Name: Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata della contrazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati da hiPSC per lo screening di sicurezza farmacologica. Questo metodo misura la forza contrattile e gli effetti di farmaci come E-4031 in vitro.

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Gli autori sono grati ad Alessandra Moretti e Dennis Schade per la gentile apporto di materiale. Riconosciamo il grande supporto del gruppo di lavoro IPS e EHT presso il Dipartimento di Farmacologia Sperimentale e Tossicologia della UKE. Il lavoro degli autori è sostenuto da sovvenzioni dal DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare) ed il Ministero dell&#39;Istruzione tedesco e della ricerca (BMBF), la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centro nazionale britannico per la sostituzione Affinamento &amp; Riduzione degli animali nella ricerca (NC3Rs CRACK-IT concedere 35.911-259.146), la British Heart Foundation RM / 13/30157, il Consiglio europeo della ricerca (Advanced Grant IndivuHeart), la Fondazione tedesca Cuore e la Freie und Hansestadt Hamburg.

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 <a target="_blank" href="http://www.eht-technologies.com">http://www.eht-technologies.com</a> Forthcoming.</li>
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IM, TE e AH sono co-fondatori di EHT Technologies GmbH, Germania.

tessuto cardiaco ingegnerizzato offre una valida opzione per la cassetta degli attrezzi della ricerca cardiovascolare. EHTs nel formato a 24 pozzetti sono dimostrati utili per malattia modellazione 8, 14, della sicurezza del farmaco 7, 8, 10, 11, 15, o ricerca cardiovascolare di base <sup class="xref"...

effetti collaterali cardiaci, come la sindrome del QT lungo indotta da farmaci hanno portato a ritiri dal mercato negli ultimi anni. Le statistiche indicano che circa il 45% di tutti i prelievi sono causa di effetti indesiderati sul sistema cardiovascolare 1. Questo fallimento della droga dopo il costoso processo di sviluppo e approvazione è lo scenario peggiore per le aziende farmaceutiche. reparti di ricerca e sviluppo, pertanto si concentrano sul rilevamento di tali effetti cardiovascolari indesiderati nella fase iniziale. Per preoccupazioni economiche ed etiche, gli sforzi per ridurre gli esperimenti sugli animali e sostituirli con nuovi test screening in vitro sono in corso. Una serie di test stabiliti sono inclusi negli Stati Uniti Food and Drug Administration (FDA) e l&#39;Agenzia europea per i medicinali (EMA) linee guida per la valutazione preclinica di effetti della droga proaritmici 2. La tecnologia di riprogrammazione delle cellule somatiche seguita dalla differenziazione delleindotte cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC) potenziato questo campo di ricerca 3. Esso offre ora la possibilità per lo screening di nuovi farmaci candidati su cardiomiociti umani in vitro ed evita problemi con differenze tra le specie. Protocolli di differenziamento cardiaco Recenti 4, 5 forniscono fornitura illimitata di cardiomiociti senza preoccupazione etica. Tuttavia, la misurazione della forza contrattile, il più importante e caratterizzato dal parametro vivo dei cardiomiociti, non è ben stabilita. Questo è legato alla relativa immaturità 6 dei cardiomiociti indotte umane staminali pluripotenti derivate da cellule (hiPSC-CM) rispetto al cardiomiociti adulti. Una possibile l&#39;avanzamento è di ingegnere tessuto cardiaco 3-dimensionale da singole cellule 7 (tessuto cardiaco ingegnerizzato, EHT). Il protocollo si basa su EHT incorporare singolo murino o cardiomiociti umani 8 </sup&gt;, 9, 10 in fibrina idrogel tra due polidimetilsilossano flessibile (PDMS) posti 11 in formato a 24 pozzetti. Nel giro di pochi giorni i cardiomiociti iniziano a contrarsi spontaneamente come singole cellule e cominciano a formarsi le reti cellulari. Dopo 7-10 giorni, contrazioni macroscopiche di tutto il tessuto sono visibili. Durante questo processo la matrice extracellulare è rimodellato, che porta ad una diminuzione di diametro e lunghezza. L&#39;accorciamento dei risultati EHT in flessione della PDMS caricare anche durante il riposo, sottoponendo cardiomiociti nel EHT sviluppo a carico continuo. EHTs continuano a svolgere le contrazioni muscolari auxotonic per diverse settimane. EHTs nell&#39;uomo hanno dimostrato risposte a stimoli fisiologici e farmacologici che indicano la loro idoneità per lo screening di droga e la malattia di modellazione 7. In questo manoscritto vi presentiamo un protocollo robusto e facile per i Generatisu EHT umana, e l&#39;analisi automatizzata di contrattilità concentrazione cambiamenti a carico del pattern contrazione in presenza di inibitori del canale hERG.

