Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare tessuti cardiaci ingegnerizzati umani di una composizione cellulare definita. Questo metodo può affrontare le sfide chiave nel campo dell'ingegneria del tessuto cardiaco, tra cui il controllo della variabilità e dell'efficienza della differenziazione cardiaca e la comprensione di come specifici tipi di cellule influiscono sulla funzione contrattile cardiaca. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il risultato finale è un tessuto cardiaco umano ingegnerizzato di una composizione controllata e definita.

Le repliche di questa tecnica si estendono alla terapia per le malattie cardiache perché i tessuti definiti possono fornire una nuova piattaforma di screening biomedica biologicamente rilevante in grado di valutare gli interventi terapeutici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su nuove terapie cardiache, il sistema di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano può anche essere utilizzato per comprendere i meccanismi della terapia cellulare cardiaca. Iniziando con colture di cardiomiociti derivate da cellule staminali embrionali umane, lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA allo 0,04%.

Incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Quando le cellule sono in incubazione, aggiungere 12 microlitri di inibitore ROCK a sei millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina. Rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere un millilitro di soluzione neutralizzante a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti.

Trasferire tutte le cellule di ciascun pozzetto in un'unica provetta da centrifuga da 15 millilitri. Lavare tutti e sei i pozzetti con un volume di tre millilitri di PBS e combinare questo lavaggio con le cellule nel tubo. Centrifugare la provetta a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le cellule.

Per preparare le cellule per la selezione di cellule vive mediante FACS, preparare il tampone di colorazione aggiungendo cinque millilitri di FBS e 50 microlitri di inibitore ROCK a 45 millilitri di PBS su ghiaccio. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate e risospenderle in 1,2 millilitri di tampone di colorazione. Trasferire 200 microlitri di celle sospese in una nuova provetta da centrifuga preraffreddata da 50 millilitri su ghiaccio.

Quindi, trasferire il millilitro rimanente della sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 millilitri preraffreddata su ghiaccio e aggiungere due microlitri di SIRP alfa-PE/Cy7 e quattro microlitri di anticorpi CD90-FITC. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta di trasferimento e posizionare la provetta sul ghiaccio. Incubare le due provette da 50 millilitri contenenti il controllo negativo e il campione su un agitatore a bilanciere su ghiaccio a quattro gradi Celsius per un'ora.

Mentre le cellule sono in incubazione, trasferire tre millilitri di terreno di differenziazione due su ciascuna delle due provette da centrifuga da 15 millilitri. Quindi aggiungere tre microlitri di inibitore ROCK e conservare queste provette di raccolta FACS sul ghiaccio prima dell'uso. Quindi, pellettare le celle colorate a 300 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

E lavateli due volte con 10 millilitri di PBS ghiacciato. Risospendere delicatamente il pellet del campione con uno o tre millilitri di tampone di colorazione contenente DAPI. Aggiungere 500 microlitri di tampone colorante senza DAPI al pellet di controllo negativo.

Filtrare entrambe le sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere i grumi cellulari, quindi trasferirle in provette FACS di polistirene su ghiaccio. Portare immediatamente i campioni al selezionatore di cellule. Iniziando con il campione di controllo con colorazione negativa, stabilire i parametri di iniezione.

Quindi, durante l'esecuzione delle celle campione, selezionare la popolazione di cellule vive DAPI negative. Raccogliere sia le popolazioni cellulari FITC positive che quelle PE/Cy7 positive in modo indipendente a 20 PSI. Dopo aver coltivato e riaggregato le cellule, come indicato nel protocollo di testo, rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e trasferire il terreno in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Lavare le piastre con tre millilitri di PBS e trasferire il lavaggio nella stessa provetta da centrifuga da 50 millilitri. Quindi aggiungere tre millilitri di tripsina-EDTA allo 0,04% alle piastre e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo cinque minuti, esaminare le piastre per il distacco delle cellule utilizzando un microscopio.

Una volta che tutte le cellule si sono staccate, aggiungere tre millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina alle piastre. Mescolare delicatamente e trasferire le cellule nella provetta da centrifuga originale da 50 millilitri. Lavare le piastre con cinque millilitri di PBS e aggiungere anche questo lavaggio al tubo.

Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di siero bovino neonatale, o terreno NBS. Quindi, trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Pellettare le celle a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Per iniziare a generare i sei tessuti cardiaci ingegnerizzati, diluire 60,0 microlitri dei cinque milligrammi per millilitro di collagene a 3,125 milligrammi per millilitro con 1,5 microlitri di idrossido di sodio molare, 9,6 microlitri di PBS 10X e 24,9 microlitri di acqua ultra pura sterile. In questo caso, è fondamentale evitare l'introduzione di bolle d'aria nella miscela di collagene, poiché le bolle d'aria vengono rilasciate lentamente dalla soluzione viscosa e possono interferire con la formazione dei tessuti durante la compattazione dei tessuti.

Pipettare lungo il lato della provetta da 15 millilitri per aggiungere 12,0 microlitri ciascuno di 10X MEM e 0,2 cumuli normali a pH 9 per diluire la miscela di collagene. Quindi aggiungere la matrice della membrana basale alla miscela di collagene fino a una concentrazione finale di 0,9 milligrammi per millilitro e mescolare delicatamente. Conservare questa miscela finale di fazzoletti sul ghiaccio.

Successivamente, trasferire l'intera miscela di tessuto nel pellet cellulare e aggiungere cellule supplementari come indicato nel protocollo di testo. Riempire la provetta fino a un volume finale di 150 microlitri con terreno NBS privo di cellule e mescolare delicatamente. Pipettare con cura 25 microlitri di sospensione cellulare in ciascuno dei sei pozzetti della piastra di base del bioreattore.

Ripetere la procedura di miscelazione tra ogni pozzetto per risospendere eventuali cellule che potrebbero essersi depositate. Pipettare un solo tessuto alla volta per ogni pozzetto per garantire un volume e un numero di cellule costanti per tessuto. Separatamente, spingere due file di sensori di forza di polidimetilsilossano, o PDMS, su entrambi i lati del telaio in polisulfone per formare sei coppie di perni opposti.

Capovolgere il telaio sopra la piastra di base in modo che una coppia di montanti entri in ogni pozzetto contenente la sospensione della cella. Quindi posizionare il bioreattore in un piatto da 60 millimetri e posizionare quel piatto senza coperchio all'interno di un piatto da 10 centimetri. Posizionare il coperchio sul piatto da 10 centimetri e spostare l'intero gruppo del bioreattore nell'incubatore per colture tissutali.

Dopo due ore di incubazione, rimuovere il gruppo bioreattore e aggiungere 14 millilitri di terreno NBS per coprire la piastra di base. Rimetti il bioreattore nell'incubatore per colture cellulari e cambia metà del terreno ogni giorno. Trascorse le 48 ore, rimuovere delicatamente la piastra di base pochi millimetri alla volta.

Quindi riposizionare il bioreattore con il tessuto rivolto verso il basso verso il fluido. Se un fazzoletto cade da un perno durante la rimozione della piastra di base, riattaccare delicatamente il fazzoletto al perno. La differenziazione delle cellule staminali embrionali umane si traduce in una coltura mista di cardiomiociti e fibroblasti che si auto-organizzano in cluster e formano robuste ragnatele in tutta la piastra.

Lo smistamento FACS di queste colture ha rivelato che questo metodo di differenziazione si traduce in una popolazione che contiene almeno il 65% di cellule SIRP alfa positive e il 10% di cellule CD90 positive. Dopo aver rimosso la piastra di base, i tessuti cardiaci ingegnerizzati umani, o HECT, possono autoassemblarsi all'interno del bioreattore. Gli HECT maturi e compattati deviano visibilmente i perni di rilevamento della forza integrati con una media da cinque a 15 micronewton di forza.

Le misurazioni della forza di contrazione rivelano come le variabili isolate alterino la forza contrattile in questi tessuti ingegnerizzati definiti. Qui, quando i tessuti sono integrati con il 10% di cellule staminali mesenchimali umane, si osserva un sostanziale aumento della forza contrattile sia alla frequenza di stimolazione di un hertz che a quella di due hertz. Una volta padroneggiata, la differenziazione richiederà circa 20 giorni, lo smistamento cellulare circa cinque ore e la costruzione del tessuto circa tre ore.

Saranno necessari altri sette giorni per la corretta formazione dei tessuti dopo la costruzione. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, tra cui la marcatura cellulare e l'integrazione della miscela di tessuti, al fine di rispondere a ulteriori domande riguardanti gli effetti di specifiche interazioni cellula-cellula o per determinare i meccanismi della terapia cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione cellulare nota e controllata.