drosofila Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

- In primo luogo, immunocolorare le larve di Drosophila con marcatori che evidenziano diversi aspetti delle NMJ o giunzioni neuromuscolari. Questa è la regione in cui la terminazione di un assone del motoneurone entra in contatto con un muscolo e la sua morfologia viene utilizzata come lettura della funzione sinaptica.

L'assone termina in diversi rami che formano rigonfiamenti chiamati bottoni. I neurotrasmettitori vengono rilasciati dai bottoni e causano la contrazione muscolare. Le aree di rilascio dei neurotrasmettitori sono chiamate zone attive. Qui un marcatore è specifico per una proteina sinaptica che delinea l'NMJ, e l'altro marcatore è per una proteina presente nelle zone attive.

Successivamente, acquisisci immagini NMJ utilizzando la microscopia e valuta quantitativamente la loro morfologia con un software di analisi delle immagini semiautomatico. Applica una serie preimpostata di comandi software alle immagini. I file di output contengono immagini NMJ analizzate e risultati morfologici. Le caratteristiche che possono essere misurate includono il numero e l'area superficiale dei bout, la lunghezza NMJ e il numero di rami, il numero di compartimenti NMJ non collegati e il numero di zone attive.

Nell'esempio seguente, analizzeremo la morfologia delle NMJ di Drosophila colorate con DLG1, un marcatore postsinaptico, e BRP, un marcatore di zona attiva.

- Per questo protocollo, generare stack di immagini di NMJ e salvarle come singoli file TIFF in cui il canale 1 mostra la colorazione DLG1 o un marcatore simile e il canale 2 mostra la colorazione BRP. Per iniziare, creare proiezioni Z e hyperstack dei file immagine NMJ. Apri le opzioni del plugin e seleziona Drosophila NMJ morphometrics.

A questo punto, identificare la stringa di file univoca che il microscopio ha assegnato alla serie di immagini durante la memorizzazione come TIFF. Questo sarà alla fine del nome dell'immagine. Copia e incolla la stringa data al piano più basso e al numero di canale nella finestra di impostazione della stringa del file univoco. Quindi seleziona la sottomacro "Converti in stack" e scegli la directory o la cartella in cui si trovano le immagini.

Per ogni file immagine, vengono creati due nuovi file con i nomi predefiniti stack e flat stack, seguiti dal nome dell'immagine originale. I file originali possono quindi essere eliminati per risparmiare spazio di archiviazione. Successivamente, dall'interfaccia morfometrica di Drosophila NMJ, selezionare la sottomacro ROI definita e scegliere la directory del file immagine.

Quando si apre la prima proiezione, selezionare lo strumento di selezione a mano libera, quindi utilizzare il mouse per definire una regione contenente un terminale NMJ completo di interesse. Una volta selezionato, fare clic su OK nella finestra del terminale definita. Continuare a eseguire questa operazione fino a quando i terminali NMJ non sono definiti in tutte le proiezioni. La macro fa avanzare automaticamente il processo. Per ogni file immagine, viene creato un nuovo file con i nomi predefiniti ROI seguiti dal nome dell'immagine originale.

Per quantificare le caratteristiche NMJ, vai prima all'interfaccia morfometrica NMJ di Drosophila e imposta la scala. Ad esempio, se un pixel dell'immagine corrisponde a 0,72 micron, impostate la scala pixel su 1 e la scala della distanza su 0,072. Quindi seleziona la sottomacro Analizza e, se ci sono due immagini del canale, attiva anche Aspetta. Premere OK e, quando richiesto, selezionare la directory del file immagine. Il tempo di elaborazione può essere di diversi minuti per sinapsi.

Dopo l'analisi, i nuovi file di immagine per ogni sinapsi analizzata vengono memorizzati nella cartella parentale e le misurazioni quantitative si trovano nel file results.txt. Ispeziona tutte le immagini ed escludi le immagini con errori di segmentazione.

Ad esempio, parti del terminale sinaptico potrebbero non essere incluse nel contorno giallo. Parti dello sfondo potrebbero essere incluse nel terminale sinaptico. Una linea scheletrica blu può estendersi oltre il terminale sinaptico. Potrebbero essere presenti troppe zone attive o alcune zone attive potrebbero non essere rilevate.