Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety
15 aprile 2017
Qui mostriamo la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) -derived cardiomiociti. Presentiamo un metodo per analizzare forza di contrazione e l'alterazione esemplare del modello di contrazione dal hERG inibitore canale E-4031. Questo metodo mostra elevato livello di resistenza e affidabilità screening di farmaci cardiaco.
L'obiettivo generale di questa tecnica è generare tessuti cardiaci ingegnerizzati tridimensionali che possano essere utilizzati come piattaforma di analisi della contrazione in vitro per lo screening di farmaci e la modellizzazione delle malattie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiaco riguardo la modellizzazione delle malattie, la farmacologia della sicurezza e gli effetti di varianti geniche o di farmaci sulla forza contrattile. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la forza contrattile può essere misurata in tessuti cardiaci ingegnerizzati provenienti da diverse specie, in condizioni sterili e per periodi di tempo prolungati.
Scienziati alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della scarsa qualità cellulare o della mancanza di un componente nel mezzo. È importante ottimizzare la preparazione autonoma ed evitare cicli del procedimento. A dimostrare questa procedura saranno Anika Benzin e Umber Saleem.
Prima di iniziare la procedura, aggiungere 1,6 millilitri di agarosio al due percento caldo nei pozzetti di primo soccorso di una piastra a 24 pozzetti. E inserire immediatamente distanziatori in politetrafluoroetilene negli agarosi. Dopo circa 10 minuti a temperatura ambiente, l'agarosio diventerà opaco, segnalando la sua solidificazione.
Rimuovere gli spaziatori e posizionare le staffe in PDMS negli stampi in modo che coppie di perni della staffa entrino nei modelli in agarosio. Una volta posizionate tutte le staffe, sospendere i cardiomiociti nel mezzo a una concentrazione minima di 1,5 volte 10 alla sette cellule per millilitro e nel mix di ricostituzione appena preparato con fibrinogeno, pipettando 10-15 volte con la pipetta sierologica finché il coagulo di fibrinogeno non si è completamente disciolto. Verificare l'omogeneità del mix di ricostituzione all'interno della pipetta.
Quindi, per ogni tessuto cardiaco ingegnerizzato, o EHT, mescolare 100 microlitri di soluzione di ricostituzione con tre microlitri di trombina in un tubo da 200 microlitri. Aliquotare immediatamente 100 microlitri di questa miscela di trombina per EHT nelle scanalature in agarosio. Utilizzare una punta filtrante nuova per ogni EHT.
Dopo aver riempito tutte le fessure con la miscela di riconstituzione, chiudere il coperchio della piastra per colture cellulari e incubare le preparazioni per due ore a 37 gradi Celsius e sette percento di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, posizionare la piastra in una cappa sterile e ricoprire ogni pozzetto con 200-500 microlitri di mezzo. Agitare delicatamente la piastra e riportare gli EHT nell'incubatore.
Dopo 10 minuti, trasferire con attenzione i supporti in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di mezzo EHT per pozzetto e posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari nelle appropriate condizioni di coltura. Nutrire gli EHT ogni lunedì, mercoledì e venerdì, trasferendo i supporti in PDMS in una seconda piastra con mezzo fresco. Da 7 a 10 giorni dopo la colatura, gli EHT dovrebbero mostrare contrazioni spontanee che flettono i perni dei supporti in PDMS.
Per analizzare le contrazioni dell'EHT, il giorno dell'esperimento accendere il dispositivo di riscaldamento dello strumento di analisi EHT due ore prima della misurazione. Immediatamente prima dell'analisi, accendere l'alimentazione gassosa e quella elettronica del sistema dell'asse. Per una registrazione della linea di base, posizionare la piastra EHT nello strumento di analisi EHT e avviare il software di analisi delle contrazioni seguendo le istruzioni del produttore.
Utilizzando le istruzioni del manuale del software per avviare una nuova esecuzione, fare clic sulla scheda del protocollo per inserire le informazioni relative allo studio. Aprire la scheda di configurazione e selezionare le pozzette per l'analisi. A causa dei limiti di tempo, questo viene dimostrato solo per due EHT in questo video.
Quindi fare clic sulla scheda della vista della telecamera e avviare la modalità dal vivo della telecamera con rilevamento automatico delle immagini. Regolare la posizione della telecamera mediante le coordinate xyz per ciascun pozzetto selezionato nella piastra a 24 pozzetti, assicurandosi che ogni EHT sia al centro della finestra e a fuoco. Verificare che le croci blu si trovino alle estremità superiore e inferiore degli EHT e si muovano in sincronia con le contrazioni degli stessi.
E premere il pulsante posizione ok per salvare le posizioni impostate di ogni pozzetto. Ora fare clic sulla scheda parametri per definire i criteri in base ai quali il software identifica un picco di contrazione, contrassegnando i picchi con quadrati verdi. Salvare tutte le impostazioni inserite premendo il pulsante utilizza parametri su tutti i pozzetti.
