Name: Sintesi di nanocristalli di Upconversion drogato con lantanidi Core-shell per applicazioni cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Scopri la sintesi di nanocristalli upconversion core-shell drogati con lantanidi mediante co-precipitazione ad alta temperatura. Questo metodo consente modifiche superficiali biocompatibili per applicazioni cellulari e regolazione di canali ionici.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato da NTU-AIT-MUV NAM/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) e (RG 35/15) assegnato a Nanyang Technological University, Singapore e National Natural Science Foundation di Cina (NSFC) (No. 51628201).

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue la sintesi di UCNs ad alta temperatura (~ 290 ° C), compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (ad es., occhiali protettivi, guanti, camice da laboratorio, lunghezza pantaloni e scarpe chiuse).
 1. sintesi di Sorbetto_limone 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristalli core-shell Nd(20%) <ol><li>sintesi di Sorbetto_limone 4: nanostruttura core Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) <ol><li> Preparazione del RE (CH 3 CO 2) 3, soluzione di NaOH, NH 4 F metanolo riserva Nota: le terre rare (ri) ioni lantanidi includono ittrio (Y), itterbio (Yb), Thulium (Tm) e neodimio (Nd).
		<ol><li>Sciogliere 500 mg scandio acetato idrato in 5 mL di metanolo (100 mg/mL), itterbio (III) acetato idrato in 5 mL di metanolo (50 mg/mL), 10 mg Tulio (III) acetato idrato in 1 mL di metanolo (10 mg/mL), di 250 mg e 10 mg al neodimio (III) acetato idrato in 1ml metha Nol (10 mg/mL) in fiale di vetro con un bagno di pulizia ad ultrasuoni per 2 min.</li>
			<li>400mg NaOH in una provetta da centrifuga 50 mL si combinano con 20 mL di metanolo con bagno ad ultrasuoni pulizia per preparare la soluzione di NaOH riserva (20 mg/mL).</li>
			<li>Combinare 600 mg NH 4 F in una provetta da centrifuga 50ml con 30 mL di metanolo con bagno ad ultrasuoni pulizia per preparare la soluzione di riserva di NH 4 F (20 mg/mL). 
			Nota: Inserire la soluzione madre di complessi di lantanidi, NaOH e NH 4 F in flaconcini di vetro, sigillare con parafilm e conservarli in frigorifero a ~ 4 ° C fino a quando necessario. Le soluzioni di riserva di metanolo preparati vengono sostituite una volta ogni 2 settimane.</li>
		</ol></li> <li>Preparazione di Sorbetto_limone 4: Yb/Tm/Nd core nanostruttura <ol><li>Pipettare 3 mL di acido oleico e 7 mL di 1-octadecene in un matraccio da tre colli di 50 mL.</li>
			Soluzione <li>combinare 1.089 mL della soluzione di riserva di Y (CH 3 CO 2) 3, 0,608 mL della soluzione madre Yb (CH 3 CO 2) 3, µ 83,6 l dello stock 3 Tm (CH 3 CO 2), e 128,5 µ l della soluzione madre 3 Nd (CH 3 CO 2) nel pallone.</li>
			<li>Montare un termometro (gamma 0 - 360 ° C) in un matraccio e lasciare che la sua punta toccare la soluzione. Collocare la beuta in un contenitore di vetro con olio di silicone phenylmethyl.</li>
			<li>Riscaldare la soluzione a 100 ° C con una piastra calda per evaporare il metanolo. Collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il metanolo residuo e mantenere la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 minuti mescolando.</li>
			<li>Aumentare la temperatura a 150 ° C e mantenere tale temperatura per 60 min. mantenere una velocità dell'agitatore di 700 giri/min durante la sintesi. 
			Nota: Impostare una moderata velocità di agitazione per evitare spruzzi la soluzione.</li>
			<li>Interrompere la piastra riscaldante e mantenere il matraccio a temperatura ambiente per consentire la soluzione di raffreddare lentamente. 
			Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
			Soluzione di riserva <li>combinare 2 mL di NaOH-metanolo e 2,965 mL di NH 4 F-metanolo soluzione stock in una provetta da centrifuga da 15 mL. Avvitare il tubo con il tappo e mescolare la soluzione potente nel Vortex per 5 s.</li>
			<li>Aggiungi la miscela di F NaOH-NH 4 lentamente nel pallone mediante una pipetta di vetro oltre 5 min.</li>
			<li>Aumentare la temperatura della miscela a 50 ° C e mantenere tale temperatura per 30 min. 
			Nota: Impostare la temperatura a non più di 50 ° C, perché la temperatura elevata promuoverà cristallo nucleazione e crescita.</li>
			<li>Aumentare la temperatura (~ 100 ° C) per evaporare il metanolo e collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il metanolo residuo e mantenere la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 min.</li>
			<li>Cambiare la posizione del rubinetto per riempire il pallone con azoto.</li>
			<li>Aumentare la temperatura di 290 ° C ad una velocità di riscaldamento di ~ 5 ° C/min mantenere la miscela di reazione a 290 ° C per 1,5 h.</li>
			<li>Interrompere la piastra riscaldante e togliere il matraccio per consentire la miscela di reazione raffreddare lentamente a temperatura ambiente mescolando. 
			Attenzione: Fare attenzione della piastra riscaldante con temperatura elevata (&#62; 400 ° C) per evitare gravi ustioni al contatto con la pelle.</li>
			<li>Trasferire il composto in un matraccio in un tubo di centrifuga da 50 mL. Risciacquare il matraccio con 30 mL di etanolo e trasferire la soluzione nella provetta della centrifuga.</li>
