Name: Contrazioni di umano-iPSC-derivato del Cardiomyocyte sincizi misurata con un colorante fluorescente Ca sensibile a temperatura controllata piastre da 384 pozzetti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per misurare gli effetti dei composti sulla frequenza di battito dei sincizi di cardiomiociti derivati da iPSC umani. Questa tecnica consente di valutare rapidamente la sicurezza farmacologica cardiaca.

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Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.

1. preparazione delle piastre di cella
Nota: Preparare le piastre della cella 3–4 settimane prima della misurazione degli effetti della droga.
<ol><li>Giorno 0 dell'esperimento Nota: ai fini della pianificazione, l'applicazione di composti di prova può essere eseguita in qualsiasi giorno tra giorni 22–28 dell'esperimento.<ol>
<li>Girare in bagnomaria a 37 ° C e caldo 40 mL di terreno di placcatura (come fornito dal produttore). Nota: Utilizzare le celle con i media di coltura e manutenzione corrispondenti fornito dal fornitore.</li>
		<li>Scongelare i hiPSC-CM posizionando le provette per criogenia contenenti cellule congelate nel bagno d'acqua per 2 min.</li>
		<li>Trasferire le sospensioni di cellule 1ml attentamente una provetta conica da 50 mL.</li>
		<li>Lavare ogni stoccaggio provette criogenia con 1 mL di medium caldo placcatura per recuperare le cellule rimanenti e aggiungere il supporto di lavare lo stesso tubo conico da contenenti celle passo 1.1.3.</li>
		<li>Mescolare con cura un altro 8 mL di medium caldo placcatura in sospensione delle cellule.</li>
		<li>Contare celle in tensione utilizzando il metodo di esclusione del blu di trypan e un hematocytometer8. Nota: il requisito di 6 x 106 celle per una piastra 384 pozzetti considera la possibilità di fino a 20% di cellule morte tra le cellule congelate, che è un massimo nella nostra esperienza.</li>
		<li>Regolare la sospensione cellulare a 5 x 105 live cellule/mL con il mezzo di placcatura caldo.</li>
		<li>Distribuire la sospensione cellulare in due piastre da 384 pozzetti cella aggiungendo 25 µ l in ogni pozzetto (circa 12.500 cellule per pozzetto). Nota: Le piastre di cella non è necessario essere sensibilizzati con qualsiasi matrice (Vedi discussione).</li>
		<li>Mantenere le piastre di cella a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 ° giorno dell'esperimento<ol>
<li>Girare in bagnomaria a 37 ° C e caldo 50 mL di mezzo di manutenzione completato con soluzione di 1% v/v penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Sostituire il mezzo di placcatura con 50 µ l di terreno di mantenimento caldo in tutti i pozzetti delle piastre cell.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Giorni 2–21 (fino a giorno 27) dell'esperimento Nota: hiPSC-CMs non è necessario alcun passaggio in questo periodo, come sono divisione cellule.<ol>
<li>Rinnovare la metà del mezzo manutenzione ogni 2–3 giorni e rinnovarlo completamente nei giorni 7, 14 e 21. Nota: La misura di fluorescenza può essere eseguita tra i giorni 22 e 28 dell'esperimento. Le durate più lunghe non sono state provate, ma possono ancora andare bene.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione dello strumento, piatti composti e piastre di dosaggio
Nota: preparare la strumento, piatti composti e piastre di analisi il giorno della misurazione degli effetti della droga, tra i giorni 22 e 28 dell'esperimento. Utilizzare un lettore di piastra fluorescente dotato di controllo della temperatura e una luce di eccitazione e kit filtro di fluorescenza fonte. Ad esempio, utilizzare un kit filtro di Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescenza (eccitazione: 472 nm; emissione: 520–560 nm) e un'unità di sorgente luminosa di eccitazione W 150.
