Name: Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Scopri un metodo di immunistochimica semi-automatizzato per analizzare la morfologia e la composizione dei tipi di fibra nel muscolo scheletrico del topo. Questa tecnica consente di identificare rapidamente le isoforme della catena pesante della miosina.

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Siamo grati alla Fondazione Boettcher e l'associazione sclerosi laterale amiotrofica (n. 17-II-344) per il loro supporto di questa ricerca.

tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato di uso e University of Colorado-Anschutz Medical Campus istituzionali Animal Care (91813(05)1D).
 1. giorno 1: primaria (1°) Immunostaining con l'albumina di siero bovino (BSA) blocco <ol><li>asciugato all'aria sezioni congelate del muscolo del hindlimb del mouse (ad esempio, tibiale anteriore, soleo) montate su vetrini caricati per ~ 30 min 11. disegnare un bordo intorno alle sezioni utilizzando una penna PAP barriera idrofoba.</li>
	<li>Posto ~ 250 µ l di 5% BSA/tampone fosfato salino (BSA/PBS) su ogni diapositiva per bloccare il legame non specifico anticorpo. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Mentre il blocco, 01:50 di preparare diluizioni dell'anticorpo 1 ° surnatante nel 5% BSA/PBS (tutti sono anticorpi monoclonali di topo; cfr. tabella 1 6 , 12); preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Mantenere 1° anticorpo scorte e diluizioni su Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tabella 1: anticorpi primari utilizzati per distinguere MyHCs.
<ol start="4"> <li>a seguito di aspirazione della soluzione blocco 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 1° alle diapositive appropriate. Aggiungere 250 µ l di 5% BSA/PBS al controllo di negativo solo anticorpo secondario (2°) scivola.</li>
	<li>Incubare a 4 ° C per 24-48 h in un ambiente umido. 
	Nota: Una capsula di Petri rivestito in alluminio con filtro di carta inumidito può servire come una camera di incubazione adatto.</li>
</ol> 2. Giorno 2:2 ° Immunostaining con anticorpi fluorescenti <ol><li>aspirare la soluzione di anticorpo di 1° o 5% BSA/PBS soluzione di controllo. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA.</li>
	<li>Durante il lavaggio, preparare diluizioni 1: 200 degli anticorpi purificati, coniugati fluoroforo 2 ° nel 5% BSA/PBS (Vedi tabella 2, sono tutti anti-topo di capra). Preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Tenere all'oscuro su Ice. anticorpi coniugati fluoroforo a 2°</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tabella 2: anticorpi secondari coniugati fluoroforo utilizzato per visualizzare primario riconoscimento dell'anticorpo di MyHCs.
<ol start="3"> <li>a seguito di aspirazione della terza applicazione di soluzione bloccante di 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 2° a tutte le diapositive. Incubare per 90 min a temperatura ambiente in un ambiente buio, umido.</li>
	<li>Soluzione di anticorpo 2° aspirato. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Risciacquare con PBS. Secco per 10 min.</li>
	<li>Montare il coprioggetto con un mezzo di montaggio acquoso non permanente, bassa viscosità.</li>
	<li>Quando asciutto, sigillare i bordi di diapositiva con smalto. Asciugare e conservare in un contenitore scuro.</li>
</ol> 3. Diapositive con epifluorescenza di imaging <ol><li>pulire i vetrini con un piccolo, 70% imbevuto di etanolo lab-wipe.</li>
	<li>Ottenere immagini digitali di sezioni di muscolo immunostained utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un apparecchio fotografico (Vedi la Tabella materiali).
	<ol><li>Selezionare un'area di circa 1 mm 2 (obiettivo 10x, NA 1,4).</li>
