Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di generare tessuto cardiaco ingegnerizzato tridimensionale che possa essere utilizzato come piattaforma di analisi della contrazione in vitro per lo screening dei farmaci e la modellazione delle malattie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo cardiaco sulla modellazione delle malattie, sulla farmacologia della sicurezza e sugli effetti delle varianti genetiche o dei farmaci sulla forza contrattile. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la forza contrattile può essere misurata in tessuti cardiaci ingegnerizzati di diverse specie in condizioni sterili, per lunghi periodi di tempo.

Gli scienziati nuovi a questo metodo potrebbero lottare con la mancanza di qualità cellulare. O la mancanza di un nel mezzo. È importante ottimizzare l'auto-preparazione ed evitare cicli del A dimostrazione di questa procedura saranno Anika Benzin e Umber Saleem.

Prima di iniziare la procedura, aggiungere 1,6 millilitri di agarosio caldo al due per cento nei pozzetti di pronto soccorso di una piastra a 24 pozzetti. E posizionare immediatamente il politetrafluoroetilene nei distanziatori nell'agarosio. Dopo circa 10 minuti a temperatura ambiente, l'agarosio diventerà opaco, a significare la sua solidificazione.

Rimuovere i distanziatori e posizionare i rack PDMS nei getti in modo che le coppie di montanti del rack raggiungano ogni stampo di agarosio. Quando tutti i rack sono stati posizionati, sospendiamo i cardiomiociti in terreno a una concentrazione minima di 1,5 volte 10 per le sette cellule per millilitro e la ricostituzione appena preparata mescola con fibrinogeno da 10 a 15 volte con la pipetta sierologica fino a quando il coagulo di fibrinogeno non si scioglie. Controllare l'omogeneità della miscela di ricostituzione nella pipetta.

Quindi, per ogni tessuto cardiaco ingegnerizzato, o EHT, mescolare 100 microlitri di miscela di ricostituzione con tre microlitri di trombina in una provetta da 200 microlitri. E immediatamente aliquotare 100 microlitri di questa miscela di trombina EHT nelle fessure dell'agarosio. Utilizzare un nuovo puntale del filtro per ogni EHT.

Una volta che tutte le fessure sono state riempite con la miscela di ricostituzione, chiudere il coperchio della piastra di coltura cellulare e incubare le preparazioni per due ore a 37 gradi Celsius e al sette percento di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, posizionare la piastra in una cappa sterile e coprire ogni pozzetto con 200-500 microlitri di terreno. Agitare delicatamente la piastra e rimettere gli EHT nell'incubatrice.

Dopo 10 minuti, trasferire con cura i rack in una nuova piastra da 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di terreno EHT per pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari nelle condizioni di coltura appropriate. Alimentazione degli EHT ogni lunedì, mercoledì e venerdì, trasferendo i rack PDMS su una seconda piastra con terreno fresco. Da sette a 10 giorni dopo il calco, gli EHT dovrebbero dimostrare contrazioni spontanee che deviano i perni delle rastrelliere PDMS.

Per analizzare le contrazioni dell'EHT, il giorno dell'esperimento, accendere il dispositivo di riscaldamento nello strumento di analisi EHT due ore prima della misurazione. Immediatamente prima dell'analisi, accendere le alimentazioni di gas ed elettroniche del sistema di assi. Per una registrazione di base, posizionare la piastra EHT nello strumento di analisi EHT e avviare il software di analisi della contrazione secondo le istruzioni del produttore.

Utilizzando le istruzioni del manuale del software per avviare una nuova corsa, fare clic sulla scheda del protocollo per inserire le informazioni pertinenti sullo studio. Aprire la scheda di configurazione e scegliere i pozzetti per l'analisi. A causa dei limiti di tempo, questo è dimostrato solo per due EHT in questo video.

Quindi fare clic sulla scheda di visualizzazione della telecamera e avviare la modalità live della telecamera con la modalità di rilevamento automatico delle figure. Regolare la posizione della telecamera con le coordinate xyz per ogni pozzetto selezionato nella parabola a 24 pozzetti, facendo attenzione che ogni EHT sia al centro della finestra e a fuoco. Assicurati che le croci blu siano nelle estremità superiore e inferiore degli EHT e si muovano in modo da corrispondere alle contrazioni degli EHT.

