Utilizzo di Laser Doppler Imaging e monitoraggio per analizzare il microcircolo del midollo spinale nel ratto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di presentare una combinazione di imaging laser doppler e monitoraggio per misurare i flussi sanguigni locali del midollo spinale e la saturazione di ossigeno, nonché una procedura standardizzata per l'introduzione di un trauma del midollo spinale su un ratto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microcircolazione, come ad esempio come il flusso sanguigno si ridistribuisce nel tempo e il suo impatto sull'area circostante dopo una lesione del midollo spinale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizzando sia l'imaging laser doppler che il dispositivo di monitoraggio potremmo derivare rapidamente dati sulla distribuzione locale del flusso sanguigno e sulla variazione del flusso sanguigno in un periodo di tempo, il che consente un'analisi più sofisticata del flusso sanguigno nell'area problematica.

Inizia controllando il ratto anestetizzato per un piano chirurgico di anestesia dall'assenza di una reazione a un pizzicamento del dito del piede. Radere l'area dorsale del ratto dalla parte bassa della schiena al collo. Quindi posiziona il lato dorsale del ratto rivolto verso l'alto su un termoforo a 40 gradi Celsius per mantenere una temperatura corporea costante.

Sterilizzare l'area rasata strofinando con batuffoli di cotone imbevuti di iodio seguiti da alcol al 75%. Dopo aver praticato un'incisione cutanea sul sito della laminectomia che copre le vertebre toraciche da T7 a T11, tagliare i muscoli attaccati su entrambi i lati da T8 a T10 per esporre i processi spinosi, le lamine e le faccette articolari. Usa il bisturi per praticare incisioni che scollegano la giunzione tra T10 e T11.

Esporre ulteriormente la giunzione sezionando attentamente lo strato muscolare per esporre l'osso. Usa le forbici per eliminare ulteriormente i muscoli dalla lamina e attorno al peduncolo con piccole cesoie. Questo aprirà un piccolo spazio tra le vertebre a T10 e T11.

Inserire lentamente e delicatamente una pinza emostatica in questa fessura e rompere il peduncolo. Ripetere sull'altro lato. Esporre il midollo spinale e sollevare e rompere con cautela la lamina senza lasciare frammenti ossei liberi o frastagliati.

Ripetere il processo per rimuovere ulteriormente le lamine T9 e T8. Un impattatore può ora essere utilizzato per indurre lesioni da commozione cerebrale in gruppi sperimentali. Per eseguire la scansione del midollo spinale esposto, posizionare il lato dorsale del ratto su uno sfondo nero e non riflettente, quindi impostare i parametri di scansione nel software facendo clic su Misura per accedere all'interfaccia utente grafica di misurazione e quindi sul pulsante Impostazione scanner per aprire l'interfaccia di configurazione dello scanner.

Per eseguire la scansione di aree di piccole dimensioni, ad esempio in questo esperimento, fare clic su Dimensioni di scansione e Opzioni di visualizzazione e selezionare Alta risoluzione per una modalità di scansione fine con risoluzione più elevata. Fare clic sull'opzione Scansione immagine per controllare i parametri di scansione. Controlla l'immagine del video in diretta facendo clic sull'opzione Video e distanza.

Posizionare lo scanner da 10 a 13 centimetri sopra la finestra chirurgica e spostare lo sfondo con l'animale per centrare il midollo spinale esposto sulla finestra di scansione. Selezionare la funzione Distanza automatica per regolare con precisione l'altezza di scansione, che deve essere mantenuta coerente in tutte le misurazioni dell'esperimento. Utilizzare una copertura antiriflesso con una finestra per esporre solo l'area chirurgica per ridurre ulteriormente lo sfondo e segnare la direzione dell'animale.

Fare clic su Ripeti scansione per impostare il numero di scansioni, quindi fare clic su OK per aprire l'interfaccia Ripeti scansione. Fare clic sul pulsante Avvia per avviare la scansione. L'intero processo richiederà circa tre o quattro minuti.