<table><tbody><tr><td>Strumento di analisi EHT EHT</td><td>Technologies GmbH</td><td>A0001</td><td>Il software è incluso</td></tr><tr><td>EHT PDMS rack</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT PTFE spacer</td><td>EHT Technologies GmbH</td><td>C0002</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo EHT</td><td>Technologies GmbH</td><td>P0001</td><td></td></tr><tr><td>EHT stimolatore adattatore/cavo EHT</td><td>Technologies GmbH</td><td>P0002</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>provetta falcon da 15 mL, graduata&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Sarstedt</td><td>831.830</td><td></td></tr><tr><td>Pallone rotante</td><td>Integra</td><td>182 101</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore Variomag/ Cimarec Biosystem Direct&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>70101</td><td>Regola la velocità del rotore a 40 giri/min</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T175</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>831.812.002</td><td></td></tr><tr><td>Scaffalatura per sedimentazione a V</td><td>Realizzato su misura presso UKE Hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>10&times; DMEM</td><td>Gibco</td><td>52100</td><td></td></tr><tr><td>1-Tioglicerina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-Fosfo-L-ascorbico acido trisodico sale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>Activin-A&nbsp;</td><td>R& Sistemi D</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen</td><td>15510-019</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Baxter GmbH</td><td>1428</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS insulina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& Sistemi D</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom</td><td>F0415</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>DNasi II, tipo V (da milza bovina)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfina&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab120843</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-921</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno (bovino)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Per rivestimento: diluizione 1:200</td></tr><tr><td>HBSS senza Ca2+/Mg2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Tecnologie di vita</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana&nbsp;</td><td>Biological Industries</td><td>05-720-1B</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, umana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipidmix&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5146</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Per la ricostituzione EHT.</td></tr><tr><td>N-Benzil-p-Toluenesulfonamide</td><td>TCI</td><td>B3082-25G</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza MgCl2/CaCl2</td><td>Biochrom</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>TGF&szlig; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7513</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biorbyt</td><td>orb6014</td><td></td></tr><tr><td>hiPSC</td><td>Custom made at UKE hamburg</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>iCell cardiomyocytes kit</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>CMC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>Pluricyte cardiomyocyte kit</td><td>Pluriomics</td><td>PCK-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Cor.4U - HiPSC cardiomyocytes kit</td><td>Axiogenesis AG</td><td>Ax-C-HC02-FR3</td><td></td></tr><tr><td>Cellartis cardiomiociti</td><td>Takara Bio USA, Inc.</td><td>Y10075</td><td></td></tr></tbody></table>

automated analysis contrazione di ingegneria dei tessuti umani cuore per lo screening cardiaco drug safety

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

ingegneria tessuto cardiaco descrive tecniche per costituire tre tessuti ingegnerizzati genera forza dimensionali. Per l&#39;attuazione di queste procedure in ricerca di base e lo sviluppo di farmaci preclinico, è importante sviluppare protocolli per la generazione e l&#39;analisi automatizzata in condizioni standardizzate. Qui, presentiamo una tecnica per generare tessuto cardiaco Engineered (EHT) da cardiomiociti di specie differenti (ratto, topo, umane). La tecnica si basa sul complesso di fibrina gel contenente cardiomiociti dissociate tra polidimetilsilossano elastico (PDMS) posti in un formato a 24 pozzetti. Tridimensionali, EHTs forza generatrice costituiscono entro due settimane dopo la fusione. Questo procedimento consente la generazione di diverse centinaia EHTs settimana ed è tecnicamente limitato solo dalla disponibilità di cardiomiociti (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Valutazione delle contrazioni muscolari auxotonic viene eseguita in una camera di incubazione modificato con un meccaninterblocco ical per piastre da 24 pozzetti ed una telecamera posta sulla parte superiore di questa camera. Un software controlla una videocamera spostata su un sistema di assi XYZ a ciascun EHT. contrazioni EHT vengono rilevati da un algoritmo automatizzato figura riconoscimento, e la forza è calcolata sulla base accorciamento del EHT e la propensione elastica e geometria dei posti PDMS. Questa procedura permette di analisi automatica di un numero elevato di EHT in condizioni standardizzate e sterili. La rilevazione affidabile degli effetti della droga su cardiomiociti contrazione è cruciale per lo sviluppo di farmaci cardiaco e sicurezza farmacologica. Noi dimostriamo, con l&#39;esempio della hERG inibitore canale E-4031, che il sistema EHT umano replica risposte farmacologiche sulla cinetica di contrazione del cuore umano, indicando che sia uno strumento promettente per lo screening sicurezza dei farmaci cardiaca.

