Metodi per classificare i foci citoplasmatici come granuli di stress di mammiferi

L'obiettivo generale di questo flusso di lavoro è determinare se i focolai identificati all'interno del citoplasma sono veri e propri granuli di stress, che sono granuli di RNA che svolgono ruoli importanti nella fisiologia cellulare. Il vantaggio principale di questo flusso di lavoro è che verifica tutte le proprietà fondamentali dei granuli di stress. Sebbene questo flusso di lavoro sia presentato per le cellule OS U-2 dell'osteosarcoma umano, può essere applicato anche ad altri tipi di linee cellulari e cellule primarie.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non tutti i focolai indotti dallo stress sono granuli di stress. Il nostro flusso di lavoro comprende tutte le sperimentazioni necessarie per distinguerli. Dimostrerò questa procedura con Anais Aulus.

Siamo borsisti post-dottorato nel laboratorio di Paul Anderson e Pavel Ivanov. Per iniziare, seminare le cellule su vetrini coprioggetti posti in piastre a 24 pozzetti come descritto nel protocollo di testo. Dopo l'incubazione notturna, aspirare il terreno di coltura dai pozzetti B1 a B4 e da C1 a C4 della piastra a 24 pozzetti.

Aggiungere 500 microlitri del terreno integrato con 100 micromolari di arsenito di sodio ai pozzetti B1 e B2, quindi aggiungere 500 microlitri del terreno integrato con 50 micromolari di arsenito di sodio ai pozzetti B3 e B4. Quindi, aggiungere 500 microlitri del terreno contenente 150 micromolari di vinorelbina ai pozzetti C1 e C2. Infine, aggiungere 500 microlitri del terreno integrato con 125 micromolari di vinorelbina ai pozzetti C3 e C4. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere alle cellule della colonna due cinque microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di cicloesimide e alle cellule della colonna quattro, due microlitri di 1,25 milligrammi per millilitro di puromicina. Agitare delicatamente la piastra per mescolare le soluzioni e rimettere la piastra nell'incubatore per altri 30 minuti di incubazione.

Per fissare le cellule, rimuovere il terreno dai pozzetti e lavare le cellule con circa 250 microlitri di PBS. Aggiungere circa 250 microlitri di una soluzione tamponata di paraformaldeide al 4% per fissare le cellule, assicurandosi che la parte superiore del vetrino coprioggetti sia completamente coperta. Quindi, lasciare la piastra su un bilanciere da banco a temperatura ambiente per 15 minuti.

Successivamente, rimuovere e scartare correttamente la paraformaldeide. Aggiungere circa 250 microlitri di metanolo ghiacciato per permeabilizzare e appiattire le cellule. Incubare la piastra per altri cinque minuti a temperatura ambiente su un bilanciere.

Una volta completata la permeabilizzazione, scartare il metanolo e bloccare le cellule applicando circa 250 microlitri di tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, preparare la soluzione di anticorpi primari aggiungendo 12 microlitri di anticorpi contro G3BP1, eIF4G ed eIF3B a tre millilitri di tampone bloccante. Aggiungere 250 microlitri della soluzione anticorpale a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti.

Incubare la piastra su un bilanciere per almeno un'ora a temperatura ambiente. Dopo un'ora di incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare le cellule con circa 250 microlitri di PBS per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 12 microlitri di anticorpi Anti-Mouse Cy2, Anti-Rabbit Cy3 e Anti-Goat Cy5 insieme a tre microlitri di colorante a uncino a tre millilitri di tampone bloccante per preparare la soluzione anticorpale secondaria.

Aggiungere 250 microlitri della soluzione di anticorpi secondari a ciascun pozzetto e coprire la piastra per proteggere i campioni dalla luce. Incubare la piastra su un bilanciere a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare le cellule con PBS per cinque minuti.

