Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al Drosophila Larvale Giunzione neuromuscolare

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di mostrare come eseguire analisi quantitative dei tratti anatomici. E' dimostrata la quantificazione dei fenotipi che influenzano la morfologia, le dimensioni e la posizione dei nuclei con i muscoli striati delle larve di Drosophila. Comprendere il meccanismo molecolare che controlla la morfologia, le dimensioni e la distribuzione degli organelli intracellulari è una delle questioni più importanti della biologia moderna.

In passato, le variazioni morfologiche tra e all'interno dei gruppi sperimentali erano sottoposte solo ad analisi qualitativa. Qui ci proponiamo, in analisi quantitativa che combina la genetica della drosofila con l'analisi quantitativa morfometrica per identificare i geni che controllano la dimensione, la forma e la distribuzione dei nuclei all'interno dei muscoli. Ad aiutare con la dimostrazione della procedura sarà Leire Ledahawski, una studentessa laureata del mio laboratorio.

Dopo aver sezionato e colorato le giunzioni neuromuscolari larvali secondo il protocollo di testo, utilizzare una pinza per rimuovere i campioni dalla provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e adagiarli su un vetrino di elaborazione. Usando le forbici per microdissezione, taglia la testa e la coda dai filetti e mantieni le loro superfici interne sollevate. Ora, prepara un vetrino di montaggio avvolgendo tre strisce di nastro di cellulosa attorno a un vetrino pulito, a un centimetro di distanza.

Appoggiare il vetrino coprioggetto su questa fessura fornita in modo che non appiattisca i campioni. Quindi, depositare circa 20 microlitri del mezzo di montaggio tra le strisce di nastro di cellulosa e stendere il mezzo con una pinza pulita. Ora rimuovi il tessuto in eccesso dai preparati.

Trascinare le larve sezionate dal vetrino di lavorazione sul vetrino di montaggio e nel mezzo di montaggio, mantenendo la superficie interna sollevata. Quindi, applicare delicatamente un vetrino coprioggetti facendo attenzione a non intrappolare l'aria. Quindi sigillare il vetrino con smalto trasparente e lasciare asciugare il vetrino per almeno 10 minuti prima dell'imaging.

Per questa analisi, utilizzare immagini confocali che mostrano i muscoli della parete del corpo larvale colorati con anticorpi DeVAP, anticorpi della lamina e un marcatore nucleare. Quindi trascina e rilascia le immagini confocali dello stack Z nell'arena. Fare doppio clic sulle immagini per aprirle automaticamente nella vista Surpass, accessibile tramite un'icona della barra degli strumenti.

La vista Surpass ha tre pannelli principali dell'area di lavoro. Area di visualizzazione, Elenco oggetti e Area Proprietà oggetto. Quindi, fai clic sull'icona Vista 3D per creare un'immagine a tre canali renderizzata dal volume.

Quindi selezionare Aggiungi nuovi punti di misurazione dalla barra degli strumenti Oggetti e seguire la procedura guidata di creazione nell'area Proprietà oggetto. Seleziona prima la scheda Modifica e poi, da Canale specifico, seleziona il marcatore nucleare o il canale della lamina per evidenziare i nuclei. Quindi, imposta il puntatore sulla modalità di selezione premendo la scheda Esc, quindi regola le dimensioni della casella del cursore 3D con la rotellina del mouse per contenere un determinato nucleo nell'immagine.

Aggiungi un punto di misurazione tenendo premuto il tasto Maiusc e facendo clic con il pulsante sinistro del mouse sullo stesso nucleo. Quindi, aggiungi il secondo punto su un nucleo vicino dello stesso muscolo usando la stessa tecnica. Verrà automaticamente tracciata una linea tra i due punti e la distanza tra i due nuclei verrà visualizzata e registrata come variabile statistica.

Ripetere la procedura per tutti i nuclei che circondano un dato nucleo. Quindi, da tutti i punti di misurazione raccolti, che si trovano in Dati dettagliati sulla distanza, selezionare la distanza più breve. Nell'area Proprietà oggetto, selezionare l'opzione Esporta statistiche con visualizzazione scheda su file disponibile.