		Filtro passa-lungo di <li>Vedi fluorescenza degli anticorpi coniugati Alexa 488 2° tramite un 505 nm. Mostra la fluorescenza generata da eccitazione degli anticorpi coniugati Alexa 594 2° tramite un filtro di passa-lungo 595 nm. Digitalizzare immagini con un computer PC equipaggiato con un software di imaging compatibile. Includere la barra della scala da imaging software per analisi successive.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analisi delle immagini con Fiji Nota: prima di procedere con l'analisi, Fiji (disponibile gratuitamente dal National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve essere installato tramite https://imagej.net/Fiji/Downloads. Inoltre, la macro utilizzata in questo processo è fornita nel File supplementare. Inserire il file di macro in una directory accessibile.
<ol><li>Carico un campo chiaro l'immagine di una sezione selezionata in Fiji. Passare al plugin &#8594; segmentazione &#8594; segmentazione Weka Trainable.</li>
	<li>Al fine di stabilire le zone cellulari della sezione, tracciare una linea su una fibra e fare clic &#34; aggiungere alla classe 1 &#34;. Quindi, tracciare una linea sullo spazio tra le fibre e fare clic &#34; aggiungere alla classe 2 &#34; per contrassegnare i domini extracellulari. Ripetere fino a quando ci sono 5-10 etichette in ogni classe.
	<ol><li>Clic treno classificatore. La sovrapposizione risultante di rosso e verde, aggiungere altre etichette manualmente (Vedi punto 4.2) a pezzi in modo non corretto segmentate dell'immagine, se necessario. Ripetere fino a fibre (rosso) in modo appropriato sono separati dallo spazio tra le fibre (verde).</li>
	</ol></li> <li>Clic &#34; probabilità di ottenere &#34; e salvare l'immagine in una cartella nuova con etichetta.</li>
	<li>Ripetere la procedura di cui sopra (punti 4.2-4.3) con l'immagine fluorescente prelevato dallo stesso campo. Etichetta immunostained fibre come &#34; classe 1 &#34; e tutte le regioni non fluorescenti come &#34; classe 2 &#34;. Salvare la mappa di probabilità risultante nella stessa cartella in cui è memorizzata l'immagine trasformati brightfield.</li>
	<li>Aprire una delle mappe di probabilità precedentemente salvato in Fiji. Disegnare una linea retta nella barra della scala fornita dal software di imaging. Vai a analizzare &#8594; impostare scala. Modificare i parametri (cioè, distanza nota, unità di lunghezza) al loro valori appropriati come dato dalla barra della scala, quindi controllare il &#34; Global &#34; casella per standardizzare la scala per ogni immagine.</li>
	<li>Passa al plugin &#8594; macro &#8594; eseguire &#8594; Tyagi et al fibra quantificazione macro.ijm (vedere il File supplementare). Immediatamente, verrà visualizzato un riquadro di navigazione. Aprire l'immagine &#39; cartella host s; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Per ogni finestra di dialogo, modificare il &#34; sfondo &#34; a discesa valore per &#34; luce. &#34; Nota: la cartella ora verrà popolata con immagini dei contorni della fibra e file di software di calcolo dei risultati (CSA e Feret diametro sono più pertinenti allo quantificare la morfologia delle fibre; parametri misurati possono essere regolati in analizzare impostare misure). Dati di morfologia fibra generati dalla funzione di poro-analisi di Fiji saranno trasferiti automaticamente ai file di software di foglio di calcolo per entrambe le immagini fluorescenti e luminose campo.</li>
	<li>Calcolare la frazione di fibre che esprime un determinato MyHC in un campo dividendo il numero di fibre fluorescenti nel campo per il numero di fibre totale nell'immagine corrispondente campo luminoso.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi di divulgare.