Per monitorare il flusso sanguigno e la saturazione di ossigeno nel tempo viene utilizzato un monitor scanner con ago smussato VP3 e sonda di erogazione. Iniziare collegando la sonda perpendicolarmente a uno strumento stereotassico per impostare l'apparecchiatura di monitoraggio. Metti il ratto sull'apparato stereotassico, con il lato dorsale rivolto verso l'alto, e appoggia l'animale con un piccolo pezzo di polistirolo per livellare il midollo spinale esposto.

Esaminare l'incisione e rimuovere il liquido o il sangue in eccesso utilizzando un batuffolo di cotone. Utilizzare gli assi x e y dell'apparecchio per posizionare la sonda a due millimetri rostrale rispetto al punto centrale del midollo spinale esposto o del punto di lesione e privare la vena centrale. Utilizzare l'asse z per abbassare lentamente la sonda al livello che tocca appena la superficie del midollo spinale.

La sonda deve toccare appena la superficie del midollo spinale, ma non essere così allentata da consentire alla luce intensa di fuoriuscire dal lato del punto di contatto. Il corretto posizionamento è fondamentale per l'adattamento e l'attuazione del protocollo di monitoraggio. La sonda deve essere perpendicolare alla superficie misurata ed evitare una pressione eccessiva.

Per registrare i dati, fare clic sul pulsante Nuovo esperimento nel software per aprire l'interfaccia di configurazione. Sotto l'opzione Generale, controlla la configurazione del sistema, quindi fai clic su Avanti. Nella configurazione del display, selezionare il canale per il flusso sanguigno e la saturazione di ossigeno e fare clic su Avanti.

Immettere le informazioni sul file e fare clic su Avanti per accedere all'interfaccia di registrazione dei dati. Fare clic sul pulsante triangolo verde per avviare la registrazione dei dati dalla sonda. Una volta che il segnale è stabile, registrare i dati per otto minuti consecutivi, quindi sollevare la sonda e rimuovere l'animale dall'apparato stereotassico.

Dopo aver suturato il muscolo e la pelle, posizionare il ratto su un fianco in una gabbia pulita su un termoforo, evitando il contatto tra il sito dell'intervento chirurgico e il fondo della gabbia. Monitorare l'animale fino al risveglio dall'anestesia per assicurarsi che non si verifichino sanguinamenti post-operatorie e che le suture rimangano chiuse. Queste immagini rappresentano l'imaging del flusso del midollo spinale del gruppo fittizio a sinistra e del gruppo con lesione del midollo spinale a destra.

L'imaging del flusso ha dimostrato che la lesione del midollo spinale induce una riduzione del flusso sanguigno e che il flusso sanguigno dell'epicentro era inferiore a quello del midollo rostrale e del midollo caudale. Queste immagini mostrano il flusso sanguigno alternato lungo l'asse rostrale-caudale del midollo spinale del gruppo sham a sinistra e del gruppo SCI a destra. Come mostrato qui, il flusso sanguigno del midollo spinale del gruppo con lesione del midollo spinale è diminuito significativamente rispetto al gruppo fittizio.

Allo stesso tempo, la saturazione di ossigeno del midollo spinale era notevolmente più bassa dopo la commozione cerebrale del midollo spinale, il che era coerente con il cambiamento del flusso sanguigno dopo la lesione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare il flusso sanguigno del midollo spinale utilizzando sia l'imaging di perfusione laser doppler che il monitoraggio della perfusione laser doppler. Una volta padroneggiato, l'intervento chirurgico di introduzione della lesione del midollo spinale può essere eseguito in 20 minuti e le misurazioni, compreso l'uso di entrambi gli strumenti laser doppler, richiederanno circa 20 minuti se eseguite correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una copertura non riflettente con una finestra per esporre solo l'area chirurgica per ridurre ulteriormente lo sfondo e segnare la direzione dell'animale. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microcircolazione per esplorare i cambiamenti del flusso sanguigno per la sua valutazione faramacodinamica e farmacocinetica.