<ol><li>Almeno 2 h prima che il primo piatto di cella deve essere inserito all'interno del lettore di piastra per la misurazione, accendere il lettore e impostare il sistema di riscaldamento a 37 ° C. Nota: questo può anche essere fatto la sera prima.</li>
	<li>Preparare i controlli positivi, forskolin, N6-ciclopentil-adenosina ed E-4031 come soluzioni di riserva di 0,33 mM in DMSO, 10 mM in DMSO e 3,33 mM di H2O, rispettivamente. Nota: soluzioni Stock saranno diluiti 333-fold con il tempo vengono aggiunti alle cellule, e l'obiettivo è quello di ottenere concentrazioni di prova finale di 1 µM forskolin, 30 µM N6-ciclopentil-adenosina e 10 µM E-4031, che producono effetti affidabili e riproducibili.</li>
	<li>Preparare i 352 composti di prova come soluzioni di riserva di DMSO a 333-fold le concentrazioni di prova prevista (ad esempio, 10 mM per un test a 30 µM). Nota: L'obiettivo è di raggiungere una concentrazione finale di 0.3% (v/v) DMSO nella piastra di cella dopo l'applicazione di composto; Questa è la più alta concentrazione di DMSO che non riguarda l'attività ritmica dei cardiomiociti. Le soluzioni di riserva possono anche essere preparate il giorno prima. Un minimo di 5 µ l di soluzione di riserva è necessario per ogni misurazione duplicati.</li>
	<li>Preparare i piatti composti.<ol>
<li>Caldo 40 mL di mezzo di manutenzione completato con soluzione di penicillina-streptomicina 1% v/v a temperatura ambiente.</li>
		<li>Distribuire in due piastre 384 pozzetti composti aggiungendo 1,5 µ l di soluzione madre per pozzetto: i) le sostanze da testare (due pozzetti ciascuna), ii) i controlli positivi (forskolin, N6-ciclopentil-adenosina ed E-4031, quattro pozzetti ciascuna per piastra composto) e iii) il negativo controllo (DMSO, 20 pozzi per piastra composto).</li>
		<li>Centrifugare le piastre composte a 100 x g per 1 min.</li>
		<li>Aggiungere 37 µ l di terreno di mantenimento a temperatura ambiente in ogni pozzetto (3,9% DMSO a 38,5 µ l in quella fase).</li>
		<li>Centrifugare le piastre composte a 100 x g per 1 min.</li>
		<li>Caricare i piatti composti nel lettore della piastra. Nota: I prossimi passi dovrebbero essere eseguiti appena possibile per minimizzare evaporazione nei piatti composti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il colorante fluorescente.<ol>
<li>Girare in bagnomaria a 37 ° C e caldo 100 mL di mezzo di manutenzione completato con soluzione di 1% v/v penicillina-streptomicina.</li>
		<li>Ricostituire il colorante fluorescente Ca-sensibile e quencher con 10 mL di mezzo di mantenimento caldo con gli antibiotici. Nota: questo mezzo di fluorescenza stock contiene il colorante fluorescente Ca-sensibili, solitamente Fluo-4 e un quencher e qualsiasi residuo può essere memorizzato a 4 ° C per almeno 5 giorni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. acquisizione dati
Nota: eseguire l'acquisizione dei dati il giorno della misurazione degli effetti della droga. Eseguire passaggi 3.1–,10 interamente per il primo piatto di cella, poi li ripeto per la seconda piastra di cella.
<ol><li>Avviare il software del lettore di piastra (se necessario) e caricare le punte di pipetta.</li>
	<li>Regolare le impostazioni del software per registrare un segmento di 2 min di onde di calcio con una frequenza di acquisizione di almeno 10 Hertz per definire la frequenza di battito basale per ciascun pozzetto.</li>
	<li>Per una cella piastra, diluire 3 mL di terreno di fluorescenza stock in 12 mL di mezzo di mantenimento caldo con gli antibiotici per rendere il supporto di fluorescenza.</li>
	<li>Sostituire 20 µ l di terreno in ciascun pozzetto della piastra cellulare con 30 µ l di terreno di fluorescenza.</li>
	<li>Pipettare su e giù da 1x a mescolare.</li>
	<li>Posizionare la piastra di cella nel lettore di piastra più presto possibile per consentire il hiPSC-CM acclimatare alla temperatura.</li>
	<li>Attendere 60 minuti prima di iniziare l'acquisizione dei dati.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dei dati del software di lettore di piastra per registrare un segmento di 2 min di onde di Ca con una frequenza di acquisizione di almeno 10 Hz, per definire la linea di base battendo tariffa per ciascun pozzetto. Nota: per ogni sequenza di registrazione, assicurarsi che la piastra di cella non viene trasferita automaticamente dal dispositivo dopo l'acquisizione di dati. Questo impedisce alla piastra di raffreddamento a temperatura ambiente. Con alcune versioni del software reader piastra, può essere necessario interrompere ogni registrazione prima che finisce completamente per raggiungere questo obiettivo.</li>
	<li>Aggiungere i composti di prova e di riferimento con il robot di lettore di piastra pipettando pozzetto a altro 5 µ l dalla piastra composta alla piastra (dopo l'aggiunta, la concentrazione di DMSO è 0,3% [v/v]).</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dei dati nel software reader piastra per registrare 2 min segmenti delle onde Ca a partire circa 5, 15, 30, 45 e 60 min dopo l'aggiunta di composto (assicurarsi che ogni volta che la piastra di cella rimane nel dispositivo).</li>
</ol>4. analisi dei dati
Nota: l'analisi dei dati può essere eseguito in qualsiasi momento dopo la misurazione.