Qui, abbiamo fornito direzione utile per l'identificazione dei tipi di fibra muscolare scheletrica. In tal modo, descriviamo un nuovo algoritmo per l'analisi dei dati.
Poiché in gran parte, i nostri risultati confermano quelli di precedenti rapporti5,8,10 e riflettono le nostre misurazioni manuali, l'algoritmo sembra essere accurata. Ancora, abbiamo incontrato alcuni trabocchetti sperimentale infreque...

Esso è stato conosciuto per qualche tempo che il muscolo scheletrico è composto da singole fibre di molti tipi1. Inizialmente, due gruppi di fibre sono state caratterizzate in base alle loro proprietà contrattili e denominato, in modo appropriato, slow-twitch (tipo I) e rapide (tipo II). Queste categorie sono stati ulteriormente distinti sulla base del metabolismo della fibra. Da allora tipo I fibre sono ricche di mitocondri e affidamento sul metabolismo ossidativo, essi sono stati chiariti da robustamente positiva nicotinammide adenina dinucleotide-tetrazolio reduttasi (NADH-TR) diaforasi2 o succinato deidrogenasi (SDH)3 la macchiatura. Al contrario, fibre di tipo II hanno esibito minore e gradi variabili di NADH-TR diaforasi o SDH macchiatura e sono stati divisi in due sottogruppi di contrazione rapida (tipo IIA e tipo IIB) un po' rozzamente basato sulle loro capacità ossidativa relativa. Queste distinzioni tra le fibre hanno state visualizzate in modo più efficace di miosina-ATPasi-miosinica dove tipo I fibre macchia scure dopo una pre-incubazione a pH 4.0 e fibre di tipo IIB assorbono precipitato seguenti pre-incubazione a pH 10.0 con le fibre di tipo IIA la macchiatura intermedio4.
Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più fine di fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibre possono essere tutti identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC. Inoltre, un altro tipo di contrazione rapida metabolicamente intermedio-fibra, tipo IIX, è stato identificato6. Fibre ibride che esprimono più MyHC inoltre sono stati confermati5,7,8. Alcune specie come il gatto e il babbuino non sono noti a rapidi tipo IIB MyHCs6. Se MyHC immunostaining è attualmente la valutazione dello stato-of-the-art della composizione del muscolo, l'analisi dei dati ottenuti tramite questa tecnica è ingombrante e richiede molto tempo senza assistenza automatizzata. A tal fine, una manciata di metodi semi-automatici per analizzare questi dati sono stati sviluppati5,9,10. Qui, presentiamo un protocollo relativamente standard per l'identificazione immunohistochemical di fibra muscolare-tipo5,7,8,10, insieme a un romanzo semi-automatizzato algoritmo che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra con precisione.

<table><tbody><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>5% in PBS</td></tr><tr><td>Barriera idrofobica Pap Pen</td><td>Scientific Device Laboratory</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Immumount</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Smalto per unghie</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Microscopio a fluorescenza invertita e campo chiaro</td><td>Fuori produzione</td><td></td>Soluzioni di imaging SPOT RT/KE SPOT RT940 Dell Optiplex BA-F8 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa monoclonale di topo IgG2b;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari</td><td>Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa</td><td></td><td>topo monoclonale IgG1; 1:50</td></tr><tr><td>BF-F3 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari</td><td>Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa</td><td></td><td>monoclonale di topo IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>6H1 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari</td><td>Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa</td><td></td><td>monoclonale di topo IgGM; 1:50</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>anti-topo di capra; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>anti-topo di capra; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>capra anti-topo; 1:200</td></tr><tr><td>OTT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>isopentano</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>raffreddare con azoto liguido</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, diluire a 1x</td></tr><tr><td>salviette Kim</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi semi-automatica del mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Per anni, distinzioni tra tipi di fibre muscolari scheletriche sono state visualizzate meglio macchiando di miosina-atpasi. Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più preciso del tipo di fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX e fibre di tipo IIB possono ora essere identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC; Tuttavia, l'analisi manuale di questi dati può essere lento e giù-destra noioso. A questo proposito, rapida e accurata valutazione della morfologia e composizione di fibra-tipo è uno strumento molto desiderabile. Qui, presentiamo un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di state-of-the-art di MyHCs nelle sezioni congelate ottenute dal muscolo del hindlimb del mouse in concerto con un algoritmo romanzo semi-automatizzato che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra. Come previsto, il muscolo soleo visualizzato macchiatura per tipo I e fibre IIA, ma non per fibre di tipo IIX o tipo IIB. D'altra parte, il muscolo anteriore di tibialis era composto principalmente da fibre di tipo IIX e tipo IIB, una piccola frazione delle fibre di tipo IIA e poco o nessun fibre di tipo I. Varie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità ai fini della misurazione di diversi aspetti della morfologia delle fibre (cioè, area della sezione trasversale (CSA), diametro Feret massima e minima). I valori ottenuti per questi parametri sono stati poi confrontati con valori ottenuti manualmente. Sono state osservate differenze significative tra una delle due modalità di analisi per quanto riguarda il CSA, diametro Feret massima o minima (tutti p &#62; 0,05), che indica la precisione del nostro metodo. Così, il nostro protocollo di analisi immunostaining può essere applicato per l'indagine degli effetti sulla composizione del muscolo in molti modelli di invecchiamento e di miopatia.

