Name: Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Impara a creare tessuti cardiaci umani ingegnerizzati con composizione cellulare definita mediante marcatori di superficie e FACS. Questo metodo consente di studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca in modelli controllati.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH (1F30HL118923-01A1) per TJC, NIH / NHLBI PEN contratto HHSN268201000045C al KDC, il consiglio assegno di ricerca di Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) per BDG, l&#39;americano heart Association (12PRE12060254) per RJ, e Research Council Concessione di RAS (TBRS, T13-706 / 11) a RL finanziamento aggiuntivo è stato fornito a TJC dal NIH DRB 5T32GM008553-18 e come tirocinio per la formazione nel NIDCR-interdisciplinare in Sistemi e Sviluppo biologia e difetti di nascita T32HD075735. Gli autori hanno anche desiderano riconoscere con gratitudine Arthur Autz presso il Zahn centro del City College di New York per l&#39;assistenza con la lavorazione del bioreattore e Mamdouh Eldaly per l&#39;assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Boheler per consigli sulla differenziazione cardiaca, e il dottor Joshua Hare per fornire generosamente cellule staminali mesenchimali umane.

<ol><li>Serrao, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte-depleted+engineered+cardiac+tissues+support+therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).</li>
<li>Hansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+drug+screening+platform+based+on+engineered+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue.</a> Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).</li>
<li>Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).</li>
<li>Yildirim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+biological+ventricular+assist+device%3A+preliminary+data+from+a+small+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model.</a> Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Cell+Sheet+Transplantation+Improves+Damaged+Heart+Function+via+Superior+Cell+Survival+in+Comparison+with+Dissociated+Cell+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection.</a> Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).</li>
<li>Lesman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+tissue-engineered+human+vascularized+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).</li>
<li>Turnbull, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+functional+engineered+cardiac+tissues+toward+a+preclinical+model+of+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium.</a> FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).</li>
<li>Thavandiran, N., Dubois, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+formulation+of+functional+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).</li>
<li>Schaaf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+engineered+heart+tissue+as+a+versatile+tool+in+basic+research+and+preclinical+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology.</a> PloS One. 6 (10), e26397(2011).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+engineered+human+myocardium+with+mechanical+loading+and+vascular+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture.</a> Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).</li>
<li>Nunes, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biowire%3A+a+platform+for+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+filamentous+human+diseased+cardiac+tissue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model.</a> Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).</li>
<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+the+third+dimension%3A+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).</li>
<li>Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology%2C+adhesion+junctions%2C+presence+of+myofibrils+and+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS One. 7 (5), e38147(2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li>
<li>Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cardiomyocytes+influence+the+electrophysiological+maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation.</a> Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).</li>
<li>Dubois, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Gago-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THY-1+receptor+expression+differentiates+cardiosphere-derived+cells+with+divergent+cardiogenic+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential.</a> Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).</li>
<li>Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+dose-escalation+study+of+intravenous+adult+human+mesenchymal+stem+cells+%28prochymal%29+after+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).</li>
<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Wollert, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+autologous+bone-marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+the+BOOST+randomised+controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial.</a> Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+autologous+mononuclear+bone+marrow+cells+or+peripheral+mononuclear+blood+cells+after+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+rationale+and+design+of+the+HEBE+trial--a+prospective%2C+multicenter%2C+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart.+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial.</a> Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).</li>
<li>Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+bone+marrow+cell+therapy+improves+survival+and+induces+long-term+improvement+in+cardiac+parameters%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis.</a> Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).</li>
<li>Meyer, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+bone+marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+5-year+follow-up+from+the+randomized-controlled+BOOST+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial.</a> Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).</li>
<li>Meyer, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+bone+marrow+cell+transfer+after+myocardial+infarction%3A+eighteen+months%27+follow-up+data+from+the+randomized%2C+controlled+BOOST+%28BOne+marrOw+transfer+to+enhance+ST-elevation+infarct+regeneration%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial.</a> Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).</li>
<li>Hirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+mononuclear+cells+from+bone+marrow+or+peripheral+blood+compared+with+standard+therapy+in+patients+after+acute+myocardial+infarction+treated+by+primary+percutaneous+coronary+intervention%3A+results+of+the+randomized+controlled+HEBE+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial.</a> Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).</li>
<li>Simari, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mononuclear+cell+therapy+for+acute+myocardial+infarction%3A+a+perspective+from+the+cardiovascular+cell+therapy+research+network%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network.</a> Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).</li>
<li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293(2011).</li>
<li>Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MSCs%3A+Delivery+Routes+and+Engraftment%2C+Cell-Targeting+Strategies%2C+and+Immune+Modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation.</a> Stem Cells Int. , 732742(2013).</li>
<li>Trachtenberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+and+design+of+the+Transendocardial+Injection+of+Autologous+Human+Cells+%28bone+marrow+or+mesenchymal%29+in+Chronic+Ischemic+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Heart+Failure+Secondary+to+Myocardial+Infarction+%28TAC-HFT%29+trial%3A+A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study+of+safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy.</a> Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).</li>
<li>Williams, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+stem+cell+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy%3A+functional+recovery+and+reverse+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling.</a> Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).</li>
<li>Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+gene+expression+in+fetal+and+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Metabolic gene expression in fetal and failing human heart.</a> Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail.+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program%3A+a+suggested+metabolic+link+to+gene+expression+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Costruzione di tessuti umani ingegnerizzati definiti cardiaci (hect) in grado di fornire un modello più coerente e affidabile della funzione dei miociti cardiaci umana. Criticamente, tutti componenti cellulari ed extracellulari nel sistema sono noti e possono essere manipolati come desiderato, eliminando così l&#39;influenza confondenti di altri tipi di cellule sconosciuti risultanti dal processo di differenziazione. Per bilanciare la crescita cellulare rapida e ad alto rendimento, è preferibile che la differenziazione ...