<ol><li>Esportare i dati grezzi per ogni periodo di registrazione dal software del lettore di piastra come file di testo ASCII.</li>
	<li>Importare i dati grezzi nel software di analisi dati.</li>
	<li>Per ciascun pozzetto e tutti i punti di tempo, estrarre la frequenza primaria pestaggio. Nota: Con il software di analisi di dati elencato nella Tabella materiali, battendo le frequenze possa essere calcolato con una routine di analisi personalizzate utilizzando la funzione di LombPeriodogram, basata sul metodo di analisi spettrale di minimi quadrati7 Lomb – Scargle . Il periodogramma dovrebbe essere calcolata per un intervallo di frequenze compreso tra 0,01 e 5 Hz. La frequenza primaria può essere estratta dal periodogramma utilizzando le routine di PeakAutoFind. Questo metodo di analisi fornisce misurazioni più accurate di battere frequenze rispetto al metodo fornita come opzione con il software del lettore di piastra. Tuttavia, quest'ultimo può ancora essere utilizzato se la personalizzazione del software non è un'opzione.</li>
	<li>Esportare le frequenze di pestaggio primario per ogni periodo di registrazione dal software di analisi dati come copie di appunti o come file di testo ASCII.</li>
	<li>Importare le frequenze di pestaggio primario in un software di foglio di calcolo da incollare negli Appunti o importazione di file di testo. Nota: procedura 4.5–4.9 può essere eseguita in qualsiasi software di foglio di calcolo moderno.</li>
	<li>Per ciascun pozzetto, normalizzare alla linea di base la frequenza di battito in ogni momento dopo l'applicazione della droga (5, 15, 30, 45 e 60 min) dividendo la frequenza primaria pestaggio a quel tempo punto dalla frequenza primaria pestaggio al basale.</li>
	<li>Calcolare l'effetto medio di DMSO in ogni momento dopo l'applicazione della droga (5, 15, 30, 45 e 60 min) calcolando i valori normalizzati per i 20 pozzi dove è stato applicato il DMSO.</li>
	<li>Per ogni bene e ogni volta punto dopo l'applicazione della droga (5, 15, 30, 45 e 60 min), sottrarre l'effetto medio di DMSO (tempo-abbinati) per lo stesso piatto.</li>
	<li>Media delle misurazioni duplicate. Nota: se un composto cambia frequenza o il software non riesce a trovare una frequenza primaria dopo l'aggiunta di composto, un esame visivo del modello pestaggio può valutare se il composto prodotto aritmie.</li>
</ol>

<ol><li>Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+risk+of+drug-induced+proarrhythmia+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Estimating the risk of drug-induced proarrhythmia using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 123, 281-289 (2011).</li>
<li>Jonsson, M. K., Wang, Q. D., Becker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance-based+detection+of+beating+rhythm+and+proarrhythmic+effects+of+compounds+on+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Impedance-based detection of beating rhythm and proarrhythmic effects of compounds on stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Assay and Drug Development Technologies. 9, 589-599 (2011).</li>
<li>Kattman, S. J., Koonce, C. H., Swanson, B. J., Anson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+their+derivatives%3A+a+renaissance+in+cardiovascular+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cells and their derivatives: a renaissance in cardiovascular translational research.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (1), 66-72 (2011).</li>
<li>Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li>
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<li>Sirenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+in+vitro+assessment+of+compound+effects+on+cardiomyocyte+physiology+using+iPSC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Multiparameter in vitro assessment of compound effects on cardiomyocyte physiology using iPSC cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18, 39-53 (2013).</li>
<li>VanderPlas, J. T. <a target="_blank" href="https://arxiv.org/pdf/1703.09824.pdf">Understanding the Lomb-Scargle Periodogram.</a> Cornell Univeristy Library. , arXiv:1703.09824 (2017).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, A3 B 1-3 (2015).</li>
<li>Ertel, E. A., Godfraind, T. Calcium channel blockers and calcium channels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErtel%2C+EA+%22Calcium+Channel+Blockers%22">Calcium Channel Blockers</a>. Godfraind, T. , Springer. Basel, Switzerland. 11-80 (2004).</li>
<li>Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+potassium+channels+by+antiarrhythmic+and+antihypertensive+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Modulation of potassium channels by antiarrhythmic and antihypertensive drugs.</a> Hypertension. 19, 228-236 (1992).</li>
<li>Duran-Riveroll, L. M., Cembella, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidinium+Toxins+and+Their+Interactions+with+Voltage-Gated+Sodium+Ion+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Guanidinium Toxins and Their Interactions with Voltage-Gated Sodium Ion Channels.</a> Marine Drugs. 15 (10), (2017).</li>
<li>Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).</li>