Quindi fare clic sulla scheda automatica e sul pulsante di avvio per registrare le contrazioni di base dell'EHT e per calcolare la contrattilità spontanea di base per ciascun EHT. L'analisi delle contrazioni in tempo reale verrà visualizzata nella scheda in tempo reale. Assicurarsi che le croci blu si muovano esclusivamente in verticale, in modo da corrispondere alle contrazioni dell'EHT.
Per analizzare gli effetti di un farmaco specifico di interesse sulle contrazioni, trasferire innanzitutto una piastra a 24 pozzetti riempita con soluzione tiroidea priva di proteine sotto una cappa sterile e inserire elettrodi di carbonio nei pozzetti. Trasferire gli EHT sui loro supporti in PDMS sopra gli elettrodi e rimettere gli EHT nell'incubatore. Dopo circa mezz'ora, posizionare gli EHT nell'interfaccia dello strumento di analisi degli EHT e registrare la contrattilità spontanea di base per 20 secondi per ogni EHT.
Successivamente, collegare gli elettrodi di carbonio al cavo di stimolazione e iniziare a stimolare elettricamente gli EHT. Registrare la baseline stimolata per 10 secondi per ogni EHT, assicurandosi che tutti gli EHT siano correttamente stimolati. Il segnale di stimolazione è ora indicato da linee verticali blu, incluse nel tracciato di contrazione prima di ogni picco.
Dopo la registrazione di base, trasferire gli elettrodi e i supporti in PDMS in una nuova piastra a 24 pozzetti contenente la prima concentrazione del farmaco e reinserire immediatamente gli EHT nell'interlock dello strumento di analisi degli EHT per un'incubazione di 20 minuti. Ricollegare i cavi di stimolazione, regolare il riconoscimento della traccia e registrare le contrazioni degli EHT in risposta alla prima concentrazione del farmaco. Dopo aver testato tutte le concentrazioni del farmaco, salvare tutte le registrazioni PDF risultanti e verificare ciascuna registrazione per quanto riguarda il riconoscimento della traccia e il posizionamento corretto dei quadrati corrispondenti ai picchi di contrazione e delle eventuali interferenze.
Per l'analisi offline, fare clic su "seleziona esecuzione" per l'esecuzione corrispondente nel database delle esecuzioni e, nella scheda dei parametri, modificare il parametro per l'analisi della contrazione. Successivamente, nella scheda offline, scegliere "analisi offline" per rieseguire l'analisi dei video. Per regolare il riconoscimento delle figure e registrare un nuovo file video.
Regolare il riconoscimento della figura nella scheda in tempo reale e selezionare la revisione del campione. L'EHT verrà ora analizzato in base alle nuove posizioni. L'analisi di ogni EHT si basa sul riconoscimento della figura alle estremità superiore e inferiore del tessuto.
Le contrazioni degli EHT filmate vengono quindi analizzate automaticamente mediante l'algoritmo software dello strumento di analisi degli EHT e i picchi vengono determinati in base ai pertinenti criteri predefiniti. L'analisi della contrazione degli EHT su misurazioni a lungo termine dimostra che non vi sono cambiamenti apparenti dipendenti dal tempo nella forza contrattile, nella frequenza di battito, nei tempi di contrazione T1 o nei tempi di rilassamento T2 per un periodo fino a 20 ore. Ciò indica un elevato livello di stabilità per le costruzioni.
Effettivamente, i risultati per ciascun segnale EHT sono riproducibili con una bassa variabilità. L'esposizione a un bloccante del canale hERG, tuttavia, determina un allungamento significativo del tempo di rilassamento T2, a partire dalla concentrazione, e un ritmo di battito irregolare a concentrazioni più elevate.
Una volta padroneggiata, è possibile generare 24 EHT in 30 minuti se la preparazione viene eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della modellizzazione delle malattie per esplorare l'effetto delle varianti geniche in vitro. La versatilità di questo modello consente di combinarlo con cellule staminali indotte umane o con la tecnologia di editing del genoma.
Seguendo questa procedura, metodi aggiuntivi come l'analisi istologica o l'analisi di RNA e proteine possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande riguardo alla trascrizione genica e all'espressione genica. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea chiara su come realizzare e analizzare gli EHT. Se avete domande riguardo a questa procedura, non esitate a contattarci direttamente.
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Panoramica
Questo studio dimostra la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato tridimensionale a partire da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) per l'analisi della contrazione in vitro. Il metodo consente la valutazione della forza contrattile e dell'impatto di agenti farmacologici, come l'inibitore del canale hERG E-4031, sui modelli di contrazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ingegneria dei tessuti cardiaci
- Farmacologia
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- I tessuti cardiaci ingegnerizzati possono modellare le malattie cardiache.
- Le piattaforme in vitro sono essenziali per lo screening farmacologico e la farmacologia della sicurezza.
- Comprendere la forza contrattile è fondamentale per valutare la funzione cardiaca.
- I principali ostacoli includono il mantenimento della qualità cellulare e l'ottimizzazione delle condizioni di coltura.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo robusto per la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato.
