Progettazione di un bioreattore per migliorare l'acquisizione dei dati e modellare la produttività dei tessuti cardiaci ingegnerizzati

I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l'analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Il nostro modello in vitro del muscolo cardiaco umano derivato da cellule staminali tridimensionali migliora la biofedeltà della tradizionale coltura cellulare bidimensionale, eliminando al contempo le differenze interspecie associate ai test sugli animali da laboratorio. Il nostro design del bioreattore multi-tessuto con tracciatori di post stabili massimizza il successo dei tessuti e migliora l'accuratezza della caratterizzazione approfondita della funzione del tessuto cardiaco ingegnerizzato. Poiché l'insufficienza cardiaca continua a essere la principale causa di morte in tutto il mondo, i nostri tessuti cardiaci ingegnerizzati consentono ai ricercatori di modellare le malattie cardiache umane e di esaminare potenziali terapie.

Per iniziare, posizionare quattro fusioni master in alluminio nel supporto per gesso in modo che i fori dei pali siano allineati con lo spazio morto opposto ai ripiani triangolari. Posizionare l'apparecchio tra due staffe parallele e fissare i lati insieme utilizzando un pezzo rettangolare di foglio di silicone spesso 0.5 millimetri come guarnizione per evitare perdite del PDMS liquido. In un contenitore poco profondo, mescolare 0,5 millilitri di agente indurente PDMS con cinque millilitri di base elastomerica PDMS in un rapporto di uno a 10 e mescolare energicamente per cinque minuti.

Degassare la miscela PDMS in una camera a vuoto sotto forte vuoto fino a quando le bolle non scompaiono. Successivamente, versare la miscela PDMS sull'apparato di colata, riempiendo eccessivamente per garantire la copertura completa di ogni fessura. Aggiungere piccole perle di vetro colorato al corpo dei rack PDMS di fronte al lato con i montanti per l'identificazione univoca di ciascun rack.

Posizionare l'apparecchio di colata livellato orizzontalmente nella camera a vuoto sotto un forte vuoto per almeno 12 ore. Lasciare polimerizzare il PDMS a temperatura ambiente lontano dalla polvere per 48 ore per consentire la completa polimerizzazione e la massima resistenza dei perni delicati. Rimuovere il clamp, le staffe e il foglio di silicone dall'apparecchio di colata.

Utilizzando una lama di rasoio in acciaio inossidabile, tagliare la pellicola PDMS sulla parte superiore dell'apparato di fusione e dei supporti del telaio. Utilizzare le dita per separare i rack PDMS dai lati del supporto per gesso. Inserire una lama di rasoio in acciaio inossidabile smussata nello spazio morto tra il gesso e il supporto del gesso e separarli, assicurandosi che il PDMS che riempie lo spazio morto rimanga con il supporto del gesso.

Quindi, utilizzando una lama affilata in acciaio inossidabile, tagliare le pellicole PDMS rimanenti e lo spazio morto PDMS dalle punte dei perni. Usando le dita, separare lentamente il rack PDMS dal gesso sul lato opposto ai montanti. Continuate ad alternare i lati fino a quando i pali non sono liberi dai lanci master.

Liberare tutti i rack PDMS e i montanti come dimostrato in precedenza e utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare via il PDMS in eccesso rimanente dai rack. Utilizzando una stampante 3D per modellazione a deposizione fusa termoplastica, stampare i componenti dell'apparato di colata stabile post tracker, o SPoT. Garantire un fissaggio sicuro tra i pezzi stampati in 3D e tra i rack PDMS e la maschera a tre punte.

Verificare inoltre che i rack PDMS si adattino perfettamente ai montanti che raggiungono appena il fondo dei pozzetti senza essere piegati. Mescolare 0,5 millilitri di PDMS nero parte A a 0,5 millilitri di parte B in una piccola pesa o in un contenitore poco profondo fino a quando la soluzione non è di colore uniforme. Degassare il PDMS nero miscelato in una camera a vuoto sotto forte vuoto per 20 minuti.

Versare il PDMS nero degassato sulla base stampata in 3D per riempire i fori e picchiettare per assicurarsi che non rimangano bolle. Raschiare il più possibile il PDMS in eccesso dalla base. Agganciare il pezzo a tre punte alla base e posizionare i rack PDMS nelle scanalature della maschera a tre punte, assicurandosi che le estremità dei montanti si immergano nel PDMS nero nei pozzetti circolari.

Lasciare indurire il PDMS nero a temperatura ambiente lontano dalla polvere per 48 ore. Far scorrere il pezzo a tre punte, riducendo al minimo la tensione sui montanti. Usando piccole pinze, raschiare via la sottile pellicola nera PDMS che circonda ogni SPoT, quindi inserire una pinza piegata a punta fine nel pozzetto SPoT per liberarla dalla base stampata in 3D.

Ispezionare gli SPoT e tagliare la pellicola PDMS nera rimanente dal processo di fusione utilizzando forbici vannas fini. Assicurarsi che i montanti finiti siano della lunghezza corretta montando i rack PDMS sul telaio del telefono cellulare polys, quindi facendolo scorrere sulla piastra di base nera. Dopo aver sterilizzato in autoclave il bioreattore e aver preparato la miscela cellulare, procedere alla fabbricazione degli hECT.

Indossando guanti sterili, rimuovere la piastra di base nera dal sacchetto autoclavato contenente le parti del bioreattore e posizionarla in un piatto da 60 millilitri con i pozzetti rivolti verso l'alto. Pipettare lentamente 44 microlitri della miscela cellulare in ciascun pozzetto per evitare l'introduzione di bolle. Indossando un nuovo paio di guanti sterili, rimuovere il telaio in polisulfone con i rack PDMS dalla sacca dell'autoclave.