Riscaldare il mezzo di montaggio in un blocco termico a 37 gradi Celsius per 10 minuti per ridurre la viscosità. Quindi, utilizzando un puntale per pipetta pretagliato da 200 microlitri, posizionare 25 microlitri del mezzo di montaggio su un vetrino etichettato. Con una pinza fine, trasferire il vetrino coprioggetti dal pozzetto al vetrino, capovolgendo la parte superiore in modo che le cellule siano rivolte verso il mezzo di montaggio.

Utilizzare una punta P200 pulita per premere il vetrino coprioggetti verso il basso. Una volta montati tutti i vetrini coprioggetti, rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso premendo saldamente un fazzoletto da laboratorio contro il vetrino. Successivamente, sciacquare lo scivolo con acqua.

E tamponalo immediatamente con del tessuto di laboratorio ancora una volta. Permeabilizzare le cellule prefissate incubandole con 250 microlitri di metanolo ghiacciato a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, ai pozzetti svuotati della piastra aggiungere circa 250 microlitri di etanolo al 70% e sigillare la piastra utilizzando parafilm per evitare l'evaporazione.

Incubare la piastra a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere l'etanolo e reidratare le cellule aggiungendo 500 microlitri di 2XSSC. Incubare i vetrini coprioggetti per cinque minuti su un dondolo a temperatura ambiente.

Quindi, scartare la soluzione e aggiungere ancora una volta 500 microlitri di SSC. Incubare la piastra per altri cinque minuti agitando delicatamente. Quindi, sovrapporre il parafilm sul fondo di un forno di ibridazione e pipettare sopra di esso 25 microlitri di tampone di ibridazione.

Trasferire il vetrino coprioggetti dalla piastra a 24 pozzetti, capovolgendo la parte superiore in modo che le cellule siano rivolte verso il tampone di ibridazione. Incubare i vetrini coprioggetti a 42 gradi Celsius per 15 minuti. Pipettare 25 microlitri di una soluzione di biotina oligo dT sul parafilm nel forno di ibridazione.

Quindi, usando una pinza, raccogli il vetrino coprioggetti e tampona il bordo contro un tessuto di laboratorio per rimuovere il tampone di ibridazione in eccesso. Trasferire il vetrino coprioggetti nella soluzione di oligo dT di biotina, assicurandosi che le cellule siano rivolte verso il basso e incubare a 42 gradi Celsius per 60 minuti. Una volta completata l'ibridazione, aggiungere circa 500 microlitri di 2XSSC preriscaldato ai pozzetti della capsula a 24 pozzetti.

Quindi, utilizzando una pinza, trasferire il vetrino coprioggetti nel pozzetto e incubarlo a 42 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver ulteriormente colorato le cellule con una soluzione di anticorpi, visualizzare i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza. Qui sono presentate le immagini delle cellule OS U-2 non trattate che non contengono granuli o focolai colorati con i marcatori dei granuli di stress G3BP1, eIF4G ed eIF3B.

Nelle cellule OS U-2 trattate con arsenito di sodio o vinorelbina, è stata indotta la formazione di focolai citoplasmatici che contengono G3BP1, eIF4G ed eIF3B. La co-localizzazione di questi marcatori è stata confermata dall'analisi della scansione lineare eseguita per ciascun canale a ingrandimento maggiorato seguita dalla sovrapposizione dei grafici ottenuti. Inoltre, i focolai citoplasmatici identificati nelle cellule trattate contenevano mRNA come mostrato dal poli A FISH.

Il segnale oligo dT è co-localizzato con il segnale G3BP1 confermando l'identificazione dei granuli di stress. Una volta padroneggiato, l'intero flusso di lavoro può essere eseguito in tre giorni se eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'immunofluorescenza e l'ibridazione fluorescente.

Passaggi critici per la corretta caratterizzazione e identificazione dei granuli di stress. Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide potrebbe essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare sempre precauzioni come l'uso di DPI e un'adeguata ventilazione.