Sintesi di nanocristalli di Upconversion drogato con lantanidi Core-shell per applicazioni cellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è sintetizzare nanocristalli di conversione drogati con lantanidi core-shell basati su un approccio di co-precipitazione ad alta temperatura e eseguire modifiche superficiali biocompatibili che consentano ulteriori applicazioni cellulari. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha sviluppato una conversione di nanocristalli drogata con lantanidi davvero unica, che ha indicato proprietà ottiche davvero uniche, in modo che possano assorbire la luce infrarossa a lunghezza d'onda lunga e fondamentalmente convertire questa luce in emissioni multicolori a breve gamma di lunghezze d'onda, compresi i raggi UV visibili fino alle finestre di luce infrarossa. Tali strutture nanocristalline uniche hanno indicato proprietà molto promettenti per applicazioni biomediche.

Questo metodo fornisce un approccio fattibile per la sintesi di nanostrutture di upconversion core-shell e la loro tecnica di modifica della superficie biocompatibile per la regolazione delle proteine del canale di membrana light-gate dopo l'illuminazione della luce nel vicino infrarosso. Per iniziare la procedura, preparare le soluzioni madre dei complessi di acetato di terre rare nel metanolo. Preparare soluzioni da 20 milligrammi per millilitro di idrossido di sodio e fluoruro di ammonio in metanolo.

Conservare le soluzioni stock a quattro gradi Celsius. Quindi, pipettare tre millilitri di acido oleico e sette millilitri di 1-ottadecene in un pallone da 50 millilitri, a tre colli, a fondo tondo. A questo si aggiungono 1,089 millilitri della soluzione di acetato di ittrio, 0,608 millilitri della soluzione di acetato di itterbio, 83,6 microlitri della soluzione di acetato di tulio e 128,5 microlitri della soluzione di acetato di neodimio.

Equipaggia la fiaschetta con una barra di agitazione e un termometro. Scaldare il pallone a 100 gradi Celsius in un bagno d'olio mescolando fino a quando il metanolo non sarà evaporato. Quindi, collegare il pallone a una linea Schlenk e pompare il pallone per due o tre minuti per rimuovere il metanolo residuo.

Quindi, mettere il pallone in un'atmosfera di azoto. Scaldare la miscela di reazione a 150 gradi Celsius per un'ora mescolando a 700 giri/min. Quindi, lasciare raffreddare il composto a temperatura ambiente.

Quindi, mettere in una provetta da centrifuga da 15 millilitri due millilitri della soluzione madre di idrossido di sodio e 2,965 millilitri della soluzione madre di fluoruro di ammonio. Tappare bene il tubo e agitare la miscela di idrossido di sodio e fluoruro di ammonio per cinque secondi. Nel corso di cinque minuti, utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere lentamente la miscela di idrossido di sodio-fluoruro di ammonio al pallone di reazione mescolando.

Quindi, riscaldare la miscela di reazione a non più di 50 gradi Celsius. Mantieni il composto a quella temperatura per 30 minuti. Quindi, scaldare la miscela a 100 gradi Celsius per far evaporare il metanolo.

Collegare il pallone alla linea Schlenk e rimuovere il metanolo residuo sotto vuoto per due o tre minuti. Riempire il pallone con azoto gassoso e riscaldare la miscela di reazione a 290 gradi Celsius a cinque gradi Celsius al minuto. Mantieni la miscela a una temperatura o leggermente superiore a 290 gradi Celsius per 1,5 ore.

Quindi, lasciare raffreddare il composto a temperatura ambiente mescolando. Trasferire la miscela di prodotti in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Sciacquare il residuo nel tubo con 30 millilitri di etanolo.

Centrifugare la miscela a 4.000 volte g per otto minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e disperdere i solidi in 10 millilitri di esani mediante sonicazione per due minuti. Aggiungere 30 millilitri di etanolo alla dispersione, centrifugare nuovamente la miscela nelle stesse condizioni e scartare il surnatante.

Disperdere i solidi in cinque millilitri di esani e conservare la dispersione a quattro gradi Celsius. Controllare l'emissione upconvertita della soluzione UCNs core-shell dopo l'irradiazione laser a 808 nanometri al buio. Per iniziare a preparare UCN modificati con DBCO, lavare i nanocristalli core-shell preparati in 30 millilitri di etanolo mediante centrifugazione.

Scartare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di una soluzione acquosa a pH quattro di acido cloridrico. Sonicare la miscela per 30 minuti per sciogliere i solidi. Trasferire il composto in una fiala di vetro e mescolare energicamente per due ore.

Quindi, lavare la miscela con quattro porzioni da 30 millilitri di etere etilico. Unire le frazioni di etere e mettere da parte lo strato acquoso lavato. Recupera le UCN prive di ligandi in tracce dagli strati eterici con 10 millilitri di acqua deionizzata e combina gli strati acquosi.

Aggiungere 20 millilitri di acetone agli strati acquosi combinati e agitare la miscela per cinque secondi. Centrifugare il composto a 35.000 volte g per 10 minuti. Scartare il surnatante e sciogliere il precipitato in due millilitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione di UCN privi di ligando.

