Valutazione della procedura per eseguire la cystometria sveglia in un modello di mouse

L'obiettivo generale di questa procedura microchirurgica è impiantare un catetere intravesicale nella vescica urinaria e registrare la funzione del tratto urinario inferiore in un topo sveglio. Questo metodo può contribuire all'acquisizione di dati sperimentali riproducibili mediante cistometria in animali svegli e alla valutazione della funzione vescicale in modelli murini sani e malati. L'obiettivo principale di questa tecnica è fornire un metodo standardizzato, basato su dati sperimentali, per eseguire la cistometria di riempimento in un modello murino.

Per preparare il tubo per l'innesto, tagliare innanzitutto un pezzo di tubo pe10 lungo sette centimetri e avanzare lentamente un'estremità verso una fiamma libera per creare un imbuto, ritirando rapidamente il tubo non appena si forma l'imbuto. Quindi utilizzare l'impostazione di bassa temperatura di una pistola per colla applicando tre gocce di colla universale a caldo a 4,5, 5 e 5,5 centimetri dall'estremità svasata del tubo. Usare le forbici per tagliare le irregolarità dalle bolle di colla.

Applicare colla a caldo a un'estremità di un ago da 30 gauge, che verrà utilizzato per tappare il tubo pe10 dopo l'innesto. Successivamente, verificare l'assenza di risposta alla pressione sulle dita dei piedi e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Dopo aver sterilizzato la parte superiore della schiena e l'addome inferiore con alcol e betadina, praticare un'incisione di 1,5 centimetri tra le scapole e posizionare l'animale in posizione supina su un tappetino riscaldante a 37 gradi Celsius ricoperto con drappi sterili sotto un microscopio stereoscopico.

Ora effettuare un'incisione cutanea mediana inferiore addominale lunga 1,5 centimetri. Successivamente, praticare un'incisione corrispondente attraverso la fascia lungo la linea alba e il muscolo per esporre la cupola e la metà superiore della vescica urinaria. Mantenendo le viscere addominali umide con soluzione fisiologica calda, ruotare l'animale sul fianco per accedere all'incisione sulla nuca.

Spingere un emostatico stretto attraverso l'incisione in modo sottocutaneo per creare un canale sottocutaneo sulla schiena, proseguendo lungo il fianco dell'animale. Una volta che la punta dello strumento raggiunge la base della gabbia toracica, ruotare la punta verso la linea mediana all'interno dell'addome e continuare ad avanzare l'emostatico finché la punta non appare attraverso l'incisione addominale al di sotto del tessuto muscolare. Quando la punta dell'emostatico è all'interno dell'incisione, pizzicare la pelle sopra la spalla ed esercitare una trazione per aiutare a stabilizzare l'animale fino a quando la punta dello strumento non diventa visibile attraverso l'incisione addominale.

Ora utilizzare l'emostatico per afferrare l'estremità non svasata del tubo e ritrarre lentamente l'emostatico, estraendo l'estremità del tubo dall'incisione nella parte posteriore del collo e posizionando l'estremità svasata del tubo direttamente al di sopra della volta della vescica. Stabilizzare la vescica con un piccolo rotolo di tessuto senza lanugine. Posizionare un punto di sutura monofilamento 6-O non assorbibile legato in modo lento sulla sommità della volta della vescica.

Utilizzando la mano non dominante e la pinzetta microcurva Dumont numero sette, afferrare la cupola della vescica e, con un ago da 21 gauge nella mano dominante, praticare una cistotomia all'apice della cupola. Esplorare delicatamente la cistotomia con una coppia di pinzette microcurve numero cinque chiuse per assicurarsi che il catetere possa passare agevolmente attraverso l'apertura, quindi inserire l'estremità svasata del catetere pe10 nella vescica, spingendo la svasatura fino al collo della vescica in modo che non scivoli fuori durante il fissaggio. Con il legaccio monofilamento posizionato anteriormente al tubo, stringere il punto di sutura 6-O attorno alla cupola della vescica e al tubo il più in alto possibile sulla vescica per evitare una riduzione artificiale della capacità vescicale.

