Name: Due Algoritmi per high-throughput e multi-parametrica Quantificazione degli Drosophila Giunzione neuromuscolare Morfologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Scopri due algoritmi per la quantificazione automatica della morfologia della giunzione neuromuscolare di Drosophila. Questo metodo computazionale consente analisi ad alto rendimento e riproducibili per studiare lo sviluppo sinaptico.

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Riconosciamo il magazzino centrale di Vienna Drosophila Resource Center e Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) per la fornitura di ceppi di Drosophila. Ringraziamo Jack Fransen dalla Microscopical Imaging Center per il supporto di esperti nel campo dell&#39;imaging. Questo studio è stato sostenuto da VIDI e le sovvenzioni TOP (917-96-346, 912-12-109) dalla Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), da due borse di studio di dottorato di ricerca DCN / Radboud University Medical Center, dal ritardo mentale rete tedesca finanziato dal programma NGFN + del ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della ricerca (BMBF) e dal Gencodys dell&#39;Unione europea del 7 ° PQ su larga scala integrati di rete (Health-241995) per AS. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

&quot;Drosophila NMJ Morfometria&quot; e &quot;Drosophila NMJ bouton Morfometria&quot; sono strumenti potenti per i ricercatori interessati a valutare sinapsi morfologia. la valutazione manuale dei parametri NMJ è laboriosa; si stima che le macro risparmierebbero un ricercatore esperto fino a 15 min / NMJ speso per la segmentazione manuale dell&#39;immagine. Con uno o due decine di sinapsi valutati per ogni condizione o genotipo, questo riassume rapidamente fino a una considerevole quantità di tempo risparmiato, anche in studi su piccola scala. Quando si esegue grandi schermi, il guadagno di utilizzare alta analisi del throughput, rispetto alla valutazione manuale e la quantificazione, può essere immensa. Oltre a una maggiore produttività, le macro prontamente fornire un&#39;analisi obiettiva; escludono pregiudizi personali che altrimenti richiederebbero sperimentazioni in cieco nonché le differenze tra persone che si verificano quando più i ricercatori sono coinvolti nell&#39;analisi. Infine, le macro offrono un un sensibile e precisoANALISI DELLA caratteristiche NMJ, permettendo l&#39;identificazione di regolatori sinaptici che causano piuttosto sottile di drammatici difetti NMJ e rimaste sinora apprezzati dall&#39;occhio del ricercatore. Informazioni dettagliate sulle procedure di convalida e gli algoritmi utilizzati nelle macro si trovano nella pubblicazione Nijhof et al. 17. La funzionalità delle macro è stato validato per misurare in modo appropriato le caratteristiche morfologiche della Drosophila melanogaster NMJs al muscolo 4. Successivamente, è stato dimostrato che le macro sono stati anche adatto per analizzare le sinapsi in altri muscoli in questo organismo. È probabile che le macro possono essere utilizzati anche per misurare parametri morfologici di giunzioni neuromuscolari con struttura simile in altre specie, tra le altre specie Drosophila e altri insetti. Anche NMJs molto lontane nell&#39;evoluzione, per esempio, NMJs di topi, mostrano una conformazione strutturale abbastanza simile 29. Le macro non sono stati testati sui preparativi NMJ da altre specie, ma i potenziali utenti sono incoraggiati a testare le macro per tali scopi. E &#39;molto importante che l&#39;utente esplora le diverse auto-soglie e gli algoritmi per definire / scegliere le impostazioni macro più adatte per le immagini. Con queste impostazioni, una precisione di circa il 95% si ottiene quando la valutazione macro è stato confrontato con la valutazione manuale. Regolazione delle impostazioni