			<li>Centrifugare il prodotto a 4.000 × g per 8 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.</li>
			<li>Aggiungere 10 mL di esano per la provetta da centrifuga e ri-disperdere il prodotto con sonicazione (60 kHz, 240 W) per 2 min.</li>
			<li>Aggiungere 30 mL di etanolo al tubo. Rotazione verso il basso il prodotto a 4.000 × g per 8 min e poi scartare il surnatante.</li>
			<li>Ri-disperdere i prodotti solidi sul fondo della provetta da centrifuga con 5 mL di esano. Conservare la soluzione in frigorifero a ~ 4 ° C per un prossimo passo. 
			Nota: L'emissione di upconversion di core-shell UCNs è testato irradiando le soluzioni con un laser di 808 nm (2 W).</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Preparazione di Sorbetto_limone 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: nanocristalli core-shell Nd(20%) <ol><li>combinare 3 mL di acido oleico e 7 mL di 1-octadecene in una boccetta di tre colli da 50 mL. Aggiungere 1,082 mL della soluzione madre 3 Y (CH 3 CO 2) e 2,87 mL della soluzione madre 3 Nd (CH 3 CO 2) nel pallone.</li>
		<li>Aggiungere la nanostruttura nucleo ottenuti (80 mg in 5 mL di esano dal passaggio 1.1.2.18) nel pallone mescolando.</li>
		<li>Montare un termometro (gamma 0 - 360 ° C) in un matraccio e lasciare che la sua punta toccare la miscela. Collocare la beuta in un contenitore di vetro con olio di silicone phenylmethyl.</li>
		<li>Di calore la miscela a 100 ° C nella parte superiore piastra calda per evaporare il metanolo ed esano. Collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il solvente residuo e mantenere la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 minuti mescolando.</li>
		<li>Aumentare la temperatura a 150 ° C e mantenerla per 60 min. Mantieni la velocità dell'agitatore a 700 rpm nella sintesi. 
		Nota: Impostare una moderata velocità di agitazione per evitare spruzzi la soluzione.</li>
		<li>Interrompere la piastra riscaldante e togliere il matraccio per consentire la soluzione raffreddare lentamente a temperatura ambiente. 
		Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
		Soluzione di riserva <li>Pipettare 2 mL di NaOH-metanolo e 2,965 mL di NH 4 F-metanolo soluzione stock in una provetta da centrifuga da 15 mL. Avvitare il tubo con il tappo e mescolare la soluzione potente nel Vortex per 5 s.</li>
		<li>Aggiungi la miscela nel pallone mediante una pipetta di vetro lentamente oltre 5 min.</li>
		<li>Aumentare la temperatura della miscela a 50 ° C e tenerlo a 50 ° C per 30 min. 
		Nota: Impostare la temperatura non supera a 50 ° C perché l'alta temperatura promuoverà cristallo nucleazione e crescita.</li>
		<li>Aumentare la temperatura (~ 100 ° C) per evaporare il metanolo e collegare il pallone per una linea di Schlenk con un collettore di vuoto/gas doppio per rimuovere il metanolo residuo, mantenendo la miscela di reazione sotto vuoto per 2-3 min.</li>
		<li>Cambiare la posizione del rubinetto per riempire il pallone con azoto.</li>
		<li>Aumentare la temperatura di 290 ° C ad una velocità di riscaldamento di ~ 5 ° C/min mantenere la miscela di reazione a 290 ° C per 1,5 h.</li>
		<li>Interrompere la piastra riscaldante e togliere il matraccio per consentire la miscela di reazione raffreddare lentamente a temperatura ambiente mescolando. 
		Attenzione: Fare attenzione della piastra riscaldante con temperatura elevata (&#62; 400 ° C) per evitare gravi ustioni al contatto con la pelle.</li>
		<li>Trasferire il composto in un matraccio in un tubo di centrifuga da 50 mL. Risciacquare il matraccio con 30 mL di etanolo e trasferire la soluzione nella provetta della centrifuga.</li>
		<li>Centrifugare il prodotto a 4.000 × g per 8 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di esano per la provetta da centrifuga e ri-disperdere il prodotto con sonicazione (60 kHz, 240 W) per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL di etanolo al tubo. Rotazione verso il basso il prodotto a 4.000 × g per 8 min e poi scartare il surnatante.</li>
		<li>Ri-disperdere i prodotti solidi sul fondo della provetta da centrifuga con 5 mL di esano. Conservare la soluzione in frigorifero a ~ 4 ° C fino a quando necessario. 
		Nota: L'emissione di upconversion di core-shell UCNs è testato irradiando le soluzioni con un laser di 808 nm (2 W).</li>
	</ol></li></ol> 2. Sintesi di nanostrutture UCNs biocompatibile <ol><li>preparazione di ligando-libero UCNs nanoparticella <ol><li>combinare 30 mL di etanolo con la come-preparato oleato-capped UCNs soluzione (passo 1.2.18) in una provetta da centrifuga 50 mL. Centrifugare la miscela a 4.000 × g per 8 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante.</li>
		<li>Combinare 10 mL di soluzione acquosa acida (pH = 4) regolata da HCl (0,1 M) con il precipitato in 50 mL provetta e sciogliere il precipitato di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 30 min.</li>
		<li>Trasferimento la soluzione in un bicchiere flaconcino con vigorosa agitazione per 2 h.</li>