Ingegneria tissutale cardiaca ha avanzato enormemente negli ultimi dieci anni, con più gruppi editoriali risultati completamente funzionale, tessuti battendo realizzati da entrambi i cardiomiociti murini 1-6 e, più recentemente, umani cellule staminali derivate miociti cardiaci 7-12. Il campo di ingegneria dei tessuti cardiaco è guidata da due obiettivi primari e sostanzialmente indipendenti: 1) per sviluppare innesti esogeni che possono essere trapiantate in mancanza di cuori per migliorare la funzione 4-6; e 2) sviluppare modelli in vitro per lo studio fisiologia e malattie, o come strumenti di screening per sviluppo terapeutico 2,7. Tridimensionale (3-D) coltura cellulare è considerata essenziale per lo sviluppo di strumenti di screening di nuova generazione, come la matrice 3-D riflette un microambiente cardiaco più naturale di coltura cellulare monostrato 2-D tradizionali; infatti alcuni aspetti della biologia cellulare sono fondamentalmente differenti in 2-D vs 3-D culture 13,14 </sup&gt;. Inoltre, i tessuti cardiaci ingegnerizzati sono costruiti da componenti completamente definite: una matrice extracellulare, e una popolazione di cellule. Per i tessuti cardiaci umani ingegnerizzati tradizionali, mentre la composizione della matrice extracellulare (solitamente fibrina 9 o collagene 7,8,10) è strettamente controllato, la composizione cella di input è meno ben definita, con l&#39;intera miscela di cellule da una differenziazione cardiaca diretto di entrambi le cellule staminali embrionali (ESC 7,9) o di cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC 10,12) che viene aggiunto ai tessuti. A seconda della linea cellulare specifica e l&#39;efficienza del protocollo differenziazione utilizzato, la percentuale risultante dei cardiomiociti può variare da meno del 25% a oltre il 90%, il fenotipo specifico cardiomiociti (cioè, ventricular-, atrial- o pacemaker-like) può anche variare, anche la frazione non cardiomiociti può essere molto eterogenea 15,16 e alterare la maturità del differenziata m cardiacoyocytes 17. Recenti cardiaco lavoro ingegneria dei tessuti ha tentato di controllare la popolazione di ingresso di cellule, sia con un reporter cardiaco linea di cellule staminali embrionali umane 8 o cellule superficie marcatori 18 viene utilizzato per isolare la componente dei miociti cardiaci della differenziazione. Mentre inizialmente un tessuto composto da sole miociti cardiaci sembra essere l&#39;ideale, questo è infatti il ​​caso; hECTs composte unicamente da miociti cardiaci non riescono a compattare nei tessuti funzionali, con alcuni gruppi di trovare un rapporto 3: 1 di miociti cardiaci: fibroblasti che producono la più alta forza di contrazione 8. Utilizzando diversi metodi di selezione delle cellule, compresi marcatori di superficie per l&#39;ordinamento delle cellule vive, è possibile creare hECTs con popolazioni cellulari definiti. Mentre marcatori di cellule stromali non cardiaci sono stati disponibili per un certo tempo, come il marcatore CD90 fibroblasti putativo 19,20, marcatori di superficie di miociti cardiaci sono stati più difficiliper identificare. SIRPα è stato tra i primi marcatori di superficie cardiaci identificati per miociti cardiaci umani 18 e ha dimostrato di essere altamente selettivo