macro correttamente segmento 100% delle immagini può essere una procedura molto laboriosa o addirittura impossibile. Pertanto, l&#39;esclusione di immagini non correttamente segmentati è raccomandato se il loro numero è inferiore al 5%. Evidentemente, se la qualità delle immagini è bassa, le macro si generano elevati rapporti di segmentazione di immagini insoddisfacenti. immagini di bassa qualità saranno allo stesso modo influenzare la valutazione manuale e possono quindi non essere legato alla performance delle macro. Tuttavia le macro sono piuttosto robusti come sono stati progettati per un&#39;immagines generata su un alto contenuto microscopio (un microscopio a fluorescenza automatico che permette l&#39;imaging di un gran numero di campioni) 17. Un punto critico è che l&#39;utente controlla visivamente tutte le immagini di risultati generati dalle macro. Questo permetterà di individuare ed escludere le immagini con la segmentazione insoddisfacente. Nella sezione 6 di questo protocollo, l&#39;utente viene guidato come regolare le impostazioni corrette segmentazione di immagini quando si esegue il sub-macro &quot;Analyse&quot;. Per conoscere rapidamente con i requisiti delle macro e come regolare le impostazioni macro una cartella chiamata &quot;Examples_adjusting impostazioni macro&quot; è incluso nel repository https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a macro. Tredici sottocartelle, ciascuna con immagini esempi ottenuti a piattaforme diverse microscopio (microscopi alto contenuto / confocale / fluorescenza) e diversi immunostainings, sono forniti. Un PDF intitolato “Esempi guida” è incluso nella stessacartella in cui vengono fornite le impostazioni necessarie per ogni esempio, insieme ad un documento di testo che fornisce i risultati attesi e risultati immagini. Le macro sono stati progettati per processare le immagini salvate come TIFF separati file, tuttavia alcuni utenti potrebbero aver salvato le loro immagini in un formato diverso. Il seguente sito web https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a 21 contiene una cartella denominata &quot;Drosophila NMJ&quot; dove tre file di esempio (esempio 1 - 3) e la &quot;Guida Esempi&quot; documento con le istruzioni dettagliate su come importare le immagini nella macro se non memorizzati come file separati .tiff si possono trovare anche nella stessa cartella. Insieme, &quot;Drosophila NMJ Morfometria&quot; e &quot;Drosophila NMJ Bouton morfometria&quot; macro quantificare dieci diverse caratteristiche NMJ: area NMJ, perimetro NMJ, numero di boutons, area bouton NMJ, lunghezza NMJ, giunzioni neuromuscolari più lunga di lunghezza ramo, numero di islands, numero di rami, il numero di punti di ramificazione e il numero di zone attive. Ciò fornisce un grande vantaggio rispetto gli strumenti finora disponibili che possono valutare solo uno o alcune caratteristiche sinaptiche 30, 31. Analisi quantitativa multiparametrica porta grande potenziale per nuove scoperte, ad esempio, per identificare nuovi regolatori che controllano uno fino a numerosi aspetti della biologia sinapsi. Esso fornisce anche la risoluzione necessaria per identificare i geni che coregulate esattamente uguali o sovrapposti caratteristiche NMJ e quindi suscettibili di operare in percorsi molecolari comuni. Infine, si apre la possibilità di studiare come diversi parametri sinaptiche correlazione tra loro in condizioni inalterate 17 e quali geni garantiscono tali correlazioni morfometrici coordinati. Nel loro insieme, questo protocollo illustra come utilizzare i due macro &quot;Drosophila NMJ Morfometria&quot; e&quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometria&quot;, che svolgono quantificazione oggettiva e sensibile di dieci caratteristiche morfologiche NMJ in modo ad alta produttività.