Abbassare il telaio sulla piastra di base in modo che le estremità del telaio si adattino alle scanalature all'estremità della piastra di base. Assicurandosi che i montanti siano tutti dritti e che il telaio non sia inclinato, posizionare il bioreattore in un piatto da 60 millimetri. Aggiungere un millilitro di FBS al 10% nel terreno di mantenimento dei cardiomiociti al piatto da 60 millilitri per aumentare l'umidità man mano che gli hECT si solidificano.

Posizionare il piatto senza coperchio in un piatto di alto profilo da 100 millimetri e coprirlo con un coperchio da 100 millimetri, quindi riportare il bioreattore in un incubatore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per consentire al collagene di formare un gel con le cellule in sospensione. Dopo due ore, rimuovere la capsula dall'incubatrice. Aggiungere 13 millilitri di FBS al 10% nel terreno di mantenimento dei cardiomiociti, inclinando la piastra per consentire al terreno di fluire tra la piastra di base in PTFE e i rack PDMS.

Ispezionare il bioreattore lateralmente per verificare l'assenza di bolle d'aria e rimettere il piatto nell'incubatrice. Se l'aria è intrappolata, inclinare il bioreattore fuori dal mezzo per far sì che la bolla si rompa e abbassarla di nuovo lentamente, oppure utilizzare una micropipetta con una punta di caricamento del gel per aspirare l'aria senza disturbare i perni. Ispezionare la compattazione hECT attraverso la finestra nel telaio.

Nell'arco di 24-96 ore, gli hECT si compattano e diventano opachi. Rimuovere la piastra di base quando gli hECT sono compattati di almeno il 30% rispetto al diametro originale. Riempire la capsula da 60 millimetri contenente il bioreattore con terreno di mantenimento dei cardiomiociti fino a quando il liquido non si stacca con il bordo della capsula e aggiungere 14 millilitri a una nuova capsula da 60 millimetri.

Indossando guanti sterili, capovolgere il bioreattore nella sua capsula in modo che la piastra di base sia in alto. Dopo aver ispezionato la presenza di bolle d'aria intrappolate, sollevare lentamente la piastra di base, mantenendola in piano. Assicurati che i suggerimenti per i post siano a fuoco.

Attivare l'interruttore di soglia e regolare il cursore fino a quando gli SPoT non sono ben delimitati e non cambiano forma quando l'hECT si contrae. Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare un rettangolo attorno a uno degli SPoT e fare clic sul pulsante Imposta uno all'interno della casella dei contorni del montante per impostare la posizione del rettangolo attorno allo SPoT, assicurandosi che l'SPoT rimanga sempre all'interno del contorno del rettangolo. Ripeti il processo nell'altro post e registralo sotto il secondo set.

Regolare le impostazioni delle dimensioni dell'oggetto per impedire al programma di tracciare oggetti più piccoli e assicurarsi che il numero di oggetti tracciati in ogni rettangolo rimanga costante. L'interfaccia mostra la distanza misurata tra gli oggetti tracciati in tempo reale. Utilizzare questo grafico per monitorare il rumore.

Sotto l'intestazione hertz della frequenza di stimolazione, indicare l'intervallo di frequenze desiderate e l'intervallo desiderato per il passaggio da min a max. Nelle caselle a destra, scegliere il tempo di impostazione desiderato per consentire all'hECT di adattarsi alla nuova frequenza di stimolazione, quindi specificare il tempo di registrazione e la tensione di stimolazione. Avviare il programma facendo clic sul pulsante di avvio del programma.

Dopo aver registrato i dati di una frequenza, aumentare la frequenza dello stimolatore dell'intervallo desiderato per una nuova registrazione fino a raggiungere la frequenza massima. Le immagini rappresentative degli hECT sono mostrate qui viste dal basso, create senza SPoT e con SPoT. Gli SPoT hanno fornito un'unica forma definita da tracciare durante l'acquisizione dei dati.

In alcuni casi estremi, l'oggetto di tracciamento è stato persino oscurato. Una forma più affidabile per il tracciamento ottico e la riduzione del rumore ha permesso la misurazione di tessuti deboli con una forza sviluppata di appena un micro Newton. Gli SPoT hanno fornito una geometria del cappuccio che ha impedito la perdita di hECT.

La funzione hECT misurata è risultata stabile per un tempo di coltura prolungato nell'attuale configurazione di stimolazione con il tavolino riscaldato. Rispetto alle misurazioni a temperatura fisiologica, gli hECT hanno mostrato dinamiche di contrazione alterate a temperatura ambiente, con tassi di contrazione e rilassamento più lenti. A frequenze più elevate, gli hECT tendevano ad essere più deboli a temperatura ambiente.

A frequenze più basse, gli hECT tendevano ad essere più forti a temperatura ambiente. Quando sono stati stimolati a 36 gradi Celsius, gli hECT avevano una frequenza di battimento spontaneo più elevata e una gamma più ampia di frequenze di cattura. L'ambiente a temperatura controllata garantisce la rilevanza fisiologica della funzione degli hECT misurati.

Inoltre, il bagno di terreno condiviso del bioreattore multi-tessuto facilita gli studi sulla segnalazione paracrina tra hECT di diverse composizioni cellulari. L'aggiunta di SPoT al nostro bioreattore multitissutale consente ai ricercatori di studiare in modo efficiente il miocardio malato con tensione anormalmente alta o bassa, che altrimenti scivolerebbe via dalle estremità dei perni non tappati.