per il lignaggio cardiaco. Recentemente, abbiamo scoperto che in doppio ordinamento per SIRPα + e CD90 - cellule rese cardiomiociti quasi puro, con il CD90 + popolazione che presenta una fibroblasti simile fenotipo (Josowitz, osservazioni non pubblicate). Sulla base di questi risultati raccolti, qui descriviamo la creazione hECTs con un 3: 1 combinazione di SIRPα + / CD90 - cardiomiociti e fibroblasti CD90 +. La capacità di progettare un tessuto cardiaco umano completamente definita è essenziale non solo per la creazione di solidi strumenti di screening, ma anche per lo sviluppo di sistemi modello per indagare cellulo emergente e le terapie cardiache gene-based. In particolare, numerose terapie cellulari per insufficienza cardiaca, utilizzando tipi di cellule tra cui le cellule staminali mesenchimali (MSC) 21 </sup&gt;, le cellule staminali cardiache 22 e cellule mononucleari del midollo osseo 23-25, sono stati testati in studi clinici. Mentre molti dei risultati iniziali sono stati promettenti 21,23,25, il vantaggio iniziale, spesso diminuisce nel tempo 26-29. Una tendenza simile è stata riportata in murini ingegnerizzato tessuto cardiaco, che mostrano un significativo beneficio funzionale a causa di supplementazione di MSC, ma il beneficio non è sostenuta durante la coltura a lungo termine 1. Alla base le prestazioni sub-ottimali è la nostra limitata conoscenza dei meccanismi che regolano terapie cellulari. Una più profonda comprensione di come le cellule terapeutico esercitare la loro influenza benefica, nonché possibili conseguenze negative delle interazioni miociti-nonmyocyte, consentirebbe lo sviluppo di terapie migliorate ottenendo benefici clinicamente significativi e sostenuti, con effetti collaterali minimi, per i pazienti con insufficienza cardiaca. Qui, descriviamo l&#39;uso di hECTs definite a Esamate meccanismi di terapia cellulare. La composizione del tessuto controllato è essenziale per identificare i fattori specifici che influenzano le prestazioni dei cardiomiociti. Direttamente integrazione hECTs con il tipo di cellule terapeutiche di interesse (ad esempio, MSC), può rivelare gli effetti sulle prestazioni dei miociti cardiaci, come abbiamo dimostrato in crediti ECTS ratto 1. Il seguente protocollo multi-step inizia con diretto differenziazione delle cellule staminali cardiache, seguita dalla realizzazione del bioreattore multi-tessuto, e concludere con una descrizione di costruzione dei tessuti e analisi funzionale. I nostri esperimenti vengono eseguiti utilizzando la linea NIH-approvato H7 cellule staminali embrionali umane (hESC). Tuttavia, i seguenti protocolli sono anche stati testati utilizzando una linea hESC aggiuntivo e tre linee di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) con risultati simili. Abbiamo scoperto che l&#39;efficienza nella differenziazione dei cardiomiociti e il successo in hect fabbricazione può essere linea cellulare dipendente, in particolare folinee r hiPSC derivati ​​da singoli pazienti. Seguendo questo protocollo, due piatti 6 pozzetti sono placcati con un totale di 1,68 milioni di hESC (140.000 cellule per pozzetto), che produce circa 2,5 milioni di miociti dopo differenziazione per 20 giorni e l&#39;ordinamento, abbastanza per fare sei tessuti definiti.