Disturbi cognitivi come la disabilità intellettiva, disturbo dello spettro autistico e la schizofrenia sono spesso caratterizzati da anormale funzione sinaptica 1, 2, 3. Sinapsi morfologia e funzione sono strettamente intrecciati; difetti morfologici possono causare malfunzionamenti sinaptica e, inversamente, trasmissione sinaptica aberrante influenzeranno maturazione sinaptica e morfologia 4, 5, 6. Un certo numero di organismi modello sono state impiegate al fine di comprendere meglio la biologia delle sinapsi e far luce su come i cambiamenti sinaptici influenzano la funzione del cervello in salute e malattia 7, 8, 9. Drosophila NMJ è un ampiamente studiato e ben stabilito modello in vivo per glutamatergici synapse biologia 10, 11. Negli ultimi decenni, questo modello è stato utilizzato per studi fisiologici e gene-concentrata, così come per gli schermi genetici su larga scala, con lo scopo di rilevare le differenze morfologiche tra NMJs. In particolare, gli schermi genetici in avanti hanno identificato molti regolatori cruciali e meccanismi alla base dello sviluppo sinapsi e funzionamento 12, 13, 14, 15, 16. Tuttavia, la maggior parte di questi schermi invocati valutazione visiva del NMJ morfologia del terminale e sulla determinazione qualitativa delle anomalie sinaptiche o tracciatura semi-quantitativa di alcune caratteristiche morfologiche. Di conseguenza, piuttosto sottili anomalie morfologiche sinaptiche che non sono evidenti per l&#39;occhio umano potrebbero passare facilmente inosservate. Per essere in grado di rilevare completo differenze quantitative, leNMJ deve essere accuratamente valutata quantificando sistematica dei parametri morfologici di interesse. Misurare caratteristiche NMJ manualmente è laboriosa, soprattutto quando ci sono diverse caratteristiche NMJ di interesse e / o durante l&#39;esecuzione di screening genetici su larga scala. Per supportare multiparametrica, high-throughput analisi morfologica e per conseguire quantificazione oggettiva, due macro &quot;Drosophila NMJ morfometria&quot; e &quot;Drosophila NMJ Bouton morfometria&quot; sono stati sviluppati 17. Entrambe le macro vengono eseguite in open source software di analisi di immagine Fiji 18, e possono quantificare entrambe le immagini confocale e nonconfocal. Misure &quot;Drosophila NMJ morfometria&quot; terminali NMJ immunostained con il disco postsinaptica marcatore larga 1 (Dlg-1) o il presinaptica perossidasi di rafano (HRP), co-etichettati con il marcatore Bruchpilot zona attiva (BPA). Si quantifica nove Parame morfologicaters (descritto di seguito): area NMJ, perimetrali NMJ, numero di boutons, lunghezza giunzioni neuromuscolari, giunzioni neuromuscolari più lunga lunghezza ramo, numero di isole, numero di rami, il numero di punti di ramificazione e il numero di zone attive nel terminale sinaptico (Figura 1) . Anche se è presente un algoritmo per determinare il numero di boutons in questa macro, esso non soddisfa i criteri per la precisione 17. Per valutare correttamente il numero di boutons, è necessario utilizzare la macro &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometria&quot;, che è specificamente progettato per quantificare boutons su preparazioni NMJ immunostained da anti-sinaptotagmina (Syt) o della proteina stringa anti-cisteina (CSP), e co-immunolabeled con Brp. La macro &quot;Drosophila NMJ Bouton Morfometria&quot; quantifica i seguenti parametri: numero di boutons, NMJ zona bouton, lunghezza giunzioni neuromuscolari, giunzioni neuromuscolari maggiore lunghezza ramo, il numero di isole, il numero di rami, il numero di punti di ramificazione e il numero di zo attivonna (Figura 2). Le macro sono costituite da 3 sub-macro: (I) &quot;Convertire a impilare&quot; identifica tutti i file di immagine disponibili e crea Z-hyperstacks e proiezioni di massima intensità di entrambi i canali. Come uscita, questa macro genera due nuovi file ogni sinapsi chiamato &quot;stack_image_name&quot; e &quot;flatstack_image_name&quot;. II) &quot;Definire ROI&quot; si aprirà tutte le immagini di proiezione massime &quot;flatstack_image_name&quot; consecutivamente e presentarli con la richiesta