Creazione di un modello del roditore del Aneurysm aortico addominale bloccando Adventitial Vasa Vasorum perfusione

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un'ipossia del tessuto aortico per innescare un'aneurisma aortica addominale, o AAA, con dilatazione aortica progressiva nel ratto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sugli aneurismi aortici riguardo ai meccanismi responsabili dello sviluppo e della rottura degli aneurismi aortici addominali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le caratteristiche morfologiche e patologiche osservate nel modello del ratto sono simili a quelle riscontrate negli aneurismi aortici addominali umani.

L'idea per questo metodo è nata quando stavamo esaminando un'altra possibilità relativa a un'AAA umana. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'intervento chirurgico di induzione dell'ipossia è difficile da apprendere solo attraverso istruzioni basate esclusivamente sul testo. A dimostrare la procedura saranno Tatsuro Yata, il nostro chirurgo vascolare, e Hirona Kugo, entrambi ex dottorandi del nostro laboratorio.

Dopo aver verificato il livello appropriato di sedazione mediante pizzicamento del dito del piede, utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dell'addome di un ratto del peso di 300-400 milligrammi, seguito da una disinfezione sequenziale della cute esposta con soluzione alcolica e soluzione di povidone-iodio. Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina e applicare un unguento sugli occhi dell'animale. Successivamente, utilizzare un paio di forbici per praticare un'incisione addominale mediana ventrale ed usare garza sterile e un retraettore per ferite per contenere il contenuto addominale all'interno della cavità addominale.

Per staccare l'aorta dal tessuto perivascolare, utilizzare una pinzetta per sollevare delicatamente e strappare il retroperitoneo, esponendo la parete aortica. Successivamente, dissezionare l'aorta infrarenale nello spazio retroperitoneale, dalla vena renale sinistra fino alla biforcazione, separandola dal tessuto perivascolare. Utilizzare un filo di sutura di seta 5-0 per legare i vasi che si diramano dall'aorta addominale, al fine di bloccare l'apporto ematico in un punto distante dall'aorta che non restringa il lume aortico.

Per bloccare il flusso sanguigno aortico, posizionare clip vascolari appena al di sotto dell'arteria renale e appena al di sopra della biforcazione dell'aorta. In modo simile alla creazione di un'emorragia puntiforme sulla superficie della parete aortica, inserire le forbici microchirurgiche a 5 mm in senso distale rispetto al clip aortico, adiacente ai rami delle arterie renali, per tagliare la parete anteriore dell'aorta e utilizzare un ago indwelling da 24 gauge per inserire leggermente un catetere in poliuretano attraverso l'incisione. Collegare una siringa da 1 mL riempita con acqua al poliuretano e lavare il sangue residuo dall'aorta.

Successivamente, tagliare un nuovo catetere in poliuretano lungo 10 mm ed inserirlo completamente nell'incisione del lume aortico. Riposizionare il punto medio del catetere in corrispondenza dell'incisione e utilizzare un punto singolo con sutura monofilamento 8-0 per chiudere l'incisione con punti separati. Legare l'aorta addominale con un nodo chirurgico utilizzando sutura in seta 5-0 e il catetere in poliuretano.

Una volta assicurato il catetere, rimuovere le clip vascolari alla biforcazione aortica e al di sotto dell'arteria renale per ripristinare il flusso ematico anterogrado e confermare la presenza di pulsazioni aortiche evidenti. Dopo aver rimosso la garza, utilizzare un punto di sutura in polipropilene 4-0 per chiudere accuratamente l'incisione addominale in due strati, al fine di prevenire la fuoriuscita di organi. Successivamente, applicare lidocaina topica sull'incisione addominale e posizionare il ratto su un tappetino riscaldante con monitoraggio fino al completo recupero.

Dopo l'intervento, osservare l'evoluzione temporale dell'aorta dilatata mediante ecografia, misurando il diametro massimo dal margine interno al margine esterno dell'aorta addominale secondo protocolli standard. A 28 giorni dall'intervento chirurgico, utilizzare un bisturi per aprire l'addome con una nuova incisione ventrale e utilizzare forbici per prelevare l'aneurisma. Porre le aorte prelevate in formalina neutra tamponata al 10% per 24-48 ore.

Dopo aver incluso le aorte in paraffina e ottenuto sezioni del tessuto aortico, secondo protocolli standard, idratare le sezioni fissate in paraffina in acqua distillata per 10 minuti, seguito da incubazione in ematossilina di Verhoeff. La ruggine e la corrosione possono essere identificate mediante l'ematossilina di Verhoeff e la soluzione di van Gieson nell'attività di laboratorio. Pertanto, la freschezza e i tempi di incubazione di questi coloranti per tessuti sono importanti per l'archiviazione e la colorazione opzionale.

Dopo 25 minuti, sciacquare le sezioni con tre lavaggi di 1 minuto in acqua, seguiti da 10-30 immersioni in soluzione differenziante. Risciacquare nuovamente le sezioni tre volte in acqua e immergere i campioni in tiosolfato di sodio al 5% per un minuto. Dopo un ulteriore lavaggio in acqua, immergere i campioni in soluzione di van Gieson per cinque minuti.

Successivamente, disidratare i tessuti mediante immersioni ascendenti in etanolo per 30 secondi, seguite da un'operazione di chiarificazione con due incubazioni in xilene di 5 minuti ciascuna. Quindi utilizzare un mezzo di montaggio in risonanza per coprire le sezioni con coprioggetti di dimensioni adeguate. In queste immagini, viene mostrato un esempio rappresentativo di aneurisma dell'aorta addominale, a 28 giorni dall'inserimento del catetere.

La misurazione delle estremità superiore e inferiore dell'aorta mediante ecografia transaddominale rivela un diametro normale senza dilatazione immediatamente dopo il posizionamento del catetere, che aumenta fino a raggiungere la dimensione massima a circa 14 giorni dal posizionamento e rimane invariato o aumenta leggermente fino alla fine del periodo sperimentale. L'analisi istopatologica dell'aneurisma al giorno 28 rivela una marcata degradazione delle fibre elastiche rispetto a quanto osservato al giorno zero. Una volta acquisita, questa tecnica può essere completata in circa un'ora se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi in vitro per rispondere a ulteriori domande riguardo le funzioni seriali individuali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'aneurisma aortico addominale per esplorare la malattia in specifiche popolazioni di pazienti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre l'ipossia del tessuto aortico per l'insorgenza di aneurismi aortici addominali con dilatazione aortica progressiva nel ratto.

Non dimenticare che lavorare con strumenti chirurgici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura si devono sempre adottare precauzioni contro lesioni e infezioni.