<table><tbody><tr><td>Coltura cellulare</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>Preparare un stock da 2,5 mg/ml in DMSO e sterilizzare con filtro</td></tr><tr><td>B27 con Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>17505055</td><td></td></tr><tr><td>B27 senza insulina</td><td>Life Technologies</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Crea 6 &mu; M stocca, quindi aliquotare e conservare a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>H7 Cellule staminali embrionali umane</td><td>WiCell</td><td>WA07</td><td></td></tr><tr><td>hESC Matrice qualificata, Corning Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>scongelare su ghiaccio a 4 &deg; C pernottamento poi aliquota 150 &mu; l in provette separate e conservare a -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0161</td><td>Crea 10 mM di azioni e aliquota. Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Siero neonatale per vitelli</td><td>Life Technologies</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione non enzimatica: Reagente di dissociazione cellulare delicato</td><td>Tecnologie per le cellule staminali</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Conservare in frigorifero</td></tr><tr><td>Y-27632 (inibitore ROCK)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Risospendere a una concentrazione di 10 mM, aliquotare e conservare a -20&nbsp; &deg;C. Evitare cicli di gelo e disgelo.</td></tr><tr><td>Cell Sorting</strong</td><td>>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>CD90-FITC</td><td>BioLegend</td><td>328107</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione enzimatica: Kit di distacco cellulare I (0,04% tripsina/ 0,03% EDTA, soluzione di neutralizzazione della tripsina e soluzione salina tamponata di Hanks)&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-41200</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Atlanta</td><td>Biologics</td><td>S11250</td><td></td></tr><tr><td>SIRP&alpha;-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>323807</td><td></td></tr><tr><td>Costruzione dei tessuti</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>0.25% Tripsina/0.1% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-053-CI</td><td>Opzionale: Per la raccolta di cellule supplementari di interesse</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0275-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x pacchetti PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Collagene, Bovino Tipo I</td><td>Life Technologies</td><td>A10644-01</td><td>Tenere sul ghiaccio</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagles modificato medio (DMEM), alto glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>polidimetilsilossano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>1,5 ml provette per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0536757</td><td></td></tr><tr><td>15 ml provetta per centrifuga in polipropilene</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>5 ml in polistirene Tubo a fondo tondo</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Con 35 &mu integrato; Filtro cellulare M</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra trattata per colture tissutali a fondo piatto a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare, monouso</td><td>Biologix</td><td>70-2180</td><td></td></tr><tr><td>Polisulfone</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Politetrafluoroetilene (Teflon)</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ-61</td><td>O simile, deve avere un supporto per la fotocamera ad alta velocità da collegare</td></tr> Sistema <tr><td>di stimolazione elettrica</td><td>Astro-Med, Inc</td><td>Grass S88X Stimolatore</td><td></td></tr><tr><td>ad alta velocità Fotocamera</td><td>Pixelink</td><td>PL-B741U</td><td>O simile, ma deve essere in grado di raggiungere i 100 fotogrammi al secondo per un'acquisizione accurata dei dati</td></tr><tr><td>Controllo della temperatura</td><td></td><td></td> della lastra <td>Utilizzato per mantenere la temperatura del supporto durante l'acquisizione dei dati.</td></tr><tr><td>Custom Materials</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>LabView Post-tracking Program</td><td></td><td></td><td>disponibile su richiesta agli autori</td></tr></tbody></table>