		<li>Estrarre la soluzione acquosa con 30 mL di etere etilico per rimuovere l'acido oleico, ripetere tre volte.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di acqua negli strati etere combinato con agitazione delicata.</li>
		<li>Raccogliere l'acquoso fase insieme (20 mL) e aggiungere 20 mL di acetone con vortex per 5 s.</li>
		<li>Spin giù il prodotto a 35.000 × g per 10 min e poi scartare il surnatante. Sciogliere il precipitato in 2 mL di acqua.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione del polimero per volta UCNs (PAA-UCNs) <ol><li>combinare 200 mg di acido poliacrilico (PAA, Mw = 1.800) con 20 mL di acqua di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 20 minuti aggiungere il suddetto UCNs ligando-libero nella soluzione PAA con agitazione vigorosa.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.4 di soluzione di NaOH (1 M) con sonicazione (60 kHz, 240 W) per 30 min. di mantenere la miscela per 24 h a temperatura ambiente mescolando.</li>
		<li>Raccogliere il precipitato mediante centrifugazione a 35.000 × g per 10 min. Risospendere il prodotto in 10 mL di acqua di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 5 min e centrifugare nuovamente a 35.000 × g per 10 min. Ripetere questa operazione tre volte.</li>
		<li>Ri-disperdere il prodotto in 8 mL di acqua di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 5 min. conservare la soluzione in frigorifero a ~ 4 ° C fino a quando necessario.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione di funzionale DBCO-UCNs nanoparticella <ol><li>Spin-down il PAA@UCNs come preparato (1 mg) mediante centrifugazione a 35.000 × g per 10 min. Risospendere il precipitato in 1ml secco DMF di sonicazione (60 kHz, 240 W) per 1 min e centrifugare nuovamente a 35.000 × g per 10 min. Ripetere questo passaggio due volte.</li>
		<li>Sciogliere il precipitato in 200 µ l a secco DMF in un flaconcino di vetro. Aggiungere HOBT (12,2 mg), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5 mg) e DIPEA (16 µ l) nel flaconcino con agitazione magnetica per 24 h.</li>
		<li>Raccogliere il prodotto mediante centrifugazione a 35.000 × g per 10 min. eliminare il surnatante e risospendere il precipitato in 1 mL di DMSO e centrifugare nuovamente a 35.000 × g per 10 min. Ripetere questa operazione tre volte.</li>
		<li>Disperdere il prodotto in 0,2 mL di DMSO e conservare in frigorifero a ~ 4 ° C prima dell'uso.</li>
	</ol></li></ol> 3. Bioapplications di DBCO-UCNs nel regolamento dei canali di membrana in cellule viventi <ol><li>cultura il HEK293 cellule in Dulbecco &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) completati con 10% FBS, 100 unità/mL penicillina, 100 µ g/mL di streptomicina e mantenere in un incubatore umidificato con 5% CO 2 al 37 cellule di ° C. Seed 1 × 10 5 in 1 mL DMEM/pozzetto in un piatto di 12-pozzetti e tenerlo in incubatrice per 24 h.</li>
	<li>Combinare il plasmide (pCAGGS-ChR2-Venus, 1 µ g) con reagente di transfezione P3000 (2 µ l) in Eagle &#39; s Media essenziale minimo (MEM) (100 µ l) in microcentrifuga tubo A e aggiungere il reagente di transfezione (1,5 µ l) nella MEM (100 µ l) nel tubo B. </li> <li>Incubare la miscela di soluzioni in tubi A e B per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Combinare la soluzione nel tubo A e B con 400 µ l MEM. Lavare le cellule con 1 mL DMEM privo di siero due volte.</li>
	<li>Aggiungere la miscela di transfezione di 600 µ l in ogni pozzetto di una piastra 12-pozzetti e incubare le cellule all'incubatore 37 ° C per 4 h. Rimuovi il supporto e lavare due volte con 1 mL DMEM.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL DMEM contenente 1 µ l Ac 4 ManNAz (50 mM in DMSO) nel pozzo e tenerlo in incubatrice per 2 giorni.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e lavare una volta con 1 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) in ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti e incubare a 37 ° C fino a quando le cellule hanno staccato (~ 2 min). Ri-cultura le cellule in un piatto confocale a 1 × 10 5 cellule/pozzetto in 1ml DMEM per una notte.</li>
	<li>Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL fresco DMEM con 2 µ l DBCO-UCNs (50 mg/mL) nel piatto per 2 ore a 37 ° C. Per formazione immagine confocal, lavare le cellule due volte con DMEM e aggiungere 1 µ l Rhod-N 3 (10 mM) per 30 min.</li>
	<li>Per l'analisi di calcio intracellulare, incubare le cellule con la miscela di 1 µ l Rhod-3 AM (10 mM), 10 µ l Probenecid (250 mM) e 10 µ l di tampone di caricamento (Pluronic tensioattivo polyols,0.1% w/v)) in 1 mL di terreno DMEM per 30 min al buio.</li>
	<li>Lavare le cellule con DMEM privo di siero e irradiare con luce NIR 808 nm al dosaggio di 0,8 W/cm 2 per 20 minuti (5 minuti di pausa dopo 5 min illuminazione).</li>
	<li>Registrare i risultati di imaging il microscopio confocale (fonte di laser: laser di 561 nm; rivelatore gamma: 610/75 nm; obiettivo: 100 x 1.4 NA olio, tempo di esposizione: 100 ms). Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0,25%) in ogni pozzetto e incubare a 37 ° C fino a quando le cellule hanno staccato (~ 2 min). Risospendere le cellule in 1 mL di PBS per citometria a flusso (FCM) (Ex: 561 nm, Em: 582/15 nm).</li>
</ol>