<li>Puppala, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell--derived+cardiocytes+and+human+and+cynomolgus+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiling in human-induced pluripotent stem cell--derived cardiocytes and human and cynomolgus heart tissue.</a> Toxicological Sciences. 131 (1), 292-301 (2013).</li>
<li>CIPA. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cipaproject.org">http://cipaproject.org</a> (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Due aspetti sono più critici per il successo registrazione di battere le frequenze. Il primo è quello di esercitare cautela con placcatura di cella e la cultura. In particolare, è importante cercare di evitare di graffiare lo strato delle cellule presso il fondo dei pozzetti quando il mezzo di scambio. È accettabile per toccare il fondo dei pozzetti con le pipette, ma lo stesso angolo dovrebbe essere usato ogni volta, producendo quindi solo un piccolo graffio nello strato delle cellule e non compromettere le prestazioni del test. Il secondo aspetto critico di ottenere ritmi omogenei riproducibili è quello di fornire il buon controllo della temperatura a 37 ° C su tutta la piastra cellulare per tutta la durata della misurazione. Non potremmo ottenere questa omogeneità utilizzando dispositivi diversi dal lettore della piastra usato qui, ma può essere fattibile con particolari modifiche per la regolazione della temperatura: renderebbe il protocollo presentato qui più largamente utilizzabile di là di un unico marchio di piastra lettore. Per raggiungere la stabilità di temperatura per tutta la durata dell'esperimento con il dispositivo utilizzato qui, è stato necessario interrompere ogni registrazione prima che si è conclusa; in caso contrario, il robot avrebbe espellere la piastra delle cellule misurata. Questo problema tecnico potrebbe scomparire con la prossima release del software reader piastra, ma rimane critica per ora. Se un piatto di cella erroneamente viene trasferito all'esterno lettore della piastra, deve essere caricato più velocemente possibile tornare all'interno. Tuttavia, la qualità dell'esperimento si deteriora, perché temperatura cambiamenti incidono sul tasso di pestaggio estremamente rapidamente.
Alcuni altri aspetti, che non sono stati testati accuratamente, possono essere meno importante. Ad esempio, hiPSC-CM i produttori raccomandano di piastre di coltura cellulare di rivestimento prima della semina delle cellule, ma in questo test specifico, rivestimento non è stato utilizzato, perché le cellule aderiscono abbastanza facilmente su varie superfici, e risulta molto difficile correttamente cappotto 384 pozzetti piatti. Eppure, rivestimento cella piatto può ancora essere consentita, o può anche migliorare la qualità di analisi. Abbiamo provato anche mai se solventi diversi da DMSO sarebbe accettabile, ma ci si aspetta dall'esperienza con altre tecnologie di registrazione che simili concentrazioni di EtOH o MeOH sarebbe tollerabile. Generalmente usiamo hiPSC-CMs dello stesso produttore, e le cellule da un solo fornitore ulteriore sono state testate, che sembrava funzionare in modo simile. Allo stesso modo, abbiamo usato solo un piccolo numero di lotti diversi di hiPSC-CMs che sono stati selezionati da precontrollando li per verificare che si sono comportati allo stesso modo alla partita iniziale. Uno o due lotti sono stati ritenuti inadeguati perché loro sincizi avevano scarsa stabilità o riproducibilità sotto le condizioni di coltura utilizzato qui. In caso contrario, la farmacologia è apparso molto simile in batch durante il test un pannello limitato di composti "tipici" (forskolin, N6-ciclopentil-adenosina ed E-4031, come pure dell'endotelina, isoproterenolo, amlodipina e ponesimod). Abbiamo usato solo hiPSC-CM derivati da donatori sani. Può essere utile per valutare se hiPSC-CM derivate da pazienti con malattia cardiaca fornirebbe risultati diversi, anche se nessuna differenza tra donatori sani e pazienti è stata osservata quando si valuta la cardiotossicità di inibitori della tirosina chinasi 12. Infine, aspettiamo normalmente 22 – 28 giorni nella cultura prima di misurare gli effetti della droga: nella nostra esperienza con le registrazioni di impedenza delle stesse cellule, uno stato di costante per rallentare impedenza (un indicatore di stabilità di strato delle cellule) e veloce impedenza (un indicatore di battendo la frequenza) viene raggiunto dopo 12–15 giorni nella cultura. Tuttavia, abbiamo deciso di aspettare 22–28 giorni, perché questo è il momento quando il profilo di espressione di canali cardiaci e marcatori di maturazione ha stabilizzato13. Non si è esaminato se risultati comparabili si otterrebbe se le cellule sono state usate prima o poi.
Il protocollo descritto qui utilizza una misura molto semplice del tasso spontaneo pestaggio di hiPSC-CM per valutare potenziali effetti della droga sull'elettrofisiologia cardiaca umana. Suoi principali vantaggi rispetto ad altre metodologie sono che i) è favorevole a un ambiente di high throughput screening, ii) registra l'attività dei cardiomiociti e gli effetti delle droghe a temperature fisiologiche, e iii) non richiede ed elettrofisiologiche per l'esecuzione o per la valutazione dei risultati.