Cardiaca Differenziazione e preparazione di EHT HiPSC sono state estese su matrice membrana basale fattore di crescita ridotta, dissociata con EDTA e corpi embrionali (EBS) formate in fiasche filatore notte. Dopo l&#39;induzione mesodermal per tre giorni, differenziazione cardiaca è stato avviato con l&#39;inibitore Wnt. Dopo ~ 17 giorni di protocollo di differenziazione, EBS battendo state dissociate in singole cellule con colla...

Qui mostriamo la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) -derived cardiomiociti. Presentiamo un metodo per analizzare forza di contrazione e l&#39;alterazione esemplare del modello di contrazione dal hERG inibitore canale E-4031. Questo metodo mostra elevato livello di resistenza e affidabilità screening di farmaci cardiaco.

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è generare tessuti cardiaci ingegnerizzati tridimensionali che possano essere utilizzati come piattaforma di analisi della contrazione in vitro per lo screening di farmaci e la modellizzazione delle malattie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo cardiaco riguardo la modellizzazione delle malattie, la farmacologia della sicurezza e gli effetti di varianti geniche o di farmaci sulla forza contrattile. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la forza contrattile può essere misurata in tessuti cardiaci ingegnerizzati provenienti da diverse specie, in condizioni sterili e per periodi di tempo prolungati.Scienziati alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa della scarsa qualità cellulare o della mancanza di un componente nel mezzo. È importante ottimizzare la preparazione autonoma ed evitare cicli del procedimento. A dimostrare questa procedura saranno Anika Benzin e Umber Saleem.Prima di iniziare la procedura, aggiungere 1,6 millilitri di agarosio al due percento caldo nei pozzetti di primo soccorso di una piastra a 24 pozzetti. E inserire immediatamente distanziatori in pol

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Bioingegneria

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Contraenti spontaneamente sincizi di cardiomiociti derivati da pluripotenti indotte dall'uomo le cellule staminali sono utili modelli di farmacologia e fisiologia cardiaca umana. Qui presentiamo un sistema di high throughput screening per quantificare gli effetti di composti esogeni battendo frequenza, utilizzando un colorante fluorescente Ca-sensibile e un lettore di piastre multi-pozzetto imaging e temperatura controllata.

Contrazioni di umano-iPSC-derivato del Cardiomyocyte sincizi misurata con un colorante fluorescente Ca sensibile a temperatura controllata piastre da 384 pozzetti

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un promettente modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Qui, dettagliamo un protocollo per misurare la contrattilità e l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM.

Applicazioni tecniche di microelectrode array e patch clamp recordings su cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

L'analisi dei cambiamenti nella funzione contrattile e nell'integrità cellulare dei cardiomiociti umani derivati da iPSC è di immensa importanza per lo sviluppo di farmaci non clinici. Un sistema ibrido di analisi cellulare a 96 pozzetti affronta entrambi i parametri in tempo reale e in modo fisiologico per risultati affidabili e rilevanti per l'uomo, necessari per una transizione sicura nelle fasi cliniche.

Sistema di analisi delle cellule ibride per valutare i cambiamenti strutturali e contrattili dei cardiomiociti umani derivati da iPSC per la valutazione preclinica del rischio cardiaco

I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l'analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Progettazione di un bioreattore per migliorare l'acquisizione dei dati e modellare la produttività dei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Questo protocollo descrive come misurare la contrattilità nei cardiomiociti primari umani adulti provenienti da cuori di donatori con il sistema MyoBLAZER, una piattaforma affidabile per valutare i cambiamenti della contrattilità indotti da farmaci durante lo sviluppo preclinico.

Misurazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti primari umani adulti isolati

Questo protocollo fornisce metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D e descrive il loro uso nelle modalità di screening preclinico dei farmaci. I metodi descritti utilizzano un sistema di rilevamento magnetico per facilitare la valutazione simultanea di 24 tessuti in parallelo.

Test preclinici di farmaci in tessuti muscolari ingegnerizzati 3D scalabili

Qui, dimostriamo un metodo di valutazione della contrattilità dei dispositivi medici cardiaci non invasivi utilizzando monostrati 2D di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CM), placcati su un substrato flessibile, accoppiati con microscopia basata su video. Questo strumento sarà utile per la valutazione in vitro delle proprietà contrattili dei dispositivi di elettrofisiologia cardiaca.

Valutazione della terapia di modulazione della contrattilità cardiaca in cardiomiociti 2D derivati da cellule staminali umane

Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Scopri l'analisi automatizzata della contrazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati da hiPSC per lo screening di sicurezza farmacologica. Questo metodo misura la forza contrattile e gli effetti di farmaci come E-4031 in vitro.

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

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