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</ol>

Non abbiamo nulla di divulgare.

Questo articolo presenta un metodo per la sintesi di nanocristalli core-shell drogato con lantanidi upconversion (UCNs) e la loro modificazione superficiale con molecole funzionali per applicazioni cellulari. Questo nanomateriale romanzo possiede eccellenti proprietà ottiche, che possono emettere UV e luce visibile eccitazione luce NIR attraverso un processo Multi-photon upconversion. In questo protocollo, il core-shell UCNs nanostrutture (Sorbetto_limone4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) son...

Negli ultimi anni, drogato con lantanidi upconversion nanocristalli (UCNs) sono stati ampiamente utilizzati come alternativa ai coloranti organici convenzionali e punti quantici in applicazioni biomediche, che sono principalmente basate sul loro proprietà ottiche e chimiche eccezionali, tra cui ottima biocompatibilità, elevata resistenza al photobleaching e larghezza di banda stretta emissione1,2,3. Ancora più importante, possono servire come un promettente nanotransducer con tessuto eccellente penetrazione profondità in vivo per convertire vicino infrarosso (NIR) di eccitazione in una vasta gamma delle emissioni da UV, visibile e le regioni NIR attraverso un multi-fotone upconversion processo4,5. Queste proprietà uniche rendono drogato con lantanidi UCNs servire come un vettore particolarmente promettente per rilevamento biologico, imaging biomedico e malattie teranostica6,7,8.
Le componenti generali di UCNs si basano principalmente sugli ioni lantanidi drogati in matrice dell'ospite isolanti contenenti un sensibilizzante (ad es., Yb3 +, Nd3 +) e un attivatore (ad es., Tm3 +, Er3 +, Ho 3 +) all'interno del cristallo in modo omogeneo9. L'emissione ottica diversa da nanocristalli è attribuita alla transizione elettronica localizzata all'interno gli orbitalif 4 dei droganti lantanidi a causa della loro scala-come organizzato energia livello10. Pertanto, è fondamentale per controllare con precisione le dimensioni e la morfologia delle UCNs sintetizzato con droganti multicomponente lantanidi. Dalla destra, alcuni metodi promettenti sono state ben stabilite per la preparazione di UCNs drogato con lantanidi, tra cui decomposizione termica, ad alta temperatura co-precipitazione, sintesi idrotermale, elaborazione di sol-gel, ecc.11 , 12 , 13 tra questi approcci, il metodo ad alta temperatura co-precipitazione è una delle strategie più popolare e conveniente per UCNs sintesi, che può essere controllato rigorosamente per preparare desiderata qualità nanocristalli con forma regolare e distribuzione delle dimensioni in un relativamente breve tempo di reazione e di basso costo14. Tuttavia, la maggior parte delle nanostrutture sintetizzati da questo metodo sono limitati principalmente con ligandi idrofobici come acido oleico e oleilammina, che in genere ostacolano la loro ulteriore bioapplication a causa della limitata solubilità ligando idrofobico in soluzione acquosa 15. di conseguenza, è necessario eseguire tecniche di modificazione superficiale adatto per preparare UCNs biocompatibile in applicazioni biologiche in vitro ed in vivo.
Qui, presentiamo la dettagliata procedura sperimentale per la sintesi di nanostrutture UCNs core-shell attraverso il metodo ad alta temperatura co-precipitazione e una tecnica di modificazione fattibile per funzionalizzare polimero biocompatibile sulla superficie UCNs per Ulteriori applicazioni cellulari. Questo nanoplatform UCNs incorpora tre ioni lantanidi (Yb3 +, Nd3 +e Tm3 +) in nanocristalli di acquisire forte emissione blu (~ 480 nm) al momento di eccitazione luce NIR a 808 nm, che ha una maggiore profondità di penetrazione in tessuto vivente. È ben noto che Nd3 +-drogati UCNs visualizzare gli effetti di assorbimento e surriscaldamento acqua ridotta a icona questa finestra spettrale (808 nm) rispetto ai convenzionali UCNs su 980 nm irradiazione16,17, 18. Inoltre, per utilizzare le UCNs nei sistemi biologici, i ligandi idrofobici (acido oleico) sulla superficie delle UCNs in primo luogo vengono rimossi tramite sonicazione in soluzione acida19. Quindi le UCNs privo di ligando vengono ulteriormente modificati con un polimero biocompatibile (acido poliacrilico, PAA) di acquisire grande solubilità in soluzioni acquose20. Inoltre, come un proof-of-concept in applicazioni cellulari, le UCNs idrofili sono ulteriormente funzionalizzati con ligandi molecolare (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) per la localizzazione specifica sul N3-etichetta della membrana cellulare. Al momento di luce NIR (808 nm) irradiazione, l'emissione di upconverted blu a 480 nm può efficacemente attivare una proteina canale luce-gated, channelrhodopsin-2 (ChR2), sulla cella la superficie e così facilitare l'afflusso di cationi (ad esempio, agli ioni di Ca2 + ) attraverso la membrana delle cellule viventi.
Questo video protocollo fornisce una metodologia fattibile per drogati lantanidi UCNs sintesi, modificazione superficiale biocompatibile e UCNs bioapplication in cellule viventi. Eventuali differenze nelle tecniche di sintesi e reagenti chimici utilizzati in nanocristallo crescita influenzerà gli spettri di luminescenza (UCL) dimensione upconversion, morfologia e distribuzione delle nanostrutture di UCNs finale utilizzata negli esperimenti di cella. Questo protocollo dettagliato dei video è disposta ad aiutare nuovi ricercatori in questo campo per migliorare la riproducibilità delle UCNs con il metodo ad alta temperatura co-precipitazione ed evitare gli errori più comuni in UCNs biocompatibile modificazione superficiale per ulteriori applicazioni cellulari.