costruzione di engineered definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

L'ingegneria del tessuto cardiaco umano può avere un impatto fondamentale sulla scoperta terapeutica attraverso lo sviluppo di nuovi sistemi di screening specie-specifici che replicano la biofedeltà del miocardio umano nativo tridimensionale, consentendo anche un livello controllato di complessità biologica e consentendo il monitoraggio longitudinale non distruttivo della funzione contrattile dei tessuti. Inizialmente, i tessuti cardiaci ingegnerizzati umani (hECT) sono stati creati utilizzando l'intera popolazione cellulare ottenuta dalla differenziazione diretta di cellule staminali pluripotenti umane, che in genere producevano meno del 50% di cardiomiociti. Tuttavia, per creare modelli predittivi affidabili del miocardio umano e per chiarire i meccanismi di interazione eterocellulare, è essenziale controllare accuratamente la composizione biologica nei tessuti ingegnerizzati. 
Per risolvere questo problema, utilizziamo lo smistamento delle cellule vive per il marcatore di superficie cardiaca SIRPα e il marcatore di fibroblasti CD90 per creare tessuti contenenti un rapporto 3:1 di questi tipi di cellule, rispettivamente, che vengono poi mescolati insieme e aggiunti a una soluzione di matrice a base di collagene. Gli hECT risultanti sono, quindi, completamente definiti sia nella loro composizione di matrice cellulare che extracellulare.
Qui descriviamo la costruzione di hECT definite come un sistema modello per comprendere i meccanismi delle interazioni cellula-cellula nelle terapie cellulari, utilizzando un esempio di cellule staminali mesenchimali (hMSC) derivate dal midollo osseo umano che sono attualmente utilizzate in studi clinici sull'uomo. La composizione tissutale definita è fondamentale per capire come le hMSC possono interagire con i tipi di cellule cardiache endogene per migliorare la funzione tissutale. Viene anche descritto un sistema di bioreattore che coltiva simultaneamente sei hECT in parallelo, consentendo un uso più efficiente delle cellule dopo la selezione.

Per ottenere miociti cardiaci, una versione leggermente modificata dei metodi di differenziazione Boheler e Lian viene utilizzata 30,31. È indispensabile che la differenziazione inizia durante il log-fase di crescita delle cellule, ma anche che la popolazione di partenza è sufficientemente confluenti di ottenere un numero utilizzabile di celle dopo ordinamento (circa il 75% è ottimale). Tipicamente, per H7 hESCs, placcatura con una densità di 140.000 hESC per pozzetto di un piatto 6 pozzetti in essenziali 8 m...