- Analizzare gli effetti dei farmaci sulla contrazione cardiaca.
- Fornire una piattaforma per lo studio di varianti geniche e del loro impatto sulla funzione cardiaca.
Metodi Utilizzati
- Generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato da cardiomiociti derivati da hiPSC.
- Misurazione della forza di contrazione in condizioni sterili.
- Valutazione dei modelli di contrazione in risposta ad agenti farmacologici.
- Ottimizzazione delle condizioni di coltura per la qualità cellulare.
Risultati principali
- Generazione con successo di tessuto cardiaco ingegnerizzato funzionale.
- Alterazione dimostrata dei modelli di contrazione con E-4031.
- La robustezza del metodo ne supporta l'utilizzo nello screening farmacologico.
- Potenzialità per studi a lungo termine sulla funzione cardiaca.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento prezioso per la ricerca cardiaca.
- Permette lo studio degli effetti dei farmaci sul tessuto cardiaco in vitro.
- Applicazioni future includono la modellizzazione delle malattie e la farmacologia della sicurezza.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi automatizzata della contrazione del tessuto cardiaco ingegnerizzato umano fornisce una piattaforma scalabile e standardizzata per lo screening precoce della sicurezza cardiaca dei farmaci, consentendo una valutazione quantitativa della forza contrattile e del rischio di aritmia indotta da farmaci. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico riproducendo le risposte cardiache umane ad agenti farmacologici come gli inibitori del canale hERG, migliorando la fiducia nella validazione degli obiettivi terapeutici. Il metodo aumenta il valore predittivo nell'identificazione dei composti promettenti collegando modelli derivati da cellule staminali a letture funzionali rilevanti per gli esiti clinici di sicurezza.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante modelli di tessuto cardiaco umano in grado di generare forza e che riflettono la fisiologia contrattile rilevante per la malattia.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico rilevando gli effetti dei farmaci sulla cinetica della contrazione e sui tempi di rilassamento in un sistema di origine umana.
- Valore predittivo: Produce dati quantitativi sull'allungamento del T2 e sull'irregolarità del battito per selezionare target con profili di sicurezza cardiaca migliorati.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza per saggi: Produce tessuti 3D standardizzati e sterili in formato a 24 pozzetti, compatibili con flussi di lavoro automatizzati per l'analisi dell'imaging e della contrazione.
- Output quantitativo: Misura la forza basata sull'accorciamento mediante la deflessione del supporto in PDMS, consentendo la valutazione dose-risposta di composti come l'E-4031.
- Scalabilità: Permette la generazione di diverse centinaia di tessuti cardiaci ingegnerizzati a settimana, limitata unicamente dalla disponibilità di cardiomiociti, sostenendo schermate a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Utilizza cardiomiociti umani per modellare la dinamica della contrazione, migliorando l'allineamento traslazionale con la funzione cardiaca umana.
- Continuità meccanicistica: Rileva contrazioni auxotoniche e parametri di rilassamento che riflettono l'accoppiamento elettromeccanico, supportando la valutazione del rischio preclinico.
- Supporto decisionale: Permette la riproduzione di alterazioni contrattili indotte da farmaci, fornendo informazioni per decisioni di avanzamento o abbandono nell'ottimizzazione dei composti promettenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica della sicurezza, fornendo una validazione funzionale dei bersagli molecolari in un contesto di tessuto umano.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi su varianti geniche e effetti di farmaci mediante la misurazione in tempo reale della forza contrattile in tessuti cardiaci umani ingegnerizzati.
- Screening: Fornisce letture automatizzate e riproducibili delle contrazioni che supportano la standardizzazione dei saggi e lo screening di composti in condizioni controllate.
- Analisi: Genera parametri quantificabili, tra cui ampiezza della contrazione, frequenza di battito e tempo di rilassamento T2, per analisi comparative tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Utilizza tessuti di origine umana per collegare i risultati ottenuti in vitro con le aspettative cliniche di sicurezza, in particolare per le alterazioni dei canali ionici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening della sicurezza cardiaca applicabile a diversi progetti e classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella risposta cardiaca ai farmaci.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione attraverso il riconoscimento automatico delle figure e condizioni ambientali controllate.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale identificando precocemente composti cardiotoxici, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento corrette per il rischio mediante segnali di sicurezza quantitativi derivati da modelli di tessuto cardiaco umano.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nella coltura cellulare sterile e nella manipolazione dei cardiomiociti.
- Richiede un'attrezzatura per imaging con controllo degli assi XYZ e un software automatizzato di riconoscimento delle figure per il rilevamento delle contrazioni.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro dei protocolli di generazione del tessuto, esposizione ai farmaci e analisi, per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si passa a diverse fonti cellulari o modelli genetici, mantenendo l'integrità e la funzionalità del tessuto.
- È limitato dalla disponibilità e dallo stato di maturazione dei cardiomiociti, che influiscono sulle prestazioni contrattili e sulla coerenza del saggio.