In uno studio di convalida eseguito con molti farmaci approvati per uso umano, abbiamo mostrato che il test reagisce ai farmaci utilizzati in medicina umana come predetto da esistenti dati clinici5. Poiché questo metodo considera tutti i potenziali effetti sul ritmo cardiaco, essa integra la completa in vitro Proarrhythmic assay (CiPA) iniziativa14 che valuta in particolare potenziale pro-aritmici.
In futuro, questo metodo potrebbe fornire un'ulteriore comprensione della modalità di azione delle droghe indicate per influenzare il tasso di pestaggio spontanea. È probabile che ulteriori informazioni meccanicistiche sono presente nelle registrazioni di fluorescenza di transienti di Ca (ad es., nella loro ampiezza o forma). Se vengono eseguite le registrazioni di fluorescenza a tassi più elevati di acquisizione (ad esempio, 30 Hz), questi parametri vengono estratti facilmente oltre a battere il tasso, e può essere interessante correlare le modifiche a questi parametri con i noti effetti di droghe usate clinicamente.

Il presente protocollo descrive un metodo per misurare gli effetti della droga sulla frequenza spontanea pestaggio di sincizi di hiPSC-CM a ritmi fisiologicamente rilevanti. Cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo possono differenziare in cardiomiociti funzionali che instaurano spontaneamente battendo sincizi in vitro1,2,3,4. Questi hiPSC-CM può essere ottenuto in gran numero attraverso i fornitori commerciali o produzione in laboratorio, e sono un'utile fonte di cellule per generare modelli di farmacologia e fisiologia cardiaca umana. In particolare, può essere utilizzati per prevedere che per caratterizzare gli effetti cardiaci che possono verificarsi quando un farmaco viene somministrato a esseri umani5.
La frequenza di battito di sincizi hiPSC-CM può essere misurata in condizioni fisiologiche mediante matrici di microelettrodi o impedenza1di rilevamento: queste tecniche non invasive forniscono informazioni molto dettagliate sugli effetti della droga, ma sono piuttosto bassa produttività ed essi non consentono testing grandi biblioteche composti all'interno di tempo realistico e vincoli di bilancio. Un sistema più efficace può essere elaborato utilizzando un lettore di piastre di imaging di fluorescenza di 384 pozzetti e un Ca-sensibile tingere6, ma i lettori di micropiastre classica sono ostacolati da frequenza di acquisizione e controllo di temperatura non ottimali. Queste limitazioni sono illustrate da pestaggio DAergici tariffe (~ 15 bpm, rispetto ai 35 – 55 bpm in ambienti controllati1) e scarsa risoluzione del segnale di Ca (una frequenza di acquisizione di 8 Hz è al limite inferiore alla velocità di registrazione che può raggiungere i 120 bpm in condizioni di stimolata, e non è possibile estrarre informazioni come pendenza o durata). Il metodo qui descritto combina la registrazione di battendo modelli a ritmi fisiologici e a risoluzione sufficiente per escludere queste preoccupazioni.
Sul lato positivo, questo metodo è semplice, affidabile e ad alta velocità di trasmissione, che permette il test rapido di un gran numero di composti a costi ragionevoli. Il lato negativo, questo metodo richiede un lettore veloce con controllo di temperatura effettiva, che è un investimento costoso, e fornisce informazioni poco meccanicistici sugli effetti di droga osservato, che potrebbero richiedere ulteriori test con maggiori informazioni metodi.
Approssimativamente 6 x 106 hiPSC-CM sono necessari per una misurazione in una piastra 384 pozzetti. hiPSC-CM sono solitamente forniti commercialmente come aliquote congelate di ~ 4 x 106 cellule in 1 mL. Pertanto, è conveniente preparare due piastre di cellulari con tre aliquote congelate. Nella maggior parte dei casi, a causa della bassa variabilità di questo test, è sufficiente eseguire misurazioni duplicati dei composti della prova e, in ogni piatto di cella, quadruplicare misurazioni dei controlli positivi (forskolin, N6-ciclopentil-adenosina ed E-4031), e 20-plicatio misurazioni di controllo negativo (DMSO da solo). Di conseguenza, un massimo di 352 composto/concentrazione coppie può essere valutato con due piastre da 384 pozzetti delle cellule. Il seguente protocollo ritiene tale esperimento eseguito con 352 sostanze da testare, due piastre di cellulari e 12 milioni le celle fornite come tre aliquote congelate; può essere facilmente su vasta scala se sono necessari ulteriori punti dati.