Muscoli del hindlimb (cioè, tibiale anteriore, soleo) sezionati da un topo C57BL/6 maschio di età sconosciuta erano flash congelati affondando una muffa di plastica che contiene il muscolo in OCT composto in isopentano raffreddato ad azoto liquido. Quindi, utilizzando un cryotome, erano taglio a-20 ° C e trasferite al vetro caricati positivamente diverse diapositive12sezioni di serie di 8-10 µm.
...

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare l'immunohistochimica all'avanguardia per identificare in modo preciso e rapido i tipi di fibre muscolari scheletriche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia muscolare, ad esempio se i cambiamenti nel tipo di fibra siano indotti dalla perdita di proteine funzionali. Sebbene questo approccio possa fornire informazioni utili in molti modelli di malattie muscolari, può essere impiegato anche in sistemi come modelli knock-in e knock-out per rivelare l'impatto maggiore di una singola molecola sulla funzione muscolare di base.Per iniziare, lasciare asciugare all'aria sezioni congelate di muscolo di topo su vetrini carichi per circa mezz'ora. Una volta asciutte, tracciare un bordo intorno alle sezioni su ogni vetrino utilizzando una penna idrofoba PAP. Successivamente, per bloccare il legame aspecifico degli anticorpi, aggiungere circa 250 microlitri di BSA al 5% in PBS all'interno dei bordi disegnati e incubare i vetrini a temperatura ambiente per un'ora.Nel frattempo, preparare una diluizione da uno a 50 dell'anticorpo primario in PBS con il 5% di BSA. Preparare circa 250 microlitri per vetrino e conservare la diluizione dell'anticorpo sul ghiaccio. Al termine del periodo di blocco, aspirare la soluzione di blocco dai vetrini e aggiungere aliquote di 250 microlitri della diluizione dell'anticorpo.Come controllo negativo, applicare il 5% di BSA in PBS senza l'anticorpo primario. Successivamente, posizionare una carta filtrante inumidita nella piastra di Petri e coprirla con della pellicola di alluminio per creare una camera di incubazione. Quindi incubare i vetrini a quattro gradi Celsius per 24-48 ore nella camera o in un ambiente simile con la stessa umidità.Dopo l'incubazione con l'anticorpo primario, aspirare la soluzione dai vetrini e lavare i vetrini tre volte. Per ogni lavaggio, aggiungere circa 250 microlitri di BSA al 5% in PBS per circa 10 minuti. Durante il lavaggio dei vetrini, preparare diluizioni da 1 a 200 degli anticorpi secondari marcati con fluorocromo.Preparare almeno 250 microlitri per vetrino e mantenere la soluzione al buio e sul ghiaccio. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere 250 microlitri della diluizione dell'anticorpo secondario sui vettrini. Quindi incubare i vettrini per 90 minuti a temperatura ambiente in un ambiente umido al buio.Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di anticorpo e lavare i vetrini tre volte come in precedenza. Dopo aver eliminato tutto l'eccesso di anticorpo secondario, risciacquare i vetrini con PBS e lasciarli asciugare all'aria per 10 minuti. Infine, montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso a bassa viscosità non permanente.Dopo che il mezzo si è asciugato, sigillare i bordi del vetrino con smalto per unghie e trasferire i vetrini in una scatola opaca per l'archiviazione. Prima di acquisire un'immagine da un vetrino, pulire il vetrino con etanolo al 70%. Quindi acquisire le immagini digitali utilizzando un microscopio a epifluorescenza.Con ingrandimento basso, selezionare un'area di interesse di un millimetro quadrato. Per visualizzare gli anticorpi coniugati con Alexa 488, utilizzare un filtro passa-lungo da 505 nanometri. Per visualizzare gli anticorpi coniugati con Alexa 594, utilizzare un filtro passa-lungo da 595 nanometri.Con i filtri impostati correttamente, iniziare ad acquisire le immagini digitali. Assicurarsi di includere una barra della scala per le analisi successive. Per l'analisi, installare Fiji con il macro fornito insieme a questa pubblicazione.Memorizzare il file macro in una directory facilmente accessibile. Ora, caricare un'immagine in campo chiaro di una sezione selezionata e accedere all'opzione di segmentazione Weka addestrabile. Per definire le aree cellulari della sezione, tracciare una linea su una fibra e fare clic su "aggiungi alla classe uno".Quindi, per contrassegnare i domini extracellulari, tracciare