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione cellulare definita. Questo metodo può affrontare sfide fondamentali nel campo dell'ingegneria dei tessuti cardiaci, inclusi il controllo della variabilità e delle efficienze di differenziazione cardiaca e la comprensione di come specifici tipi cellulari influenzino la funzione contrattile cardiaca. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il risultato finale consiste in tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione controllata e definita.Le replicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiache poiché tessuti definiti possono fornire una piattaforma innovativa, biologicamente rilevante e di screening biomedico in grado di valutare interventi terapeutici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su nuovi approcci terapeutici cardiaci, il sistema di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano può essere utilizzato anche per comprendere i meccanismi della terapia cellulare cardiaca. A partire da colture di cardiomiociti derivati da cellule staminali embrionali umane, lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA 0,04%.Incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Durante l'incubazione delle cellule, aggiungere 12 microlitri di inibitore ROCK a sei millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina. Rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere un millilitro di soluzione di neutralizzazione in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti.Trasferire tutte le cellule da ciascuna pozzetta in un unico tubo da centrifuga da 15 millilitri. Lavare tutte e sei le pozzette con un volume di tre millilitri di PBS e combinare questo lavaggio con le cellule nel tubo. Centrifugare il tubo a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per formare il pellet cellulare.Per preparare le cellule per l'ordinamento di cellule vive mediante FACS, preparare il buffer di marcatura aggiungendo cinque millilitri di FBS e 50 microlitri di inibitore ROCK a 45 millilitri di PBS su ghiaccio. Rimuovere il soprannatante dalle cellule pellettizzate e risospendere in 1,2 millilitri di buffer di marcatura. Trasferire 200 microlitri delle cellule sospese in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri preraffreddato su ghiaccio.Successivamente, trasferire l'ultimo millilitro della sospensione cellulare in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri preraffreddato, posto sul ghiaccio, e aggiungere due microlitri di anticorpi SIRP alpha-PE/Cy7 e quattro microlitri di anticorpi CD90-FITC. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta trasferibile e posizionare il tubo sul ghiaccio. Incubare i due tubi da 50 millilitri contenenti il controllo negativo e il campione su un agitatore rotante posto sul ghiaccio a quattro gradi Celsius per un'ora.Mentre le cellule sono in incubazione, trasferire tre millilitri di mezzo di differenziamento due in ognuna di due provette da centrifuga da 15 millilitri. Quindi aggiungere tre microlitri di inibitore ROCK e conservare queste provette per la raccolta FACS in ghiaccio prima dell'uso. Successivamente, pellettare le cellule colorate a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.E lavarli due volte con 10 millilitri di PBS ghiacciato. Risospendere delicatamente il pellet del campione con uno-tre millilitri di buffer di marcatura contenente DAPI. Aggiungere 500 microlitri di buffer di marcatura senza DAPI al pellet del controllo negativo.Filtrare entrambe le sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati cellulari, quindi trasferirle in provette FACS in polistirene su ghiaccio. Portare immediatamente i campioni al citofluorimetro. Partendo dal campione di controllo per la colorazione negativa, impostare i parametri di gating.Quindi, durante l'analisi delle cellule campione, selezionare la popolazione di cellule vitali negative per DAPI. Raccogliere separatamente le popolazioni di cellule positive per FITC e positive per PE/Cy7 a 20 PSI. Dopo la coltura e la reaggregazione delle cellule, come indicato nel protocollo testuale, rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e trasferire il mezzo in un tubo da centrifuga da 50 millilitri.Lavare le piastre con tre millilitri di PBS e trasferire il lavaggio nello stesso tubo da centrifuga da 50 millilitri. Quindi aggiungere tre millilitri di tripsina-EDTA 0,04% alle piastre e incubare a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Dopo cinque minuti, esaminare le piastre per verificare il distacco cellulare utilizzando un microscopio.Una volta che tutte le cellule si sono staccate, aggiungere tre millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina alle piastre. Mescolare delicatamente e trasferire le cellule nel tubo centrifugo originale da 50 millilitri. Lavare le piastre