Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

L'obiettivo generale di questa procedura è creare tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione cellulare definita. Questo metodo può affrontare sfide fondamentali nel campo dell'ingegneria dei tessuti cardiaci, inclusi il controllo della variabilità e delle efficienze di differenziazione cardiaca e la comprensione di come specifici tipi cellulari influenzino la funzione contrattile cardiaca. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il risultato finale consiste in tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione controllata e definita.

Le replicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie cardiache poiché tessuti definiti possono fornire una piattaforma innovativa, biologicamente rilevante e di screening biomedico in grado di valutare interventi terapeutici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su nuovi approcci terapeutici cardiaci, il sistema di tessuto cardiaco ingegnerizzato umano può essere utilizzato anche per comprendere i meccanismi della terapia cellulare cardiaca. A partire da colture di cardiomiociti derivati da cellule staminali embrionali umane, lavare le cellule una volta con PBS e aggiungere un millilitro di tripsina-EDTA 0,04%.

Incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Durante l'incubazione delle cellule, aggiungere 12 microlitri di inibitore ROCK a sei millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina. Rimuovere le piastre dall'incubatore e aggiungere un millilitro di soluzione di neutralizzazione in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti.

Trasferire tutte le cellule da ciascuna pozzetta in un unico tubo da centrifuga da 15 millilitri. Lavare tutte e sei le pozzette con un volume di tre millilitri di PBS e combinare questo lavaggio con le cellule nel tubo. Centrifugare il tubo a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per formare il pellet cellulare.

Per preparare le cellule per l'ordinamento di cellule vive mediante FACS, preparare il buffer di marcatura aggiungendo cinque millilitri di FBS e 50 microlitri di inibitore ROCK a 45 millilitri di PBS su ghiaccio. Rimuovere il soprannatante dalle cellule pellettizzate e risospendere in 1,2 millilitri di buffer di marcatura. Trasferire 200 microlitri delle cellule sospese in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri preraffreddato su ghiaccio.

Successivamente, trasferire l'ultimo millilitro della sospensione cellulare in un nuovo tubo da centrifuga da 50 millilitri preraffreddato, posto sul ghiaccio, e aggiungere due microlitri di anticorpi SIRP alpha-PE/Cy7 e quattro microlitri di anticorpi CD90-FITC. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con una pipetta trasferibile e posizionare il tubo sul ghiaccio. Incubare i due tubi da 50 millilitri contenenti il controllo negativo e il campione su un agitatore rotante posto sul ghiaccio a quattro gradi Celsius per un'ora.

Mentre le cellule sono in incubazione, trasferire tre millilitri di mezzo di differenziamento due in ognuna di due provette da centrifuga da 15 millilitri. Quindi aggiungere tre microlitri di inibitore ROCK e conservare queste provette per la raccolta FACS in ghiaccio prima dell'uso. Successivamente, pellettare le cellule colorate a 300 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

E lavarli due volte con 10 millilitri di PBS ghiacciato. Risospendere delicatamente il pellet del campione con uno-tre millilitri di buffer di marcatura contenente DAPI. Aggiungere 500 microlitri di buffer di marcatura senza DAPI al pellet del controllo negativo.

Filtrare entrambe le sospensioni cellulari attraverso un filtro cellulare da 40 micron per rimuovere gli aggregati cellulari, quindi trasferirle in provette FACS in polistirene su ghiaccio. Portare immediatamente i campioni al citofluorimetro. Partendo dal campione di controllo per la colorazione negativa, impostare i parametri di gating.

Quindi, durante l'analisi delle cellule campione, selezionare la popolazione di cellule vitali negative per DAPI. Raccogliere separatamente le popolazioni di cellule positive per FITC e positive per PE/Cy7 a 20 PSI. Dopo la coltura e la reaggregazione delle cellule, come indicato nel protocollo testuale, rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e trasferire il mezzo in un tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Lavare le piastre con tre millilitri di PBS e trasferire il lavaggio nello stesso tubo da centrifuga da 50 millilitri. Quindi aggiungere tre millilitri di tripsina-EDTA 0,04% alle piastre e incubare a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Dopo cinque minuti, esaminare le piastre per verificare il distacco cellulare utilizzando un microscopio.

Una volta che tutte le cellule si sono staccate, aggiungere tre millilitri di soluzione di neutralizzazione della tripsina alle piastre. Mescolare delicatamente e trasferire le cellule nel tubo centrifugo originale da 50 millilitri. Lavare le piastre con cinque millilitri di PBS e aggiungere anche questo lavaggio al tubo.