E premere il pulsante di posizione ok per salvare le posizioni impostate di ciascun pozzo. Ora fai clic sulla scheda dei parametri per definire i criteri con cui il software identifica un picco di contrazione, contrassegnando i picchi con quadrati verdi. Salva tutte le impostazioni inserite premendo il pulsante usa parametri su tutti i pozzetti.

Quindi fare clic sulla scheda automatica e sul pulsante di avvio per registrare le contrazioni EHT al basale e per calcolare la contrattilità basale spontanea per ogni EHT. L'analisi della contrazione in tempo reale verrà visualizzata nella scheda in tempo reale. Assicurati che le croci blu si muovano solo verticalmente per corrispondere alle contrazioni degli EHT.

Per analizzare gli effetti di uno specifico farmaco di interesse sulle contrazioni, trasferire prima una piastra a 24 pozzetti riempita con soluzione tiroidea priva di proteine sotto una cappa sterile e posizionare gli elettrodi di carbonio nei pozzetti. Trasferire gli EHT nei loro rack PDMS sopra gli elettrodi e rimetterli nell'incubatore. Dopo circa mezz'ora, posizionare gli EHT nell'interblocco dello strumento di analisi EHT e registrare la contrattilità basale spontanea per 20 secondi per EHT.

Quindi, collegare gli elettrodi di carbonio al cavo di stimolazione e iniziare a stimolare elettricamente gli EHT. Registra la linea di base per 10 secondi per EHT, facendo attenzione che tutti gli EHT siano corretti. Il segnale di stimolazione è ora contrassegnato da linee verticali blu, incluse nell'innesto di contrazione prima di ogni picco.

Dopo la registrazione di base, trasferire gli elettrodi e i rack PDMS in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente la prima concentrazione di farmaco e riportare immediatamente gli EHT nell'interblocco dello strumento di analisi EHT per un'incubazione di 20 minuti. Ricollegare i cavi di stimolazione, regolare il riconoscimento della cifra e registrare le contrazioni dell'EHT in risposta alla prima concentrazione di farmaco. Dopo che tutte le concentrazioni del farmaco sono state testate, salvare tutte le registrazioni PDF risultanti e controllare ogni registrazione per il riconoscimento delle cifre e il corretto posizionamento dei quadrati e degli artefatti del picco di contrazione.

Per l'analisi offline, fare clic su Seleziona esecuzione per la rispettiva esecuzione dal database delle esecuzioni e nella scheda dei parametri, modificare il parametro per l'analisi della contrazione. Quindi, nella scheda offline, scegli analisi offline per analizzare nuovamente i video. Per regolare il riconoscimento delle figure e per registrare un nuovo file video.

Regola il riconoscimento delle figure nella scheda in tempo reale e seleziona la revisione del campione. L'EHT sarà ora analizzato in base alle nuove posizioni. L'analisi di ciascun EHT si basa sul riconoscimento delle figure alle estremità superiore e inferiore del tessuto.

Le contrazioni EHT filmate vengono quindi analizzate automaticamente dall'algoritmo del software dello strumento di analisi EHT e i picchi vengono determinati in base ai criteri predefiniti pertinenti. La misurazione a lungo termine dell'analisi della contrazione EHT dimostra che non ci sono cambiamenti apparenti dipendenti dal tempo nella forza di contrazione, nella frequenza di battimento, nella contrazione T1 o nei tempi di rilassamento T2 per un massimo di 20 ore. Indica un alto livello di stabilità per i costrutti.

Infatti, i risultati per ogni segnale EHT sono riproducibili con una bassa variabilità. L'esposizione a un bloccante dei canali hERG, tuttavia, provoca un prolungamento significativo del tempo di rilassamento del T2, a partire dalla concentrazione. E un modello di battitura irregolare a concentrazioni più elevate.

Una volta padroneggiati, 24 EHT possono essere generati in 30 minuti se la preparazione viene eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della modellazione delle malattie per esplorare l'effetto delle varianti genetiche in vitro. La versatilità di questo modello, ne consente l'abbinamento con cellule staminali indotte umane o con la tecnologia di editing genomico.

Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi come l'istologia o l'analisi dell'RNA e delle proteine per rispondere a ulteriori domande sulla trascrizione e l'espressione genica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea su come lanciare e analizzare gli EHT. Se hai domande su questa procedura, non esitare e contattaci direttamente.