di definire manualmente la regione di interesse (ROI) in cui è presente il terminale sinaptico specifico di interesse. Questo è stato realizzato per consentire esclusione delle sinapsi collegano ai muscoli adiacenti e / o altri tipi di terminali sinaptici (come 1s) che possono essere presenti nelle immagini 11. (III) &quot;Analyse&quot; applicato completamente automatizzato analisi per tutte le regioni delle immagini entro i confini della ROI. ComeA seguito di tale fase, l&#39;utente otterrà due nuovi file: &quot;results.txt&quot; dove verrà annotata tutta la misura numerica e un &quot;res_image_name.tif&quot; dove verranno illustrati i segmentazione di immagini sottostanti prodotte dalla macro. Durante l&#39;analisi dell&#39;immagine tre strutture sono derivati ​​da ogni terminale sinaptico: il contorno NMJ, lo scheletro giunzione neuromuscolare, e il numero di zone attive Brp-positivi. Lo schema NMJ viene utilizzato per determinare l&#39;area NMJ e il suo perimetro e una successiva separazione svolta fornisce il numero di boutons. Dallo scheletro, cinque funzioni NMJ si deducono: lunghezza totale NMJ, la somma della lunghezza del percorso continuo lungo collegare i due punti finali (maggiore lunghezza ramo), il numero di scomparti estranee al NMJ (denominate &quot;isole&quot; ), il numero di rami, e il numero di punti di ramificazione (un punto di diramazione collega tre o più rami). Il numero di zone attive è determinato nel Brp canale contandomacchie BRP-positivi. Lo schema annotato NMJ (linea gialla), lo scheletro NMJ (linea blu), e il numero di zone attive Brp-positivi (indicati da foci bianco) vengono visualizzati in un quadro risultati e le misurazioni dei parametri sono trattati per un (. txt) file di output (Figura 3). Drosophila NMJ Morfometria&quot; e &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometria&#39; sono stati descritti e ampiamente convalidati da Nijhof et al. 17. Questo manoscritto si concentra sulla metodologia per analizzare NMJ morfologia utilizzando le macro &#39;Drosophila NMJ morfometria&#39; e &#39;Drosophila NMJ Bouton morfometria&#39;. Tuttavia, prima di analisi macro-assistita, dissezioni NMJ e immunostainings devono essere eseguiti. Questi sono passi fondamentali, e la combinazione di marcatori utilizzati per immunoistochimica deve essere adatto per analisi macro. Questi passaggi sono brevemente menzionati in séction 1 di questo protocollo e dirigere l&#39;utente a riferimenti che descrivono in dettaglio i protocolli per eseguire queste procedure.

<table><tbody><tr><td><forte>Immunocolorazione</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Diluizione</forte></td></tr><tr><td>Mouse anti-dischi grandi 1</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>AFFN-DLG1-4D6</td><td>1/25 (conjungated utilizzando il kit di etichettatura Zenon Alexa Fluor 528)</td></tr><tr><td>Perossidasi anti-rafano di coniglio</td><td>Jackson IR</td><td>323-005-021</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Coniglio anti-sinaptotagmina</td><td>Regalo da Hugo Bellen</td><td></td><td>Jan-00</td></tr><tr><td>Proteina stringa anti-cisteina di topo</td><td>Studi sullo sviluppo Banca di ibridomi</td><td>DCSP-1 (ab49)</td> <td>1/10 (conjungated utilizzando il kit di etichettatura Zenon Alexa Fluor 528)</td></tr><tr><td>Topo anti-Bruchpilot</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Jan-50</td></tr><tr><td>Capra anti-topo Alexa Fluor 488</td><td>Life technologies</td><td>A11029</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Alexa Fluor 568</td><td>Life technologies</td><td>A11011</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Z25006</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Materiale</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale o microscopio a fluorescenza</td><td>Leica SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio imager</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Mac o Pc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

due algoritmi per high-throughput e multi-parametrica quantificazione degli<em&gt; drosophila</em&gt; giunzione neuromuscolare morfologia