Successivamente, sciogliere 200 milligrammi di acido poliacrilico in 20 millilitri di acqua deionizzata mediante sonicazione per 20 minuti. A questo si aggiunge la soluzione di UCN privi di ligando mescolando energicamente. Regolare il pH della miscela a 7,4 con una soluzione monomolare di idrossido di sodio.

Sonicare la miscela per 30 minuti e mescolare la miscela per 24 ore a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare la miscela a 35.000 volte g per 10 minuti. Lavare i solidi per centrifugazione in 10 millilitri di acqua deionizzata per quattro volte.

Disperdere i solidi lavati in otto millilitri di acqua deionizzata per ottenere una soluzione di 10 milligrammi per millilitro di UCN modificate con polimero. Centrifugare un milligrammo di UCN modificato con polimero a 35.000 volte g per 10 minuti. Conservare la soluzione rimanente a quattro gradi Celsius.

Lavare i solidi per centrifugazione in porzioni da un millilitro di DMF secco per tre volte. Quindi, sciogliere il precipitato in 200 microlitri di DMF secco. Aggiungere a questa soluzione 12,2 milligrammi di HOBT, 14 milligrammi di EDC, cinque milligrammi di DBCO-ammina e 16 microlitri di DIPEA.

Mescolare il composto a temperatura ambiente per 24 ore. Quindi, centrifugare il composto per 10 minuti a 35.000 volte g. Lavare i solidi quattro volte mediante centrifugazione in porzioni da un millilitro di DMSO.

Disperdere gli UCN DBCO-modificati in 0,2 millilitri di DMSO e conservare la dispersione a quattro gradi Celsius. Innanzitutto, seminare una volta 10 delle quinte cellule HEK293 in una piastra a 12 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi, in una provetta da microcentrifuga, combinare un microgrammo del plasmide scelto con due microlitri di agente di trasfezione P3000 in 100 microlitri di MEM.

In un'altra provetta da microcentrifuga, combinare 1,5 microlitri di reagente di trasfezione con 100 microlitri di MEM. Incubare entrambe le miscele a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, unire le miscele e aggiungere 400 microlitri di MEM a basso contenuto di siero.

Successivamente, lavare le cellule incubate due volte con porzioni da un millilitro di DMEM privo di siero. Distribuire la miscela di trasfezione da 600 microlitri nei pozzetti della piastra a 12 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore.

Quindi, rimuovere il terreno e lavare le cellule due volte con porzioni da un millilitro di DMEM. Distribuire tra i pozzetti un millilitro di una soluzione di N-azidoacetil-mannosamina tetra-acetil-tetra-acetil-mannosamina in DMEM. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due giorni.

Quindi, lavare, tripsinizzare e ricoltivare le cellule in un piatto confocale durante la notte. Successivamente, sostituire il terreno con un millilitro di DMEM fresco contenente due microlitri di una soluzione da 50 milligrammi per millilitro di DBCO-UCN. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore e lavare le cellule due volte con DMEM.

Spegnere la luce della cappa aspirante e aggiungere le soluzioni tampone dieniche appropriate alle cellule per l'imaging del calcio, quindi incubare le cellule per 30 minuti al buio. Lavare le cellule con DMEM senza siero. Irradiare le celle con luce nel vicino infrarosso a 808 nanometri che fornisce 0,8 watt per centimetro quadrato.

Alternare cinque minuti di irradiazione con pause di cinque minuti fino a quando le cellule non sono state irradiate per 20 minuti. Visualizzare le cellule con un microscopio confocale. La microscopia elettronica a trasmissione delle UCN core e core-shell ha mostrato strutture sferiche con uno spessore del guscio di circa cinque nanometri.

La TEM ad alta risoluzione ha mostrato una spaziatura d coerente con nanostrutture altamente cristallizzate. A seguito della modifica della superficie, le UCN sono state facilmente disperse in soluzione tampone. La diffusione dinamica della luce ha indicato che il diametro idrodinamico delle DBCO-UCN in soluzione acquosa è di circa 96 nanometri.

I potenziali zeta degli UCN PAA e DBCO-modificati indicano superfici caricate negativamente, che sono coerenti con la solubilità e la stabilità in soluzioni tampone acquose. I test di emissione convertiti hanno mostrato che gli UCN modificati con PAA e DBCO avevano gli stessi modelli di emissione degli UCN core-shell di base quando irradiati con luce a 808 nanometri. Per testare le bioapplicazioni dei DBCO-UCN sono state utilizzate cellule HEK293 marcate con azide che esprimono proteine canale light-gated.

La localizzazione delle UCN ai tag azidici è stata attribuita ai gruppi DBCO colorati con un colorante contenente azide. Quando queste cellule sono state esposte alla luce del vicino infrarosso, le DBCO-UCN hanno facilitato il flusso di ioni calcio attraverso la membrana cellulare, come dimostrato dall'imaging confocale e dalla citometria a flusso con un indicatore di calcio fluorescente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i nanocristalli di upconversion core-shell con modifica della superficie biocompatibile e le loro ulteriori applicazioni biologiche per attivare il canale ionico light-gated nelle cellule viventi seguendo questa procedura.