<table><tbody><tr><td>1-Octadecene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O806</td> Acido oleico <td>di grado tecnico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>364525</td><td>Grado tecnico</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td>Etanolo di grado tecnico</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A405</td><td>Grado tecnico</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18</td><td>Grado tecnico</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H292</td><td>Grado tecnico</td></tr><tr><td>Tulio acetato (III) idrato (Tm(CH3CO2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367702</td><td>99,9% di metalli in tracce</td></tr><tr><td>idrato di acetato di neodimio (III) (Nd(CH3CO2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>325805</td><td>99,9% di metalli in tracce base</td></tr><tr><td>Acetato di itterbio (III) idrato (Yb(CH3CO2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>326011</td><td>99,9% di metalli in tracce base</td></tr><tr><td>Acetato di ittrio (III) idrato (Y(CH3CO2)3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>326046</td><td>99,9% di metalli in tracce base</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma Grado</td><td>reagente</td>Aldrich <td>S5881</td></tr><tr><td>Fluoruro di ammonio (NH4F)</td><td>Reagente Sigma Aldrich</td><td>338869</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td>Acido poliacrilico <td>di grado reagente</td> <td>Fisher Scientific</td><td>A144</td></tr><tr><td>(PAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td>medio Mw 1800</td></tr><tr><td>1-idrossibenzotriazolo idrato (HOBT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54802</td><td>Reagente ACS</td></tr><tr><td>1-etil-3-(3-dimetilamminopropil)carbodiimmide cloridrato (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td></td></tr><tr><td>dibenzocicloottinano-ammina di grado commerciale (DBCO-NH2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761540</td><td>reagente ACS</td></tr><tr><td>N,N-diisopropiletilammina (DIPEA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>reagente ACS</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td>Linea</td></tr><tr><td>cellulare HEK293</td> di grado tecnico <td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td>rene embrionale umano</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Reagente Sigma Aldrich</td><td>F1051</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>10.000 U / mL</td></tr><tr><td>plasmide (pCAGGS-ChR2-Venus)</td><td>Addgene</td><td>15753</td><td>Plasmide inviato come batteri in agar stab</td></tr><tr><td>DulbeccoThermo Fisher 11965092 Eagle Medium</td><td></td><td></td> modificato ad <td>alto contenuto di glucosio</td></tr><tr><td>(MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>51985034</td><td>Terreni a siero ridotto</td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reagente di trasfezione</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td>Trasfezione a base di lipidi</td></tr><tr><td>N-azidoacetilmannosamina, acetilata (Ac4ManNAz)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7605</td><td>Reagente ACS</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td>Rosso fenolo</td></tr><tr><td>Rhod-3 AM Kit di imaging del calcio</td><td>Thermo Fisher</td><td>R10145</td><td>Colorante a fluorescenza</td></tr><tr><td>5-carbossitetrametilrodamina azide (Rhod-N3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>760757</td><td>Azide-fluor 545</td></tr><tr><td>Piatto confical</td><td>ibidi GmbH</td><td>81158</td><td>Fondo in vetro, 35 mm</td></tr><tr><td>Provette coniche da centrifuga da 50 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Polipropilene</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td>616201 Olio</td></tr><tr>di<td>silicone fenilmetilico</td><td>in polipropilene Prodotti Clearco</td><td>63148-52-7</td><td>Meno di 320 gradi Celsius</td></tr><tr><td>Termometro in vetro</td><td>GH Zeal</td><td>L0111/10</td><td>Da -10 a 360 gradi Celsius</td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z707775</td><td>Polistirene</td></tr></tbody></table>

sintesi di nanocristalli di upconversion drogato con lantanidi core-shell per applicazioni cellulari