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

morfologia sinaptica è strettamente correlata all&#39;efficacia sinaptica, e in molti casi difetti morfologici sinapsi in definitiva portare a malfunzionamenti sinaptica. Larvale Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ), un modello ben consolidato per sinapsi glutammatergica, è stato ampiamente studiato per decenni. Identificazione di mutazioni causano difetti morfologici NMJ rivelato un repertorio di geni che regolano lo sviluppo delle sinapsi e funzione. Molti di questi sono stati identificati in studi su larga scala che si è concentrato su approcci qualitativi per rilevare anomalie morfologiche della Drosophila NMJ. Un inconveniente di analisi qualitative è che molti giocatori sottili che contribuiscono alla morfologia NMJ probabile rimangono inosservati. Considerando analisi quantitative sono necessarie per rilevare le differenze morfologiche sottili, tali analisi non sono ancora comunemente eseguite perché sono laboriose. Questo protocollo descrive in dettaglio due algoritmi di analisi dell&#39;immagine &quot;Drosophila </em&gt; NMJ Morfometria&quot; e &#39;Drosophila NMJ Bouton Morfometria&#39;, disponibile come macro compatibili Fiji, per l&#39;analisi quantitativa, precisa e oggettiva morfometrica della Drosophila NMJ. Questa metodologia è sviluppato per analizzare terminali NMJ immunolabeled con i marcatori comunemente utilizzati Dlg-1 e . BRP Inoltre, la sua più ampia applicazione ad altri marcatori, come Hrp, Csp e Syt è presentato in questo protocollo Le macro sono in grado di valutare nove caratteristiche NMJ morfologiche:. Area NMJ, perimetro NMJ, numero di boutons, lunghezza NMJ, NMJ più lungo ramo lunghezza, numero di isole, il numero di rami, il numero di punti di ramificazione e il numero di zone attive nel terminale NMJ.

Sono stati creati due algoritmi di analisi dell&#39;immagine, &quot;Drosophila NMJ morfometria&quot; e &quot;Drosophila NMJ Bouton morfometria&quot;, quantificare automaticamente nove caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare Drosophila (NMJ).

Due Algoritmi per high-throughput e multi-parametrica Quantificazione degli<em&gt; Drosophila</em&gt; Giunzione neuromuscolare Morfologia

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di quantificare automaticamente le caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare di Drosophila utilizzando macro software morfometriche. Questo metodo può aiutare a identificare i regolatori dello sviluppo delle sinapsi, una questione chiave in neurobiologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è la quantificazione automatica di più caratteristiche NMJ.Ciò consente un'analisi obiettiva della morfologia NMJ in high throughput. Abbiamo deciso di sviluppare questa metodologia per essere in grado di studiare la morfologia NMJ in una grande quantità di modelli di malattia. Abbiamo pensato a come prevenire le loro differenze personali e come accelerare significativamente il processo di quantificazione.La dimostrazione visiva di questo metodo è molto utile. Le impostazioni macro appropriate sono fondamentali e alcuni passaggi potrebbero essere difficili per i nuovi utenti, soprattutto se non hanno familiarità con il software VT. Per questo protocollo, generare stack di immagini di NMJ e salvarle come singoli file TIFF, dove il canale uno mostra la colorazione DLG1 o un marcatore simile e il canale due mostra la colorazione BRP.Per iniziare, crea proiezioni C e hyper stack dei file immagine NMJ. Apri le opzioni del plug-in e seleziona Drosophila NMJ Morphometrics. A questo punto, identificare la stringa di file univoca che il microscopio ha assegnato alla serie di immagini durante la memorizzazione come TIFF.Questo sarà alla fine del nome dell'immagine. Copia e incolla la stringa data al piano più basso e al numero di canale nella finestra di impostazione della stringa del file univoco. Quindi, seleziona la sottomacro converti in stack e scegli la directory o la cartella in cui si trovano le immagini.Per ogni file immagine, vengono creati due nuovi file con i nomi predefiniti stack e flat stack, seguiti dal nome dell'immagine