda di temperatura.

Una termocoppia viene posizionata attraverso la parte superiore di una fiala criogenica in modo che raggiunga il fondo del tubo e il coperchio del tubo sia sigillato con resina in modo che non fuoriesca liquido. Riempire il tubo con 1,5 millilitri di acetone all'inizio di ogni ciclo QFS. Assicurarsi che i coperchi delle fiale siano ben avvitati in modo che il terreno FS non fuoriesca durante la fs.

Inserire rapidamente le fiale criogeniche contenenti i campioni insieme alla sonda di temperatura nelle file centrali del blocco riscaldante. Inizia a registrare la temperatura utilizzando guanti criogenici isolanti o pinze grandi. Versare tutto l'azoto liquido dal blocco riscaldante.

Fare attenzione a non versare le fiale criogeniche. Posizionare il blocco contenente le fiale nello strato di ghiaccio secco nella camera QFC. Assicurati che il blocco sia posizionato in modo che i tubi siano disposti orizzontalmente, ma con una leggera inclinazione verso l'alto.

Non dovrebbero esserci perdite se vengono utilizzate le fiale criogeniche corrette. Imballare la camera QFS con ghiaccio secco in modo che i tubi FS siano coperti. Sebbene non sia necessario coprire la parte superiore del blocco, posizionare il coperchio sulla camera.

Il QFS deve essere eseguito in cappa aspirante. Posizionare una camera QFS con i campioni su un agitatore rotante a piattaforma e ruotare a 125 giri/min per 120 minuti. Durante questo periodo, la temperatura del blocco dovrebbe aumentare gradualmente fino a circa -80 gradi Celsius.

L'agitazione garantisce la miscelazione dei componenti per una migliore fs. Dopo due ore, rimuovere il ghiaccio secco dalla camera. Utilizzare un guanto criogenico per sollevare rapidamente il blocco riscaldatore dalla camera QFS e versare rapidamente il ghiaccio secco in un contenitore secondario.

Continuate ad agitare per un'altra ora. Durante questo periodo, la temperatura dovrebbe aumentare a circa -15 gradi Celsius a --20 gradi Celsius. Alla fine dell'ora, rimuovere i campioni e la sonda di temperatura dalla camera QFS e posizionarli sull'agitatore a temperatura ambiente per altri 10-15 minuti fino a raggiungere la temperatura ambiente.

Interrompere la registrazione della temperatura quando viene eseguita la sostituzione rapida e gratuita. Rimuovere con cautela il terreno FS da ogni fiala criogenica con una pipetta di trasferimento in plastica e metterlo nell'apposito contenitore per i rifiuti tossici. Lavare i campioni quattro volte con acetone al 100%.

Raccogliere i primi due lavaggi e metterli nel contenitore dei rifiuti tossici. Fare attenzione a non scartare i campioni quando si rimuove l'acetone. Dopo che i campioni sono stati lavati, utilizzare una pinza fine per rimuovere i campioni di tessuto dal portacampioni.

Mantenere i campioni bagnati con acetone e lavorare molto delicatamente per evitare di rompere i campioni. Non è insolito che la pasta di lievito cada dai campioni. A questo punto, la pasta di lievito è solitamente di un marrone molto scuro mentre il tessuto fogliare è ancora verde.

Spesso i campioni di tessuto cadono dal portacampioni durante la raccolta dei campioni da parte della FS utilizzando una pipetta di trasferimento in fiale criogeniche contenenti acetone. Successivamente, i campioni vengono preparati per la microscopia elettronica a trasmissione secondo protocolli standard. In questo grafico è mostrata una curva tipica per le variazioni di temperatura durante il QFS.

La temperatura aumenta rapidamente da meno 196 gradi Celsius, la temperatura dell'azoto liquido a circa -80 gradi Celsius. Il picco all'inizio della corsa è dovuto all'elettronica della sonda e non riflette la misurazione della temperatura reale dopo che i campioni HPF e QFS sono stati preparati per la visualizzazione mediante microscopia elettronica a trasmissione. I risultati tipici sono mostrati in queste immagini da campioni di foglie di opsis di coniglio.

Le membrane plasmatiche lisce e premute contro la parete cellulare indicano una buona fissazione. Un dema plasmatico ramificato è visibile ad alto ingrandimento. Anche altri organelli sono chiaramente visibili.

Essi includono i cloroplasti e i mitocondri tilacoidi, i microtubuli GOGI e i plasmi desa, i grandi VAE centrali rimangono intatti. Una cattiva manipolazione durante H-P-F-Q-F-S provoca artefatti, tra cui danni indotti da cristalli di ghiaccio e lisi. Il precipitato di piombo può formarsi anche durante la colorazione delle sezioni Una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro ore e mezza se eseguita correttamente. Non dimenticare che lavorare con azoto liquido e tetrossido di osmio può essere estremamente pericoloso e durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni, tra cui lavorare nella cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camici da laboratorio e occhiali.