Due Algoritmi per high-throughput e multi-parametrica Quantificazione degli Drosophila Giunzione neuromuscolare Morfologia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di quantificare automaticamente le caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare di Drosophila utilizzando macro software morfometriche. Questo metodo può aiutare a identificare i regolatori dello sviluppo delle sinapsi, una questione chiave in neurobiologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è la quantificazione automatica di più caratteristiche NMJ.

Ciò consente un'analisi obiettiva della morfologia NMJ in high throughput. Abbiamo deciso di sviluppare questa metodologia per essere in grado di studiare la morfologia NMJ in una grande quantità di modelli di malattia. Abbiamo pensato a come prevenire le loro differenze personali e come accelerare significativamente il processo di quantificazione.

La dimostrazione visiva di questo metodo è molto utile. Le impostazioni macro appropriate sono fondamentali e alcuni passaggi potrebbero essere difficili per i nuovi utenti, soprattutto se non hanno familiarità con il software VT. Per questo protocollo, generare stack di immagini di NMJ e salvarle come singoli file TIFF, dove il canale uno mostra la colorazione DLG1 o un marcatore simile e il canale due mostra la colorazione BRP.

Per iniziare, crea proiezioni C e hyper stack dei file immagine NMJ. Apri le opzioni del plug-in e seleziona Drosophila NMJ Morphometrics. A questo punto, identificare la stringa di file univoca che il microscopio ha assegnato alla serie di immagini durante la memorizzazione come TIFF.

Questo sarà alla fine del nome dell'immagine. Copia e incolla la stringa data al piano più basso e al numero di canale nella finestra di impostazione della stringa del file univoco. Quindi, seleziona la sottomacro converti in stack e scegli la directory o la cartella in cui si trovano le immagini.

Per ogni file immagine, vengono creati due nuovi file con i nomi predefiniti stack e flat stack, seguiti dal nome dell'immagine originale. I file originali possono quindi essere eliminati per risparmiare spazio di archiviazione. Successivamente, dall'interfaccia Drosophila NMJ Morphometrics selezionare la sottomacro di definizione ROI e scegliere la directory del file immagine.

All'apertura della prima proiezione, selezionare lo strumento di selezione a mano libera. Quindi utilizzare il mouse per definire una regione contenente un terminale NMJ completo di interesse. Una volta selezionato, fare clic su OK nella finestra di definizione del terminale.

Continuare a eseguire questa operazione fino a quando i terminali NMJ non sono definiti in tutte le proiezioni. La macro fa avanzare automaticamente il processo. Per ogni file immagine viene creato un nuovo file con i nomi predefiniti ROI seguiti dal nome dell'immagine originale.

Per quantificare le caratteristiche NMJ, vai prima all'interfaccia morfometrica di Drosophila NMJ e imposta la scala. Ad esempio, se un pixel nell'immagine corrisponde a 0,72 micron, impostare i pixel di scala su uno e la distanza di scala su 0,072. Quindi seleziona la sottomacro analizza e se ci sono due immagini di canale, attiva anche il peso.

Premere OK e, quando richiesto, selezionare la directory del file immagine. Il tempo di elaborazione può essere di diversi minuti per sinapsi. Dopo l'analisi, i nuovi file di immagine per ogni sinapsi analizzata vengono memorizzati nella cartella parentale e le misurazioni quantitative sono i risultati.

Txt. Ispeziona tutte le immagini ed escludi le immagini con errori di segmentazione. Ad esempio, parti del terminale sinaptico potrebbero non essere incluse nel contorno giallo.

Parti dello sfondo potrebbero essere incluse nel terminale sinaptico. Una linea scheletrica blu può estendersi oltre il terminale sinaptico. Potrebbero essere presenti troppe zone attive o alcune zone attive potrebbero non essere rilevate.

Se più del 5% delle immagini presenta errori di segmentazione, esplora diversi algoritmi di analisi per migliorare l'elaborazione delle immagini. Le prossime sezioni video descrivono come definire molte di queste impostazioni di analisi macro. Per regolare il valore del raggio della sfera di rotolamento per la macro, selezionare tre proiezioni NMJ Z che siano rappresentative del set di dati dell'immagine.

Elimina il nome dell'immagine res risultante e il nome dell'immagine dello stack di due zone attive, precedentemente creato dall'analisi della sub macro. Apri i file del nome dell'immagine impilata per ogni immagine selezionata e quindi dalla barra degli strumenti seleziona i canali divisi per creare un'immagine del canale uno e un'immagine del canale due e salva questi file. Aprire l'immagine appartenente al canale uno, che in questo caso corrisponde alla marcatura immunologica DLG one.

Ora, esegui il filtro sottrai sfondo, che si trova nella scheda del processo. Imposta il raggio della palla rotante su un valore che aumenti il contrasto tra la sinapsi e lo sfondo. Crea una proiezione Z con un tipo di proiezione come intensità massima e salva l'immagine.