originale. I file originali possono quindi essere eliminati per risparmiare spazio di archiviazione. Successivamente, dall'interfaccia Drosophila NMJ Morphometrics selezionare la sottomacro di definizione ROI e scegliere la directory del file immagine.All'apertura della prima proiezione, selezionare lo strumento di selezione a mano libera. Quindi utilizzare il mouse per definire una regione contenente un terminale NMJ completo di interesse. Una volta selezionato, fare clic su OK nella finestra di definizione del terminale.Continuare a eseguire questa operazione fino a quando i terminali NMJ non sono definiti in tutte le proiezioni. La macro fa avanzare automaticamente il processo. Per ogni file immagine viene creato un nuovo file con i nomi predefiniti ROI seguiti dal nome dell'immagine originale.Per quantificare le caratteristiche NMJ, vai prima all'interfaccia morfometrica di Drosophila NMJ e imposta la scala. Ad esempio, se un pixel nell'immagine corrisponde a 0,72 micron, impostare i pixel di scala su uno e la distanza di scala su 0,072. Quindi seleziona la sottomacro analizza e se ci sono due immagini di canale, attiva anche il peso.Premere OK e, quando richiesto, selezionare la directory del file immagine. Il tempo di elaborazione può essere di diversi minuti per sinapsi. Dopo l'analisi, i nuovi file di immagine per ogni sinapsi analizzata vengono memorizzati nella cartella parentale e le misurazioni quantitative sono i risultati.Txt. Ispeziona tutte le immagini ed escludi le immagini con errori di segmentazione. Ad esempio, parti del terminale sinaptico potrebbero non essere incluse nel contorno giallo.Parti dello sfondo potrebbero essere incluse nel terminale sinaptico. Una linea scheletrica blu può estendersi oltre il terminale sinaptico. Potrebbero essere presenti troppe zone attive o alcune zone attive potrebbero non essere rilevate.Se più del 5% delle immagini presenta errori di segmentazione, esplora diversi algoritmi di analisi per migliorare l'elaborazione delle immagini. Le prossime sezioni video descrivono come definire molte di queste impostazioni di analisi macro. Per regolare il valore del raggio della sfera di rotolamento per la macro, selezionare tre proiezioni NMJ Z che siano rappresentative del set di dati dell'immagine.Elimina il nome dell'immagine res risultante e il nome dell'immagine dello stack di due zone attive, precedentemente creato dall'analisi della sub macro. Apri i file del nome dell'immagine impilata per ogni immagine selezionata e quindi dalla barra degli strumenti seleziona i canali divisi per creare un'immagine del canale uno e un'immagine del canale due e salva questi file. Aprire l'immagine appartenente al canale uno, che in questo caso corrisponde alla marcatura immunologica DLG one.Ora, esegui il filtro sottrai sfondo, che si trova nella scheda del processo. Imposta il raggio della palla rotante su un valore che aumenti il contrasto tra la sinapsi e lo sfondo. Crea una proiezione Z con un tipo di proiezione come intensità massima e salva l'immagine.Quindi esegui l'algoritmo di sottrazione dello sfondo con il nuovo raggio della sfera rotante su tutte le proiezioni Z e salva i risultati. Per determinare le migliori soglie automatiche per la macro, aprire le proiezioni C salvate ed eseguire la soglia automatica con l'opzione prova tutto. Dalle immagini risultanti, trovare l'algoritmo più adatto per le immagini e procedere utilizzando l'impostazione della soglia quando si esegue la macro per ulteriori immagini.La definizione delle diverse soglie automatiche è fondamentale per una corretta segmentazione dell'immagine da parte della macro. Per questo motivo, per quantificare correttamente otto dei parametri di segnaletica, è importante conoscere le 16 opzioni di soglia automatica offerte dal software. Premere il pulsante più per ingrandire l'immagine dei risultati della soglia automatica.I nomi degli algoritmi si trovano sotto ogni immagine dei risultati. In questo esempio, il miglior algoritmo di soglia automatica per l'impostazione della soglia di contorno NMJ è Huang. Per la soglia dello scheletro, l'impostazione migliore è Li e l'impostazione