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Drogato con lantanidi upconversion nanocristalli (UCNs) hanno attirato molta attenzione negli ultimi anni sulla loro proprietà ottiche promettente e controllabile, che favoriscono l'assorbimento della luce di vicino infrarosso (NIR) e poterla convertire successivamente in base multiplexing delle emissioni che si estendono su una vasta gamma di regioni dal UV al visibile al NIR. Questo articolo presenta dettagliate procedure sperimentali per la sintesi ad alta temperatura co-precipitazione di core-shell UCNs che incorporano gli ioni lantanidi differenti in nanocristalli per la conversione efficiente di eccitazione di deep tissue penetrabile NIR (808 Nm) in una forte emissione blu a 480 nm. Controllando la modificazione superficiale con polimero biocompatibile (acido poliacrilico, PAA), il preparato come UCNs acquisisce grande solubilità in soluzioni tampone. I nanocristalli idrofili sono ulteriormente funzionalizzati con ligandi specifici (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) per la localizzazione sulla membrana cellulare. Al momento di luce NIR (808 nm) irradiazione, l'emissione di upconverted blu può efficacemente attivare la proteina canale luce-gated sulla membrana cellulare e specificamente regolare l'afflusso di cationi (ad esempio, Ca2 +) nel citoplasma. Questo protocollo fornisce una metodologia fattibile per la sintesi di core-shell drogato con lantanidi UCNs e successive modificazione superficiale biocompatibile per ulteriori applicazioni cellulari.

Il processo di sintesi schematica di core-shell drogato con lantanidi UCNs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) di microscopia immagini di nanostrutture UCNs core e core-shell sono stati raccolti rispettivamente (Figura 1). Il ligando-libero UCNs sono preparati rimuovendo l'acido oleico idrofoba sulla su...

Un protocollo è presentato per la sintesi di nanocristalli core-shell drogato con lantanidi upconversion (UCNs) e le loro applicazioni cellulare per regolazione della proteina canale su illuminazione a luce vicina all'infrarosso (NIR).

Sintesi di nanocristalli di Upconversion drogato con lantanidi Core-shell per applicazioni cellulari