<table><tbody><tr><td>FDSS7000 lettore di lastre fluorescenti</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, Francia)</td><td>non un articolo</td><td></td>del catalogo</tr><tr><td>FDSS7000 Kit di filtri per fluorescenza Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, Francia)</td><td></td><td>installato inizialmente nel dispositivo</td></tr><tr><td>FDSS7000 il controllo della temperatura</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, Francia)</td><td>A10118-09</td><td></td></tr><tr><td>FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, Francia)</td><td>C11653-11</td><td></td></tr><tr><td>FDSS7000 puntali per pipette per piastre a 384 pozzetti</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td>Software di analisi della forma d'onda <td>A8687-62</td><td></td></tr><tr><td>per cardiomiociti</td><td>Hamamatsu Photonics (Massy, France)</td><td>U8524-12</td><td>alternativa opzionale al software</td></tr> <tr><td>Igor ProSoftware di analisi dei dati Igor Pro</td><td>Wavemetrics (Portland, Oregon, USA)</td><td>Ultima versione</td><td></td></tr><tr><td>iCell-Cardiomyocytes Kit</td><td>Cellular Dynamics International (Madison, WI)</td><td>R1106</td><td>include cellule, placcatura e terreni di manutenzione</td></tr><tr><td>Kit per cardiomiociti Cor.4U</td><td>Ncardia Germany (Colonia, Germania)</td><td>Ax-B-HC02-4M</td><td>include cellule, piastre e terreni di mantenimento alternativa alle piastre per colture cellulari a 384 pozzetti iCell-Cardiomyocytes</td></tr><tr><td></td><td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germania)</td><td>781091</td><td></td></tr><tr><td>piastre composte a 384 pozzetti</td><td>Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germania)</td><td>781280</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi del calcio 4 FLIPR</td><td>Molecular Devices (Sunnyvale, California)</td><td>R8142</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich (Buchs, Svizzera)</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>N6-ciclopentil-adenosina</td><td>Sigma-Aldrich (Buchs, Svizzera)</td><td>C8031</td><td></td></tr><tr><td>E-4031</td><td>Enzo Life Sciences (Lausen, Svizzera)</td><td>BML-KC158</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>Gibco/ThermoFisher (Reinach, Svizzera)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue, 0,4%</td><td>Gibco/ThermoFisher (Reinach, Svizzera)</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

contrazioni di umano-ipsc-derivato del cardiomyocyte sincizi misurata con un colorante fluorescente ca sensibile a temperatura controllata piastre da 384 pozzetti

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Contraenti spontaneamente sincizi di cardiomiociti derivati da pluripotenti indotte dall'uomo le cellule staminali (hiPSC CM) sono un modello utile di farmacologia e fisiologia cardiaca umana. Vari metodi sono stati proposti per registrare questa attività spontanea e per valutare gli effetti della droga, ma molti di questi metodi soffrono di throughput limitato e/o rilevanza fisiologica. Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alta resa per quantificare gli effetti di composti esogeni sulla frequenza di battito di hiPSC CM, utilizzando un colorante fluorescente Ca-sensibile e un lettore di piastre multi-pozzetto imaging e temperatura controllata. Descriviamo come preparare le piastre della cella e il composto e come eseguire il test automatizzato per ottenere alta sensibilità e riproducibilità. Inoltre descriviamo come trasformare e analizzare i dati di fluorescenza per fornire affidabili misure degli effetti della droga sul ritmo spontaneo. Questa analisi può essere usata nei programmi di scoperta della droga per guida Ottimizzazione chimica, o allontanarlo, composti che interessano la funzione cardiaca umana.

La figura 1 Mostra una registrazione rappresentativa delle onde di Ca alla linea di base attraverso una piastra 384 pozzetti. Nella maggior parte dei casi, tutti i pozzetti rivelano un tasso di battito regolare con poca variabilità su tutta la piastra (media ± DS = 40.1 ± 3.5 bpm; gamma = 34 – 54 bpm). Molto raramente (meno di 1 su 10 esperimenti), pochi pozzi (meno di 5) hanno aritmia o assenza di ritmo. In tre piastre da 384 pozzetti, abbiamo provato anche cardiomiociti da un altro fornitore (Vedi Tabella materiali) e ottenuti i valori basali molto simile per il pestaggio spontaneo.
Bloccanti dei canali ionici cardiaci influenzano il ritmo dei cardiomiociti in un modo riproducibile5. Amlodipina, un bloccante del lento Ca canali9, accelera il ritmo, più di 100% in modo concentrazione-dipendente fino a 1 µM (Figura 2A). L'effetto è ben sviluppato entro i primi 5 min, ma ancora approssimativamente aumenta 50% entro il prossimo 30 min prima che si stabilizza. Sopra 1 µM, amlodipine arresti il pestaggio (linee tratteggiate), come può essere previsto dal fatto che Ca in bicicletta è fondamentale per le contrazioni spontanee. Altri bloccanti dei canali del Ca dihydropyridine selettivo producono effetti molto simili.