migliore per la soglia della zona attiva è Huang.Per definire il valore massimo di tolleranza al rumore per la macro, tornare alle immagini NMJ rappresentative originali. Aprire il canale BRP. Vai alla scheda dei plugin nel menu a comparsa e seleziona il 3D massimo.Dopo un po' di tempo, apparirà una nuova immagine, quindi chiuderà l'immagine originale. Quindi, utilizzare il comando 3D minimo. Quindi chiudere il massimo di C2 stack synapse one image e selezionare l'immagine appena creata minimo di massimo C2 stack synapse one.Ora usa il comando find maxima. Nella nuova finestra selezionare la selezione del punto di anteprima e impostare la tolleranza al rumore su 50. I punti massimi sono poi indicati con piccole croci, che dovrebbero coprire solo le zone attive delle sinapsi.Se vengono praticate troppe croci, aumentare il valore di tolleranza al rumore. Se alcune delle zone attive non sono annotate, diminuire il valore di tolleranza al rumore. Utilizzare il valore di soglia derivato per il campo di tolleranza al rumore di ricerca dei massimi della macro.Scegliendo il valore massimo di tolleranza al rumore, è importante quantificare correttamente il numero di zone attive. A volte è necessario provare valori diversi per definire quello corretto. Ora regola tutti i valori derivati negli algoritmi di soglia nell'interfaccia macro ed esegui l'analisi sub macro sulle immagini rappresentative originariamente utilizzate per definire le impostazioni macro.Verrà creato un nuovo file con le zone attive indicate da punti bianchi. Apri questo file trascinandolo nella barra degli strumenti e selezionando il progetto Z con un tipo di proiezione come alcune sezioni. Pertanto, viene creato un file di proiezione.Il passo successivo consiste nel regolare la soglia. Nella nuova finestra di soglia, far scorrere la barra superiore per scegliere un valore di soglia in cui vengono letti tutti i fuochi desiderati. Questi sono i punti positivi di BRP.Utilizzare questo valore come soglia inferiore del punto BRP. A questo punto, eseguire nuovamente l'analisi sulle immagini NMJ rappresentative originali utilizzando i valori e gli algoritmi definiti in precedenza, quindi il nuovo valore di soglia inferiore del punto BRP. Le immagini risultanti devono soddisfare i criteri per l'analisi critica.Ora usa le impostazioni di definizione per eseguire la macro su tutte le immagini NMJ ottenute nelle stesse condizioni. La macro morfometrica NMJ di Drosophila è stata utilizzata per convalidare diversi difetti sinaptici noti in tre genotipi mutanti. I due mutanti di Ankyrin sono noti per avere bottoni fusi e NMJ più piccoli.Utilizzando la macro, sono stati misurati l'area e il perimetro di panuronil e quirin, due NMJ RNAI knock down e risultati significativamente più piccoli rispetto ai controlli. La GTPasi Rab3 è necessaria per una corretta distribuzione di bruckpila. Quando viene interrotta, ci sono meno zone attive.Utilizzando il macro panuronil Rab 3 mosche abbattenti hanno avuto una media di 138 zone attive per terminale NMJ rispetto alle 290 rilevate nei controlli. L'high wire è un importante regolatore della crescita delle NMJ e, quando mutate, le NMJ hanno una ramificazione estesa ai loro terminali. Utilizzando il macro panuronil high wire RNAI, le linee di knockdown hanno mostrato aumenti significativi in diversi parametri derivati dallo scheletro ai loro NMJ, tra cui la lunghezza totale, la lunghezza del ramo più lungo, il numero di rami e il numero di punti di ramificazione.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare e regolare le impostazioni della macro morfometrica NMJ di Drosophila. Una volta padroneggiata, l'analisi di 50 sinapsi può essere eseguita entro un'ora. Ciò consente di risparmiare circa 15 minuti di tempo di quantificazione per sinapsi.È importante acquisire immagini di buona qualità dell'NMJ. Migliori sono le immagini, migliori saranno le prestazioni della macro. Questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo della neurobiologia a quantificare in modo efficiente i parametri morfologici della Drosophila NMJ.

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