con cinque millilitri di PBS e aggiungere anche questo lavaggio al tubo.Centrifugare le cellule a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di siero bovino neonatale, o mezzo NBS. Successivamente, trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare le cellule a 300 × g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il soprannatante. Per iniziare la produzione dei sei tessuti cardiaci ingegnerizzati, diluire 60,0 µL della soluzione madre di collagene a 5 mg/mL fino a 3,125 mg/mL aggiungendo 1,5 µL di idrossido di sodio 1 M, 9,6 µL di PBS 10X e 24,9 µL di acqua sterile ultrapura. In questa fase, è fondamentale evitare l’introduzione di bolle d’aria nella miscela di collagene, poiché le bolle si liberano lentamente dalla soluzione viscosa e possono interferire con la formazione del tessuto durante la compattazione tissutale.Aggiungere lungo la parete del tubo da 15 millilitri 12,0 microlitri di ciascuno di MEM 10X e 0,2 normal heaps a pH 9 per diluire la miscela di collagene. Quindi aggiungere la matrice della membrana basale alla miscela di collagene fino a una concentrazione finale di 0,9 milligrammi per millilitro e mescolare delicatamente. Conservare questa miscela tissutale finale sul ghiaccio.Successivamente, trasferire l'intera miscela di tessuto nel pellet cellulare e aggiungere le cellule supplementari come indicato nel protocollo testuale. Portare il volume finale a 150 microlitri con mezzo NBS privo di cellule e mescolare delicatamente. Pipettare con attenzione 25 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle sei pozzette della piastra di base del biorreattore.Ripetere la procedura di mescolamento tra ogni pozzetto per risospendere le cellule che potrebbero essersi depositate. Pipettare un solo tessuto per pozzetto alla volta per garantire un volume costante e un numero di cellule uniforme per ogni tessuto. A parte, inserire due file di sensori di forza in polidimetilsilossano, o PDMS, su entrambi i lati della struttura in polisolfone, formando sei coppie di perni opposti.Rovesciare la struttura sulla piastra di base in modo che una coppia di perni entri in ciascun pozzetto contenente la sospensione cellulare. Successivamente, posizionare il bioreattore in una piastra da 60 millimetri e inserire tale piastra, senza coperchio, all'interno di una piastra da 10 centimetri. Mettere il coperchio sulla piastra da 10 centimetri e trasferire l'intero assemblaggio del bioreattore nell'incubatrice per colture cellulari.Dopo due ore di incubazione, rimuovere l'assiemblea del biorreattore e aggiungere 14 millilitri di mezzo NBS per coprire la piastra di base. Riposizionare il biorreattore nell'incubatore per colture cellulari e sostituire metà del mezzo ogni giorno. Dopo 48 ore, rimuovere delicatamente la piastra di base di pochi millimetri alla volta.Quindi reinserire il bioreattore con il tessuto rivolto verso il basso nel mezzo di coltura. Se un tessuto dovesse staccarsi da un perno durante la rimozione della piastra di base, riattaccarlo delicatamente al perno. La differenziazione delle cellule staminali embrionali umane dà origine a una coltura mista composta principalmente da cardiomiociti e fibroblasti, che si auto-organizzano in aggregati e formano reti contrattili fortemente attive in tutta la piastra.Il sorting tramite FACS di queste colture ha rivelato che questo metodo di differenziamento produce una popolazione che contiene almeno il 65% di cellule positive per SIRP alpha e il 10% di cellule positive per CD90. Dopo la rimozione della piastra di base, i tessuti cardiaci ingegnerizzati umani, o HECTs, vengono lasciati autorganizzarsi all'interno del bioricettore. I HECTs maturi e compatti deflettono visibilmente i supporti integrati di rilevamento della forza con una forza media compresa tra cinque e 15 micronewton. Le misurazioni della forza di contrazione rivelano come variabili isolate modifichino la forza contrattile in questi tessuti ingegnerizzati definiti. In questo caso, quando ai tessuti viene aggiunto il 10% di cellule staminali mesenchimali umane, si osserva un notevole aumento della forza contrattile sia alla frequenza di stimolazione di uno hertz che di due hertz. Una volta acquisita padronanza della tecnica, la differenziazione richiederà circa 20 giorni, il sorting cellulare circa cinque ore e la costruzione del tessuto circa tre ore.Saranno necessari altri sette giorni per una corretta formazione del tessuto dopo la costruzione. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, tra cui l'etichettatura cellulare e il completamento della miscela tessutale, al fine di rispondere ad ulteriori domande sugli effetti di specifiche interazioni cellula-cellula o per determinare i meccanismi della terapia cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione cellulare nota e controllata.