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanocristalli di conversione drogati con lantanidi core-shell basati su un approccio di co-precipitazione ad alta temperatura e eseguire modifiche superficiali biocompatibili che consentano ulteriori applicazioni cellulari. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha sviluppato una conversione di nanocristalli drogata con lantanidi davvero unica, che ha indicato proprietà ottiche davvero uniche, in modo che possano assorbire la luce infrarossa a lunghezza d'onda lunga e fondamentalmente convertire questa luce in emissioni multicolori a breve gamma di lunghezze d'onda, compresi i raggi UV visibili fino alle finestre di luce infrarossa. Tali strutture nanocristalline uniche hanno indicato proprietà molto promettenti per applicazioni biomediche.Questo metodo fornisce un approccio fattibile per la sintesi di nanostrutture di upconversion core-shell e la loro tecnica di modifica della superficie biocompatibile per la regolazione delle proteine del canale di membrana light-gate dopo l'illuminazione della luce nel vicino infrarosso. Per iniziare la procedura, preparare le soluzioni madre dei complessi di acetato di terre rare nel metanolo. Preparare soluzioni da 20 milligrammi per millilitro di idrossido di sodio e fluoruro di ammonio in metanolo.Conservare le soluzioni stock a quattro gradi Celsius. Quindi, pipettare tre millilitri di acido oleico e sette millilitri di 1-ottadecene in un pallone da 50 millilitri, a tre colli, a fondo tondo. A questo si aggiungono 1,089 millilitri della soluzione di acetato di ittrio, 0,608 millilitri della soluzione di acetato di itterbio, 83,6 microlitri della soluzione di acetato di tulio e 128,5 microlitri della soluzione di acetato di neodimio.Equipaggia la fiaschetta con una barra di agitazione e un termometro. Scaldare il pallone a 100 gradi Celsius in un bagno d'olio mescolando fino a quando il metanolo non sarà evaporato. Quindi, collegare il pallone a una linea Schlenk e pompare il pallone per due o tre minuti per rimuovere il metanolo residuo.Quindi, mettere il pallone in un'atmosfera di azoto. Scaldare la miscela di reazione a 150 gradi Celsius per un'ora mescolando a 700 giri/min. Quindi, lasciare raffreddare il composto a temperatura ambiente.Quindi, mettere in una provetta da centrifuga da 15 millilitri due millilitri della soluzione madre di idrossido di sodio e 2,965 millilitri della soluzione madre di fluoruro di ammonio. Tappare bene il tubo e agitare la miscela di idrossido di sodio e fluoruro di ammonio per cinque secondi. Nel corso di cinque minuti, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere lentamente la miscela di idrossido di sodio-fluoruro di ammonio al pallone di reazione mescolando.Quindi, riscaldare la miscela di reazione a non più di 50 gradi Celsius. Mantieni il composto a quella temperatura per 30 minuti. Quindi, scaldare la miscela a 100 gradi Celsius per far evaporare il metanolo.Collegare il pallone alla linea Schlenk e rimuovere il metanolo residuo sotto vuoto per due o tre minuti. Riempire il pallone con azoto gassoso e riscaldare la miscela di reazione a 290 gradi Celsius a cinque gradi Celsius al minuto. Mantieni la miscela a una temperatura o leggermente superiore a 290 gradi Celsius per 1,5 ore.Quindi, lasciare raffreddare il composto a temperatura ambiente mescolando. Trasferire la miscela di prodotti in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Sciacquare il residuo nel tubo con 30 millilitri di etanolo.Centrifugare la miscela a 4.000 volte g per otto minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e disperdere i solidi in 10 millilitri di esani mediante sonicazione per due minuti. Aggiungere 30 millilitri di etanolo alla dispersione, centrifugare nuovamente la miscela nelle stesse condizioni e scartare il surnatante.Disperdere i solidi in cinque millilitri di esani e conservare la dispersione a quattro gradi Celsius. Controllare l'emissione upconvertita della soluzione UCNs core-shell dopo l'irradiazione laser a 808 nanometri al buio. Per iniziare a preparare UCN modificati con DBCO, lavare i nanocristalli core-shell preparati in 30 millilitri di etanolo mediante centrifugazione.Scartare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di una soluzione acquosa a pH quattro di acido cloridrico. Sonicare la miscela per 30 minuti per sciogliere i solidi. Trasferire il composto in una fiala di vetro e mescolare energicamente per due ore.Quindi, lavare la miscela con quattro porzioni da 30 millilitri di etere etilico. Unire le frazioni di etere e mettere da parte lo strato acquoso lavato. Recupera le UCN prive di ligandi in tracce dagli strati eterici con 10 millilitri di acqua deionizzata e combina gli strati acquosi.Aggiungere 20 millilitri di acetone agli strati acquosi combinati e agitare la miscela per cinque secondi. Centrifugare il composto a 35.000 volte g per 10 minuti. Scartare il surnatante e sciogliere il precipitato in due millilitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione di UCN privi di ligando.Successivamente, sciogliere 200 milligrammi di acido poliacrilico in 20 millilitri di acqua deionizzata mediante sonicazione per 20 minuti. A questo si aggiunge la soluzione di UCN privi di ligando mescolando energicamente. Regolare il pH della miscela a 7,4 con una soluzione monomolare di idrossido di sodio.Sonicare la miscela per 30 minuti e mescolare la miscela per 24 ore a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare la miscela a 35.000 volte g per 10 minuti. Lavare i solidi per centrifugazione in 10 millilitri di acqua deionizzata per quattro volte.Disperdere i solidi lavati in otto millilitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione di 10 milligrammi per millilitro di UCN modificate con polimero. Centrifugare un milligrammo di UCN modificato con polimero a 35.000 volte g per 10 minuti. Conservare la soluzione rimanente a quattro gradi Celsius.Lavare i solidi per centrifugazione in porzioni da un millilitro di DMF secco per tre volte. Quindi, sciogliere il precipitato in 200 microlitri di DMF secco. Aggiungere a questa soluzione 12,2 milligrammi di HOBT, 14 milligrammi di EDC, cinque milligrammi di DBCO-ammina e 16 microlitri di DIPEA.Mescolare il composto a temperatura ambiente per 24 ore. Quindi, centrifugare il composto per 10 minuti a 35.000 volte g. Lavare i solidi quattro volte mediante centrifugazione in porzioni da un millilitro di DMSO.Disperdere gli UCN DBCO-modificati in 0,2 millilitri di DMSO e conservare la dispersione a quattro gradi Celsius. Innanzitutto, seminare una volta 10 delle quinte cellule HEK293 in una piastra a 12 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, in una provetta da microcentrifuga, combinare un microgrammo del plasmide scelto con due microlitri di agente di trasfezione P3000 in 100 microlitri di MEM.In un'altra provetta da microcentrifuga, combinare 1,5 microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di MEM. Incubare entrambe le miscele a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, unire le miscele e aggiungere 400 microlitri di MEM a basso contenuto di siero.Successivamente, lavare le cellule incubate due volte con porzioni da un millilitro di DMEM privo di siero. Distribuire la miscela di trasfezione da 600 microlitri nei pozzetti della piastra a 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore.Quindi, rimuovere il terreno e lavare le cellule due volte con porzioni da un millilitro di DMEM. Distribuire tra i pozzetti un millilitro di una soluzione di N-azidoacetil-mannosamina tetra-acetil-tetra-acetil-mannosamina in DMEM. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due giorni.Quindi, lavare, tripsinizzare e ricoltivare le cellule in un piatto confocale durante la notte. Successivamente, sostituire il terreno con un millilitro di DMEM fresco contenente due microlitri di una soluzione da 50 milligrammi per millilitro di DBCO-UCN. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore e lavare le cellule due volte con DMEM.Spegnere la luce della cappa aspirante e aggiungere le soluzioni tampone dieniche appropriate alle cellule per l'imaging del calcio, quindi incubare le cellule per 30 minuti al buio. Lavare le cellule con DMEM senza siero. Irradiare le celle con luce nel vicino infrarosso a 808 nanometri che fornisce 0,8 watt per centimetro quadrato.Alternare cinque minuti di irradiazione con pause di cinque minuti fino a quando le cellule non sono state irradiate per 20 minuti. Visualizzare le cellule con un microscopio confocale. La microscopia elettronica a trasmissione delle UCN core e core-shell ha mostrato strutture sferiche con uno spessore del guscio di circa cinque nanometri.La TEM ad alta risoluzione ha mostrato una spaziatura d coerente con nanostrutture altamente cristallizzate. A seguito della modifica della superficie, le UCN sono state facilmente disperse in soluzione tampone. La diffusione dinamica della luce ha indicato che il diametro idrodinamico delle DBCO-UCN in soluzione acquosa è di circa 96 nanometri.I potenziali zeta degli UCN PAA e DBCO-modificati indicano superfici caricate negativamente, che sono coerenti con la solubilità e la stabilità in soluzioni tampone acquose. I test di emissione convertiti hanno mostrato che gli UCN modificati con PAA e DBCO avevano gli stessi modelli di emissione degli UCN core-shell di base quando irradiati con luce a 808 nanometri. Per testare le bioapplicazioni dei DBCO-UCN sono state utilizzate cellule HEK293 marcate con azide che esprimono proteine canale light-gated.La localizzazione delle UCN ai tag azidici è stata attribuita ai gruppi DBCO colorati con un colorante contenente azide. Quando queste cellule sono state esposte alla luce del vicino infrarosso, le DBCO-UCN hanno facilitato il flusso di ioni calcio attraverso la membrana cellulare, come dimostrato dall'imaging confocale e dalla citometria a flusso con un indicatore di calcio fluorescente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i nanocristalli di upconversion core-shell con modifica della superficie biocompatibile e le loro ulteriori applicazioni biologiche per attivare il canale ionico light-gated nelle cellule viventi seguendo questa procedura.