Centrifugare le cellule a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di siero bovino neonatale, o mezzo NBS. Successivamente, trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare le cellule a 300 × g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il soprannatante. Per iniziare la produzione dei sei tessuti cardiaci ingegnerizzati, diluire 60,0 µL della soluzione madre di collagene a 5 mg/mL fino a 3,125 mg/mL aggiungendo 1,5 µL di idrossido di sodio 1 M, 9,6 µL di PBS 10X e 24,9 µL di acqua sterile ultrapura. In questa fase, è fondamentale evitare l’introduzione di bolle d’aria nella miscela di collagene, poiché le bolle si liberano lentamente dalla soluzione viscosa e possono interferire con la formazione del tessuto durante la compattazione tissutale.

Aggiungere lungo la parete del tubo da 15 millilitri 12,0 microlitri di ciascuno di MEM 10X e 0,2 normal heaps a pH 9 per diluire la miscela di collagene. Quindi aggiungere la matrice della membrana basale alla miscela di collagene fino a una concentrazione finale di 0,9 milligrammi per millilitro e mescolare delicatamente. Conservare questa miscela tissutale finale sul ghiaccio.

Successivamente, trasferire l'intera miscela di tessuto nel pellet cellulare e aggiungere le cellule supplementari come indicato nel protocollo testuale. Portare il volume finale a 150 microlitri con mezzo NBS privo di cellule e mescolare delicatamente. Pipettare con attenzione 25 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle sei pozzette della piastra di base del biorreattore.

Ripetere la procedura di mescolamento tra ogni pozzetto per risospendere le cellule che potrebbero essersi depositate. Pipettare un solo tessuto per pozzetto alla volta per garantire un volume costante e un numero di cellule uniforme per ogni tessuto. A parte, inserire due file di sensori di forza in polidimetilsilossano, o PDMS, su entrambi i lati della struttura in polisolfone, formando sei coppie di perni opposti.

Rovesciare la struttura sulla piastra di base in modo che una coppia di perni entri in ciascun pozzetto contenente la sospensione cellulare. Successivamente, posizionare il bioreattore in una piastra da 60 millimetri e inserire tale piastra, senza coperchio, all'interno di una piastra da 10 centimetri. Mettere il coperchio sulla piastra da 10 centimetri e trasferire l'intero assemblaggio del bioreattore nell'incubatrice per colture cellulari.

Dopo due ore di incubazione, rimuovere l'assiemblea del biorreattore e aggiungere 14 millilitri di mezzo NBS per coprire la piastra di base. Riposizionare il biorreattore nell'incubatore per colture cellulari e sostituire metà del mezzo ogni giorno. Dopo 48 ore, rimuovere delicatamente la piastra di base di pochi millimetri alla volta.

Quindi reinserire il bioreattore con il tessuto rivolto verso il basso nel mezzo di coltura. Se un tessuto dovesse staccarsi da un perno durante la rimozione della piastra di base, riattaccarlo delicatamente al perno. La differenziazione delle cellule staminali embrionali umane dà origine a una coltura mista composta principalmente da cardiomiociti e fibroblasti, che si auto-organizzano in aggregati e formano reti contrattili fortemente attive in tutta la piastra.

Il sorting tramite FACS di queste colture ha rivelato che questo metodo di differenziamento produce una popolazione che contiene almeno il 65% di cellule positive per SIRP alpha e il 10% di cellule positive per CD90. Dopo la rimozione della piastra di base, i tessuti cardiaci ingegnerizzati umani, o HECTs, vengono lasciati autorganizzarsi all'interno del bioricettore. I HECTs maturi e compatti deflettono visibilmente i supporti integrati di rilevamento della forza con una forza media compresa tra cinque e 15 micronewton.

Le misurazioni della forza di contrazione rivelano come variabili isolate modifichino la forza contrattile in questi tessuti ingegnerizzati definiti. In questo caso, quando ai tessuti viene aggiunto il 10% di cellule staminali mesenchimali umane, si osserva un notevole aumento della forza contrattile sia alla frequenza di stimolazione di uno hertz che di due hertz. Una volta acquisita padronanza della tecnica, la differenziazione richiederà circa 20 giorni, il sorting cellulare circa cinque ore e la costruzione del tessuto circa tre ore.

Saranno necessari altri sette giorni per una corretta formazione del tessuto dopo la costruzione. Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, tra cui l'etichettatura cellulare e il completamento della miscela tessutale, al fine di rispondere ad ulteriori domande sugli effetti di specifiche interazioni cellula-cellula o per determinare i meccanismi della terapia cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come creare tessuti cardiaci ingegnerizzati umani con una composizione cellulare nota e controllata.