una linea nello spazio tra le fibre e fare clic su "aggiungi alla classe due". Ripetere questo processo fino a quando non sono stati definiti da cinque a dieci marcatori per ciascuna classe. Può risultare difficile contrassegnare i confini interstiziali.L'utilizzo della funzione di zoom consente di delimitare questi confini con maggiore precisione. Successivamente, selezionare l'opzione di addestramento del classificatore. Sull'immagine risultante con sovrapposizione rossa e verde, aggiungere manualmente ulteriori etichette alle parti dell'immagine che sono state segmentate in modo errato dal processo automatizzato.Fare ciò finché le fibre marcate in rosso non sono adeguatamente separate dagli spazi intermedi marcati in verde. Quindi fare clic su "get probability" e salvare l'immagine in una nuova cartella. Ora ripetere l'intero processo utilizzando l'immagine fluorescente acquisita dallo stesso campo.Etichettare le fibre immunoistochimiche come classe uno e tutte le regioni non fluorescenti come classe due. Infine, salvare la mappa di probabilità risultante nella stessa cartella in cui è stata memorizzata l'immagine in campo chiaro elaborata. A questo punto, aprire una delle mappe di probabilità precedentemente salvate in Fiji.Tracciare una linea retta sulla barra di scala fornita dal software di imaging. Selezionare l'opzione imposta scala e inserire i valori corretti in base alla barra di scala. Quindi attivare l'opzione globale per standardizzare la scala in ogni immagine.Ora eseguire la macro Tyagi per la quantificazione delle fibre e verrà visualizzato il riquadro di navigazione. Quindi aprire la cartella principale delle immagini. Nella finestra di dialogo associata, modificare il valore del menu a discesa dello sfondo in chiaro.La funzione di misurazioni predefinite può essere utilizzata per definire quali parametri devono essere misurati. L'area della sezione trasversale (CSA) e il diametro delle fibre sono le misure più pertinenti per quantificare la morfologia delle fibre. Dopo l'esecuzione del macro, la cartella verrà popolata con immagini dei contorni delle fibre e fogli di calcolo contenenti le misurazioni effettuate dalla funzione di analisi.I muscoli tibiale anteriore e soleo sono stati analizzati utilizzando i metodi descritti poiché sono composti principalmente da fibre a contrazione rapida o lenta. Sono state identificate diverse catene pesanti della miosina mediante l'uso di anticorpi specifici. Una frazione significativa delle fibre muscolari del soleo esprimeva catene pesanti della miosina di tipo I e di tipo IIa e una percentuale considerevole delle fibre rimanenti risultava positiva per il tipo IIx. Al contrario, praticamente nessuna fibra di tipo IIb era evidente.In confronto, i muscoli tibiali anteriori colorati erano composti principalmente da fibre del tipo due B e del tipo due X della catena pesante della miosina, con un contributo minore da parte di fibre che esprimono catene di tipo due A e praticamente nessuna fibra che esprime catene di tipo uno. L'analisi morfometrica di un muscolo tibiale anteriore sottoposto a sonda con anticorpi SC-71 diretti contro la catena pesante della miosina di tipo due A ha fornito diverse trasformazioni dell'immagine utilizzate per creare mappe di probabilità. Da questa semplice analisi automatizzata, i dati si sono rivelati pienamente confrontabili con quelli ottenuti mediante calcoli manuali molto più laboriosi.Nel complesso, l'analisi ha prodotto dati provenienti da circa 6.000 fibre singole in totale. L'elevata capacità di elaborazione dei dati ha reso molto più agevole l'analisi statistica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire una immunomarcatura su sezioni muscolari e utilizzare il software semiautomatico fornito per facilitare l'analisi del tipo e della composizione delle fibre muscolari.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il muscolo può essere eterogeneo a livello regionale e che per una valutazione rigorosa del tipo e della composizione delle fibre muscolari è necessario analizzare numerosi campi muscolari. In combinazione con questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la colorazione con tricromio, per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se lo sviluppo di fibrosi avviene in parallelo ai cambiamenti nella composizione dei tipi di fibre.