Quindi esegui l'algoritmo di sottrazione dello sfondo con il nuovo raggio della sfera rotante su tutte le proiezioni Z e salva i risultati. Per determinare le migliori soglie automatiche per la macro, aprire le proiezioni C salvate ed eseguire la soglia automatica con l'opzione prova tutto. Dalle immagini risultanti, trovare l'algoritmo più adatto per le immagini e procedere utilizzando l'impostazione della soglia quando si esegue la macro per ulteriori immagini.

La definizione delle diverse soglie automatiche è fondamentale per una corretta segmentazione dell'immagine da parte della macro. Per questo motivo, per quantificare correttamente otto dei parametri di segnaletica, è importante conoscere le 16 opzioni di soglia automatica offerte dal software. Premere il pulsante più per ingrandire l'immagine dei risultati della soglia automatica.

I nomi degli algoritmi si trovano sotto ogni immagine dei risultati. In questo esempio, il miglior algoritmo di soglia automatica per l'impostazione della soglia di contorno NMJ è Huang. Per la soglia dello scheletro, l'impostazione migliore è Li e l'impostazione migliore per la soglia della zona attiva è Huang.

Per definire il valore massimo di tolleranza al rumore per la macro, tornare alle immagini NMJ rappresentative originali. Aprire il canale BRP. Vai alla scheda dei plugin nel menu a comparsa e seleziona il 3D massimo.

Dopo un po' di tempo, apparirà una nuova immagine, quindi chiuderà l'immagine originale. Quindi, utilizzare il comando 3D minimo. Quindi chiudere il massimo di C2 stack synapse one image e selezionare l'immagine appena creata minimo di massimo C2 stack synapse one.

Ora usa il comando find maxima. Nella nuova finestra selezionare la selezione del punto di anteprima e impostare la tolleranza al rumore su 50. I punti massimi sono poi indicati con piccole croci, che dovrebbero coprire solo le zone attive delle sinapsi.

Se vengono praticate troppe croci, aumentare il valore di tolleranza al rumore. Se alcune delle zone attive non sono annotate, diminuire il valore di tolleranza al rumore. Utilizzare il valore di soglia derivato per il campo di tolleranza al rumore di ricerca dei massimi della macro.

Scegliendo il valore massimo di tolleranza al rumore, è importante quantificare correttamente il numero di zone attive. A volte è necessario provare valori diversi per definire quello corretto. Ora regola tutti i valori derivati negli algoritmi di soglia nell'interfaccia macro ed esegui l'analisi sub macro sulle immagini rappresentative originariamente utilizzate per definire le impostazioni macro.

Verrà creato un nuovo file con le zone attive indicate da punti bianchi. Apri questo file trascinandolo nella barra degli strumenti e selezionando il progetto Z con un tipo di proiezione come alcune sezioni. Pertanto, viene creato un file di proiezione.

Il passo successivo consiste nel regolare la soglia. Nella nuova finestra di soglia, far scorrere la barra superiore per scegliere un valore di soglia in cui vengono letti tutti i fuochi desiderati. Questi sono i punti positivi di BRP.

Utilizzare questo valore come soglia inferiore del punto BRP. A questo punto, eseguire nuovamente l'analisi sulle immagini NMJ rappresentative originali utilizzando i valori e gli algoritmi definiti in precedenza, quindi il nuovo valore di soglia inferiore del punto BRP. Le immagini risultanti devono soddisfare i criteri per l'analisi critica.

Ora usa le impostazioni di definizione per eseguire la macro su tutte le immagini NMJ ottenute nelle stesse condizioni. La macro morfometrica NMJ di Drosophila è stata utilizzata per convalidare diversi difetti sinaptici noti in tre genotipi mutanti. I due mutanti di Ankyrin sono noti per avere bottoni fusi e NMJ più piccoli.

Utilizzando la macro, sono stati misurati l'area e il perimetro di panuronil e quirin, due NMJ RNAI knock down e risultati significativamente più piccoli rispetto ai controlli. La GTPasi Rab3 è necessaria per una corretta distribuzione di bruckpila. Quando viene interrotta, ci sono meno zone attive.

Utilizzando il macro panuronil Rab 3 mosche abbattenti hanno avuto una media di 138 zone attive per terminale NMJ rispetto alle 290 rilevate nei controlli. L'high wire è un importante regolatore della crescita delle NMJ e, quando mutate, le NMJ hanno una ramificazione estesa ai loro terminali. Utilizzando il macro panuronil high wire RNAI, le linee di knockdown hanno mostrato aumenti significativi in diversi parametri derivati dallo scheletro ai loro NMJ, tra cui la lunghezza totale, la lunghezza del ramo più lungo, il numero di rami e il numero di punti di ramificazione.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare e regolare le impostazioni della macro morfometrica NMJ di Drosophila. Una volta padroneggiata, l'analisi di 50 sinapsi può essere eseguita entro un'ora. Ciò consente di risparmiare circa 15 minuti di tempo di quantificazione per sinapsi.

È importante acquisire immagini di buona qualità dell'NMJ. Migliori sono le immagini, migliori saranno le prestazioni della macro. Questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo della neurobiologia a quantificare in modo efficiente i parametri morfologici della Drosophila NMJ.