E-4031, un bloccante dei canali rapida raddrizzatore in ritardo K10, rallenta il ritmo di circa 65–70% in un modo dipendente dalla concentrazione fino a 10 µM (Figura 2B). L'effetto si sviluppa entro i primi 5 min e non varia entro i prossimi 60 min. Altri bloccanti selettivi IKr producono effetti simili, anche se la massima riduzione tasso può variare (ad es., 35–40% per cisapride, 70% per E-4031 e 90% - 95% per dofetilide). La base per questa disparità non è noto.
Tetrodotossina, un bloccante del veloce Na canali11, rallenta il ritmo di circa il 15% in un modo dipendente dalla concentrazione, fino a 1 µM 30–(Figura 2). L'effetto è ben sviluppato entro i primi 5 min e non varia molto entro i prossimi 60 min. Tuttavia, sopra 30 µM, tetrodotossina arresti il pestaggio entro i primi 5 min, considerando che dopo 30 min, arresta sopra 1 µM. Altri bloccanti dei canali del Na, come la lidocaina o mexiletina, producono effetti simili o tutto o niente.
Bepridil, un bloccante misto di cardiaco Na, Ca e K canali9, produce anche un effetto tutto o niente (Figura 2D). Ciò suggerisce che in questa preparazione, un blocco dei canali del Na è l'azione principale di bepridil. Un'accelerazione a causa del blocco del canale di Ca non è vista, e il più progressivo rallentamento a causa di blocco IKr appare mascherato dall'effetto canale Na.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig1.jpg"> Figura 1: rappresentante basale Ca onde attraverso una piastra 384 pozzetti. (A) tutti i pozzetti su tutta la piastra dimostrano un tasso di battito regolare con poca variabilità. Questa immagine viene catturata direttamente dal software del lettore di piastra. Ogni traccia è 10 s in durata. L'intensità di fluorescenza è arbitrario (relativa luce unità derivate dalla scala di grigi di videocamera). (B) questo Blow-up di uno 10 s traccia Mostra il basso rumore del segnale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58290/58290fig2.jpg"> Figura 2: effetti rappresentativi di ionico cardiaco antagonista. Questi pannelli mostrano curve concentrazione-risposta con (A) il selettiva Ca canale antagonista amlodipina, (B) la IKr selettivo bloccante E-4031, (C) il selettivo antagonista Na TTX e (D), il canale non-selettivi bepridil Blocker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58290/58290fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Contraenti spontaneamente sincizi di cardiomiociti derivati da pluripotenti indotte dall'uomo le cellule staminali sono utili modelli di farmacologia e fisiologia cardiaca umana. Qui presentiamo un sistema di high throughput screening per quantificare gli effetti di composti esogeni battendo frequenza, utilizzando un colorante fluorescente Ca-sensibile e un lettore di piastre multi-pozzetto imaging e temperatura controllata.

Contrazioni di umano-iPSC-derivato del Cardiomyocyte sincizi misurata con un colorante fluorescente Ca sensibile a temperatura controllata piastre da 384 pozzetti

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della farmacologia della sicurezza cardiaca. Ad esempio, una nuova medicina umana ha il rischio di modificare il normale ritmo cardiaco? Il vantaggio principale di questa tecnica è che può valutare un gran numero di composti rapidamente e a un costo moderato.A dimostrare la procedura sarà Camille Forny, ricercatrice associata nel mio laboratorio. Per prepararsi alla misurazione delle contrazioni della sizizia dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, o HIPSCCM, iniziare posizionando CryoTube contenenti cellule congelate in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per due minuti. Trasferire l'intera sospensione cellulare scongelata da ogni tubo a un unico tubo conico fresco da 50 millilitri.Per recuperare le celle rimanenti, lavare ogni tubo con un millilitro di 37 gradi Celsius mezzo di placcatura prebellico e aggiungere questo mezzo al tubo conico da 50 millilitri contenente celle scongelate. Aggiungere otto millilitri di mezzo di placcatura caldo al tubo e mescolare con cura le sospensioni. Utilizzare il metodo di esclusione blu tripano e un emocitometro per contare le cellule vive.Aggiungendo un mezzo di placcatura caldo, regolare la concentrazione a 50.000 cellule per millilitro. Per distribuire le cellule in due nuove piastre di coltura cellulare da 384 po ', aggiungere 25 microlitri a ciascun pozzo, che produrranno circa 12.500 cellule per pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in piastre da 384 po 'in atmosfera umidificata con 5% di anidride carbonica per un totale di tre o quattro settimane.Il giorno seguente, sostituire il mezzo di placcatura con 50 microlitri di mezzo di manutenzione calda. Successivamente, sostituire metà del mezzo di manutenzione ogni due o tre giorni. Nei giorni sette, 14 e 21, sostituire completamente il mezzo.Una volta che le cellule sono state mantenute in coltura per tre o quattro settimane, si sono formate