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Bioingegneria

La generazione di allineato tessuto miocardico è un requisito fondamentale per adattare i recenti progressi nel campo della biologia delle cellule staminali a fini clinicamente utili. Qui si descrive un metodo di stampa per microcontatto il controllo preciso di forma e funzione cellulare. Utilizzo di popolazioni altamente purificate di cellule staminali embrionali derivate progenitori cardiaci, abbiamo quindi generare anisotropo tessuto funzionale del miocardio.

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Qui mostriamo la generazione di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC) -derived cardiomiociti. Presentiamo un metodo per analizzare forza di contrazione e l'alterazione esemplare del modello di contrazione dal hERG inibitore canale E-4031. Questo metodo mostra elevato livello di resistenza e affidabilità screening di farmaci cardiaco.

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Questo protocollo descrive un metodo basato su stampo netto per creare tessuti cardiaci senza impalcatura tridimensionale con soddisfacente integrità strutturale e comportamento sincrono pestaggio.

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

Questo protocollo descrive la procedura per sezionare e coltivare fette cardiache umane per test preclinici sui farmaci e descrive in dettaglio l'uso della mappatura ottica per la registrazione simultanea della tensione transmembrana e dei segnali di calcio intracellulare da queste fette.

Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.

Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Questo protocollo mira a fabbricare sferoidi cardiaci 3D (CS) co-coltivando cellule in gocce appese. I CS incorporati nel collagene vengono trattati con doxorubicina (DOX, un agente cardiotossico) a concentrazioni fisiologiche per modellare l'insufficienza cardiaca. I test in vitro che utilizzano CS trattati con DOX possono essere utilizzati per identificare nuove terapie per i pazienti con insufficienza cardiaca.

Sferoidi cardiaci come tessuti cardiaci bioingegnerati in vitro per studiare la fisiopatologia del cuore umano

L'obiettivo di questo protocollo è spiegare e dimostrare lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale (3D) di tessuto cardiaco umano altamente allineato, composto da cardiomiociti derivati da cellule staminali co-coltivati con fibroblasti cardiaci (FF) all'interno di un idrogel biomimetico a base di collagene, per applicazioni nell'ingegneria dei tessuti cardiaci, nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.

Sviluppo di tessuto cardiaco umano organizzato in 3D all'interno di una piattaforma microfluidico

Qui viene presentato un insieme di protocolli per la generazione e la crioconservazione di sferoidi cardiaci (CS) da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo coltivati in un formato multidimensionale ad alto rendimento. Questo modello tridimensionale funziona come una solida piattaforma per la modellazione delle malattie, gli screening ad alto rendimento e mantiene la sua funzionalità dopo la crioconservazione.

Generazione, screening ad alto rendimento e biobanca di sferoidi cardiaci derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l'analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Progettazione di un bioreattore per migliorare l'acquisizione dei dati e modellare la produttività dei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Viene presentato un metodo riproducibile per generare tessuti miocardici 3D combinando scaffold di scrittura elettrofilante (MEW), policaprolattone (PCL) e idrogel di fibrina con cardiomiociti e fibroblasti derivati da hiPSC. Questa tecnica offre un controllo preciso sull'architettura dello scaffold e può essere applicata nei test preclinici sui farmaci e nella modellazione delle malattie cardiache.

Generazione 3D di tessuto miocardico umano mediante scrittura di elettrofilatura per fusione di scaffold di policaprolattone e cellule cardiache derivate da hiPSC

Impara a creare tessuti cardiaci umani ingegnerizzati con composizione cellulare definita mediante marcatori di superficie e FACS. Questo metodo consente di studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca in modelli controllati.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

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