In alternativa, posizionare una sottile sutura a punto di borsa sulla cupola della vescica, praticare una cistotomia come appena dimostrato e inserire l'estremità svasata del catetere nella puntura. Quindi annodare la sutura intorno alla cupola e al tubo, come dimostrato per la sutura piatta. In entrambi i casi, prestare attenzione a fissare il tubo senza causare lesioni estese alla parete della vescica.

Se viene prelevato troppo tessuto, la capacità della vescica sarà ridotta. Se ne viene prelevato troppo poco, la connessione perderà. Per verificare la tenuta e la posizione del tubo all'interno della vescica, collegare una siringa per insulina da 0,5 millilitri dotata di un ago da 30 gauge all'estremità distale del tubo e riempire lentamente la vescica con 0,1-0,2 millilitri di cloruro di sodio 0,9% fino a quando non appare una goccia all'orifizio uretrale.

Se la sigillatura è incompleta, avvolgere i lembi del filo intorno alla vescica e annodare nuovamente. Quindi svuotare la vescica mediante aspirazione. Se non si verificano perdite nella cupola, stabilizzare la vescica con una coppia di pinze microcurve ed estrarre delicatamente il tubo fino a quando la flangia risulti appoggiata contro l'interno della cupola della vescica.

Ripetere il test di tenuta utilizzando il metodo precedentemente descritto. Tagliare le estremità del filo di sutura, rimuovere il rullo di tessuto e riposizionare la vescica nella sua normale sede. Quindi utilizzare un punto continuo di sutura 6-O per chiudere la parete addominale in due strati.

E delicatamente ruotare l'animale sulla sua pancia. Inserire la parte sottocutanea dell'ancora metallica nell'incisione intrascapolare e utilizzare un monofilamento 6-O per fissare il tubo e l'ancora con una sutura a punto materasso verticale. Verificare che una bolla di colla sia presente al di sopra e al di sotto della cute per impedire che il tubo si stacchi, quindi tagliare il tubo a circa due centimetri sopra la superficie cutanea.

Quindi inserire delicatamente un tappo da 30 gauge all'estremità del tubo per impedire la fuoriuscita di urina. Prima di effettuare la lettura, utilizzare un tubo PE50 per collegare la pompa di infusione, il trasduttore di pressione e il raccordo girevole da 22 gauge. Successivamente, posizionare l'animale sperimentale anestetizzato in posizione prona e rimuovere il tappo da 30 gauge.

Collegare il cavo all'ancora, inserire il catetere vescicale nell'estremità del pe50 e utilizzare colla a caldo per creare una sigillatura impermeabile. Posizionare il topo sul pavimento di rete e iniziare la registrazione.

Quindi, quando l'animale si riprende dall'anestesia e la pressione vescicale si stabilizza, iniziare a infondere cloruro di sodio allo 0,9% a un flusso di 0,6 millilitri all'ora. Tipicamente, al secondo giorno dopo l'inserimento del catetere, si sviluppa un grave edema sottomucoso che occupa metà della sezione trasversale della vescica, causando un'occlusione della cavità. Al quinto giorno l'edema si risolve completamente, lasciando le aree sottomucose infiltrate da cellule infiammatorie che hanno parzialmente invaso la muscolaris.

La maggiore entità del gonfiore tissutale osservata nei giorni due e tre correla con la corrispondente eliminazione comportamentale, con gli animali che mostrano una funzione vescicale significativamente compromessa in questi momenti temporali. Come previsto dai dati istologici, la frequenza di minzione si normalizza entro il quinto giorno postoperatorio. La pressione intravesicale in un animale sveglio e libero di muoversi, con artefatti da movimento minimi, è caratterizzata da una pressione di base di 10-15 centimetri di acqua, che può rimanere invariata o aumentare gradualmente di non più di 10 centimetri di acqua durante il ciclo di riempimento.

Seguita da un brusco aumento e successiva diminuzione della pressione di tipo impulsivo durante la minzione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 30 minuti se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di minimizzare i danni alla vescica per preservare la fisiologia del tessuto.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cistometria con riempimento a ciclo singolo, per rispondere ad ulteriori domande sulla capacità funzionale della vescica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impiantare microchirurgicamente un tubo nella vescica urinaria e di come utilizzare la cistometria con riempimento in animali svegli per valutare la funzione del tratto urinario inferiore nei topi.