spontaneamente contraendo la sincitia e l'effetto dei composti su queste contrazioni può essere misurato. Il giorno del saggio, almeno due ore prima che la prima piastra cellulare venga posizionata all'interno del lettore di piastre per la misurazione, accendere il lettore e impostare l'impianto di riscaldamento a 37 gradi Celsius. Per preparare le piastre composte, scaldare a temperatura ambiente 40 millilitri di mezzo di manutenzione integrati con streptomicina penicillina volume per volume dell'1%.Mentre il mezzo si sta riscaldando, distribuire i composti di prova e i controlli in due piastre composte da 384 po 'aggiungendo 1,5 microlitri di soluzione di magazzino per pozzo. Centrifugare le piastre composte a 100 G per un minuto. Aggiungere 37 microlitri di mezzo di manutenzione per ogni pozzo e centrifugare nuovamente le piastre a 100 G per un minuto.Per preparare il colorante fluorescente, riscaldare 100 millilitri di mezzo di manutenzione integrati con streptomicina penicillina dell'1% volume per volume in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 10 millilitri del mezzo riscaldato al mix di colorante fluorescente sensibile al calcio e quencher per ricostituirli come mezzo di fluorescenza di serie. Avviare il software lettore di lastre.Preparare il software per registrare un segmento di due minuti di onde di calcio con una frequenza di acquisizione di almeno 10 hertz. Per rendere il mezzo di fluorescenza per ogni piastra cellulare, diluire tre millilitri di mezzo di fluorescenza stock con 12 millilitri di mezzo di mantenimento caldo con antibiotici. Sostituire 20 microlitri di mezzo in ogni pozzo della piastra cellulare con 30 microlitri di mezzo di fluorescenza e mescolare tubazione su e giù una volta.Subito dopo, posizionare la piastra in un lettore di lastre per consentire agli HIPSCCM di adattarsi alla temperatura del lettore per 60 minuti. Quindi, avviare il software di lettura delle lastre. Registrare un segmento di due minuti di onde di calcio con una frequenza di acquisizione di almeno 10 hertz per definire il tasso di battitura di base per ogni pozzo.È importante assicurarsi che la piastra cellulare non venga trasferita fuori dal dispositivo dopo l'acquisizione dei dati. Con alcune versioni del software, è necessario interrompere la registrazione prima che finisca completamente. Utilizzare il robot lettore di lastre per pipettare cinque microlitri dei composti di prova e di riferimento bene a bene dalla piastra composta nella piastra cellulare.Successivamente, inizia l'acquisizione dei dati nel software di lettura delle lastre per registrare due segmenti minuti di onde di calcio a partire da cinque, 15, 30, 45 e 60 minuti dopo l'aggiunta composta. Per avviare l'analisi dei dati, esportare i dati grezzi per ogni periodo di registrazione dal software di lettura delle lastre nei file di testo ASCII. E poi importarli nel software di analisi dei dati.Dal software di analisi dei dati esportare le frequenze di battiaggio primarie per ogni periodo di registrazione come copie degli Appunti. Estrarre la frequenza di battimento primaria per ogni pozzo e ogni punto di tempo. Infine, importare le frequenze di battimento in un software per fogli di calcolo incollando gli Appunti e continuare l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.La registrazione delle onde di calcio al basale su una piastra da 384 po 'mostra che nella maggior parte dei casi tutti i pozzi rivelano un tasso di battiaggio regolare con poca variabilità attraverso la piastra. Quando vengono aggiunti bloccanti dei canali ionici cardiaci, influenzano il ritmo dei cardiomiociti. L'amlodipina, un bloccante dei canali lenti del calcio, accelera il ritmo di oltre il 100% in modo dipendente dalla concentrazione fino a un micromolare.E soprattutto, amlodipina arresta il pestaggio. E-4031, un bloccante dei canali di potassio del raddrizzatore rapido ritardato decelera il ritmo di circa il 65-70% in modo dipendente dalla concentrazione fino a 10 micromolari. La tetrodotossina, un bloccante dei canali veloci del sodio decelera il ritmo di circa il 15% in modo dipendente dalla concentrazione fino a uno a 30 micromolari, mentre sopra i 30 micromolari, la tetrodotossina arresta il pestaggio entro i primi cinque minuti.Bepridil, un blocco misto di canali cardiaci di sodio, calcio e potassio produce anche un effetto tutto o niente, suggerendo che il blocco del canale del sodio è l'azione primaria del bepridil. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere estremamente delicati quando si pipetta nella piastra di coltura cellulare. Questi tessuti sono molto fragili e facilmente danneggiati se toccati da pipette.Non dimenticare che lavorare con cellule umane e farmaci attivi può essere pericoloso e precauzioni come indossare guanti e occhiali di sicurezza dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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