In questo modo i dati vengono salvati in un foglio di calcolo. Per questa analisi, utilizzare immagini confocali dei muscoli della parete corporea colorati con lamina e un marcatore nucleare per visualizzare i nuclei. Per valutare la forma dei mionuclei, misurare la loro sfericità, che confronta la superficie nucleare con quella di una sfera con lo stesso volume.

In alternativa, misurare l'ellitticità che distingue i prolati, gli oblati o gli ellissoidi e gli sferoidi. Aprire l'immagine come descritto in precedenza. Quindi, fare clic sull'icona Aggiungi nuove superfici della barra degli strumenti Oggetti.

Nella Creazione guidata che appare nell'area Proprietà dell'oggetto, selezionare la colorazione del marcatore nucleare come canale sorgente per visualizzare i nuclei. Impostare l'opzione Intensità assoluta come soglia. Assicurarsi che la maggior parte dei nuclei mostri un rendering uniforme e non sovraccaricato modificando il valore sulla curva di soglia.

Allo stesso tempo, evitare la presenza di fori o maschere incomplete di eventuali nuclei. Quindi, utilizzare lo strumento Filtro per rimuovere il rumore dal rendering della superficie. Nella scheda Modifica del livello di superficie appena creato, dividere le superfici dei nuclei che sono state renderizzate in modo errato.

Un'altra opzione consiste nell'unire le superfici dei nuclei che sono state renderizzate in modo errato. I valori di ellitticità e sfericità dei nuclei renderizzati in superficie sono disponibili nella scheda Statistiche. Esporta questi dati per l'analisi.

Per questo protocollo, utilizzare immagini confocali che riportano i muscoli della parete corporea colorati con un marcatore nucleare e con anticorpi specifici per lamina e DeVAP. Apri l'immagine di interesse dalla voce del Menu principale Modifica quindi Ritaglia 3D. Seguire la procedura guidata di creazione della superficie utilizzando il canale di laminazione come descritto nella sezione precedente.

Una volta creata la superficie, fare clic su Modifica nell'area Proprietà oggetti e selezionare Maschera tutto per isolare un segnale all'interno del nucleo. Quindi, selezionare il segnale DeVAP. Dal menu a discesa Seleziona canale, fare clic sull'opzione Imposta voxel fuori dalla superficie e azzerare tale valore.

In questo modo viene creato un nuovo canale mascherato disponibile nella finestra Regolazione schermo. Per visualizzare la presenza di un segnale all'interno del nucleo, creare un piano di contorno facendo clic sull'icona Aggiungi nuovo piano di ritaglio dalla barra degli strumenti Oggetti. Quindi, regolare in modo interattivo l'angolo del piano di ritaglio e la sua posizione per visualizzare la distribuzione del segnale all'interno del nucleo.

Le mutazioni missenso nella proteina B associata alla VAMP umana sono implicate nella patogenesi della SLA. Utilizzando il metodo descritto, i muscoli striati che esprimono il gene ortologo della mosca DeVAP che ospita la mutazione V2601 che causa la SLA sono stati confrontati con i controlli, esprimendo livelli comparabili di DeVAP wild type o livelli più elevati di DeVAP wild-type. L'analisi del vicino più prossimo è stata utilizzata per valutare la distribuzione dei nuclei lungo le fibre muscolari.

Rispetto ai muscoli di controllo che esprimono il transgene DeVAP mutato, o a quelli che sovraesprimono la proteina wild-type, la mutazione di interesse ha causato una drastica riduzione della distanza media più breve tra i nuclei. Successivamente, è stata esaminata la sfericità dei nuclei. È stato scoperto che i transgeni che riducono la spaziatura dei nuclei aumentano anche il volume dei nuclei.

Le ricostruzioni 3D e i rendering volumetrici dei nuclei hanno rivelato che i muscoli che esprimono la mutazione di interesse formano cluster localizzati nei nuclei. Questo metodo può essere esteso anche all'analisi quantitativa delle caratteristiche morfologiche associate ad altri organelli, come i mitocondri. I cambiamenti nell'architettura nucleare, nella posizione e nelle dimensioni sono stati associati all'invecchiamento e a una serie di malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson e la SLA.

La comprensione dei meccanismi molecolari alla base della disprassi può portare all'identificazione di nuovi bersagli farmacologici per interventi terapeutici efficaci.