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JoVE Journal

Chemistry

Chimica

Dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura di cellule staminali embrionali umane in vitro con la seconda nanoparticelle generano armoniche. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiache sono anche presentati.

Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca

Le molecole di colorante organico e le nanoparticelle di conversione rivestite di acido oleico non sono solubili in acqua. Questo protocollo descrive un metodo "plug and play" che consente il trasferimento di molecole di colorante organico e particelle di upconverting dal loro solvente idrofobico iniziale all'acqua.

Un metodo &#39;Plug and Play&#39; per creare Nanoassemblies acqua dispersibile contenenti un polimero Amphiphilic, coloranti organici e Upconverting nanoparticelle

Viene eseguita la sintesi di nanoparticelle d'oro uniformi rivestite con gusci semiconduttori di CdS o ZnS. Il rivestimento del semiconduttore viene condotto depositando prima un guscio di solfuro d'argento e scambiando i cationi d'argento con cationi di zinco o cadmio.

Sintesi, Caratterizzazione, e funzionalizzazione di ibrida UA / CdS e Au / ZnS core / shell nanoparticelle

In questo protocollo, gabbia della proteina chinasi A (PKA), un bioeffector di trasduzione del segnale cellulare, era immobilizzata su una superficie di nanoparticelle, microiniettata nel cytosol e attivata da upconverted UV luce da irradiazione di vicino infrarosso (NIR), che inducono disintegrazione di fibra a valle dello stress nel citosol.

Un sistema integrato di attivare remotamente la trasduzione del segnale intracellulare di fotoattivazione Upconversion Nanoparticle-mediata della chinasi

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Qui presentiamo un protocollo per ottenere dati di imaging iperspettrale luminescente e per analizzare le caratteristiche di anisotropia ottica dei singoli cristalli a base di lanthanide utilizzando un sistema di imaging iperspettrale.

L'imaging iperspettrale come strumento per studiare l'anisotropia ottica nei cristalli singoli molecolari basati sul Lanthanide

Questo protocollo descrive in dettaglio la sintesi di nanocapsule upconversion per il successivo utilizzo in resine fotopolimerizzabili per la stampa 3D volumetrica facilitata dalla tripletta fusion upconversion.

Tripletta Fusione Upconversion Nanocapsule Sintesi

Qui, dimostriamo un protocollo per la sintesi in due fasi di gusci di nuclei monocristallini utilizzando una coppia metallo-struttura organica (MOF) non isostrutturale, HKUST-1 e MOF-5, che hanno reticoli cristallini ben abbinati.

Sintesi di strutture metallo-organiche monocristalline core-shell

Viene presentato un protocollo per la sintesi di nanomateriali luminescenti persistenti (PLNP) e le loro potenziali applicazioni in display riscrivibili e processi artistici utilizzando l'effetto afterglow sotto irradiazione di luce ultravioletta (365 nm).

Sintesi di nanoparticelle luminescenti persistenti per display riscrivibili e applicazioni di illuminazione

Questo studio indaga le misurazioni ottiche standard di due ceramiche luminescenti persistenti: SAO-B (blu) e SAO-G (verde), come la termoluminescenza (TL) e la luminescenza persistente (PersL). Controllando la profondità della trappola elettronica, questo lavoro innova metodi dinamici anti-contraffazione 'a risoluzione della temperatura' e 'risolti nel tempo'.

Controllo dipendente dalla fase della profondità della trappola e della luminescenza persistente nei fosfori di aluminato di stronzio

Scopri la sintesi di nanocristalli upconversion core-shell drogati con lantanidi mediante co-precipitazione ad alta temperatura. Questo metodo consente modifiche superficiali biocompatibili per applicazioni cellulari e regolazione di canali ionici.

Sintesi di nanocristalli di Upconversion drogato con lantanidi Core-shell per applicazioni cellulari

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