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Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l'acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

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Prove crescenti indicano che l'eccessiva infiltrazione di lipidi all'interno del muscolo scheletrico provoca lipotossicità e diabete. Qui, presentiamo un protocollo completo, che include l'elaborazione dei tessuti, la colorazione con Bodipy, l'acquisizione di immagini e l'analisi, per quantificare le dimensioni, la densità e la distribuzione subcellulare delle goccioline lipidiche in un modo specifico per il tipo di fibra.

Tipo di fibra e analisi subcellulare specifica del contenuto di goccioline lipidiche nel muscolo scheletrico

Questo protocollo dimostra l'isolamento di una singola fibra dal muscolo scheletrico umano liofilizzato e la classificazione del tipo di fibra in base all'isoforma della catena pesante della miosina (MHC) utilizzando la tecnica del dot blotting. I campioni di fibre MHC I e II identificati possono quindi essere ulteriormente analizzati per le differenze specifiche del tipo di fibra nell'espressione proteica utilizzando il western blotting.

Identificazione del tipo di fibra del muscolo scheletrico umano

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Qui, descriviamo un metodo completo per misurare la fosforilazione ossidativa mitocondriale in fibre muscolari scheletriche fresche permeabilizzate da muscolo umano o di topo. Questo metodo consente la quantificazione in tempo reale della respirazione mitocondriale e la valutazione della preferenza per il carburante e della flessibilità metabolica, preservando le reti mitocondriali esistenti e l'integrità della membrana.

Misurazione della respirazione mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche umane e di topo mediante repirometria ad alta risoluzione

Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.

Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi

Un straight-forward insieme di metodi per isolare e determinare l'identità delle proteine ​​più abbondanti espresse nel muscolo scheletrico. Circa 800 punti sono discernimento su un gel bidimensionale da 10 mg muscolare, che ci permette per la determinazione del sesso-specifico l'espressione della proteina. Questi metodi forniscono risultati equivalenti nella maggior parte dei tessuti.

Sesso Dimorfismo muscolo scheletrico da Proteomica

Scopri un metodo di immunistochimica semi-automatizzato per analizzare la morfologia e la composizione dei tipi di fibra nel muscolo scheletrico del topo. Questa tecnica consente di identificare rapidamente le isoforme della catena pesante della miosina.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

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