Stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere l'ablazione stereotassicamente guidata della corteccia uditiva e l'uso di una mappa di coordinate per localizzare la lesione su un'immagine della superficie del cervello. Questo metodo può aiutare i ricercatori delle neuroscienze uditive ad affrontare il ruolo delle corticali nel percorso nella percezione del suono. Così come i meccanismi e la plasticità di posizione della linea.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'esposizione chirurgica e l'ablazione della corteccia uditiva utilizzando metodi di base che possono essere adattati da qualsiasi investigatore. Quindi questo metodo può essere utile nel campo delle neuroscienze uditive, può essere applicato anche in altri sistemi come quello visivo e somatosensoriale. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare i difetti che l'ablazione unilaterale della corteccia uditiva esercita in altre aree corticali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché la corretta identificazione e traduzione delle coordinate stereotassiche nell'osso temporale è essenziale per localizzare con precisione la corteccia uditiva. Per iniziare questa procedura, posizionare il ratto anestetizzato su un termoforo per mantenere la sua temperatura corporea. Quindi stabilizzare la testa dell'animale in un telaio stereotassico utilizzando due barre auricolari e una barra per il morso.

Radere il cuoio capelluto e disinfettare l'area chirurgica con iodio povidone. Usando un bisturi, praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre la superficie del cranio. Successivamente, usa una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente il sangue che copre la superficie del cranio.

Per visualizzare Bregma, Lambda e la linea interaurale, praticare un'incisione nel muscolo temporale vicino alla sua inserzione dorsale sul cranio con un bisturi. Successivamente, estrarre il muscolo utilizzando un ago e un materiale di sutura e fissare il materiale di sutura al telaio stereotassico per esporre l'osso temporale. Abbassare lentamente un ago dritto sterile fino a quando non si trova proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago sia impostata sullo zero interaurale.

Impostate questo punto su zero. Successivamente, punta all'AC usando quattro punti. Quindi abbassa l'ago proprio sopra l'osso temporale per visualizzare ciascuno di questi quattro punti.

Segna i punti con un pennarello sull'osso temporale e collegali in modo da disegnare un rettangolo. Il rettangolo servirà da guida per aprire una finestra nell'osso. In questa procedura, aprire la finestra utilizzando un trapano elettrico e una piccola punta da trapano.

Forare il perimetro del rettangolo a 8.000 giri/min fino a quando l'osso cede. Raffreddare la superficie di foratura risciacquandola con soluzione fisiologica sterile fredda per evitare danni alle strutture sottocorticali. Quando l'osso cede, fai attenzione a non perforare il cervello.

Quando i bordi sono perduti, sollevare l'osso di copertura con una pinza fine e conservarlo in soluzione salina sterile fredda. Utilizzando un microscopio operatorio, tagliare delicatamente le meningi con un bisturi microchirurgico e rimuoverle utilizzando due pinze a punta fine. In caso di sanguinamento, sciacquare il sito chirurgico con soluzione fisiologica sterile fredda.

Successivamente, aspirare delicatamente l'aria condizionata utilizzando un dispositivo di aspirazione chirurgica accoppiato a un ago sterile a punta smussata calibro 20. Aspirare solo i sei strati corticali e non la sostanza bianca sottostante. Questo punto è critico e deve essere eseguito con molta attenzione.

Al termine dell'aspirazione, coprire il sito chirurgico con l'osso estratto e applicare una garza emostatica riassorbibile. Lascia che il muscolo temporale recuperi la sua posizione originale e poi sutura la pelle usando clip per ferite. Successivamente, applica un unguento antibiotico sulla ferita.

Successivamente, iniettare Buprenorfina per via sottocutanea nella parte posteriore del ratto come analgesico, un'ora e otto ore dopo la fine dell'intervento. Tieni l'animale sul termoforo fino a quando non si sveglia e rimettilo nella sua gabbia di alloggiamento per il recupero. Quando la ricerca eseguita con il ratto ablato con AC è completata, anestetizzarlo terminalmente mediante iniezione intraperitoneale di 0,1 millilitri di pentobarbital di sodio.

Dopo aver eseguito una profusione intracardiaca di soluzione di Ringer e formaldeide, rimuovere la pelle e il muscolo dalla testa per esporre il cranio. Usando le forbici Spencer, fai un taglio trasversale nell'osso orbitale. Dopodiché, rimuovi la parte posteriore del cranio e usa i rongeur per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello.

Fai attenzione a non danneggiare il cervello. Una volta che il cervello è esposto, rimuovere con cura la dura madre utilizzando una pinza a punta fine. Usa un dito per raccogliere delicatamente sotto ed elevare il cervello.

Quindi solleva il cervello e taglia i nervi finché non è libero. Successivamente, immergere il cervello in una soluzione di formaldeide e conservarlo a quattro gradi Celsius per 24 ore. Dopo la post-fissazione, posizionare con cura il cervello in una matrice sagittale di cervello di ratto, esponendo la superficie laterale del cervello.

Posiziona una fotocamera a 21 centimetri sopra la superficie della corteccia utilizzando un supporto per fotocamera. Quindi, seleziona la modalità di scatto super-macro e scatta una foto della superficie del cervello. Successivamente, utilizzando un programma di editor di immagini, apri le immagini e ridimensionale del 50%Identifica i riferimenti Bregma, Lambda e zero interaurale e segna la loro posizione nelle immagini.

Disegna il contorno dell'ablazione sull'immagine laterale del cervello. Importa la mappa delle coordinate in cui si trovano le regioni primarie e secondarie della corteccia uditiva nel file del programma di editing. Quindi fare clic sulla mappa e trascinarla per sovrapporla alla fotografia laterale del cervello ablato.

Fare in modo che i riferimenti Bregma e Lambda della mappa delle coordinate coincidano con i riferimenti Bregma e IA identificati nell'immagine del cervello laterale. Successivamente, utilizzare la fessura del Reno come riferimento per adattare l'immagine del cervello alla mappa e farle coincidere. È importante confermare che la sostanza bianca sia intatta.

Questo può essere fatto inizialmente con l'immunocolorazione della sezione seriale del cervello. Per dimostrare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo tenuto i tre ratti AC-ablati sopravvissuti per una settimana e poi abbiamo raccolto le coclee per studiare i cambiamenti nell'espressione delle subunità AMPA più rilevanti presenti nella coclea adulta, GluA2 e GluA3 mediante qPCR. Il confronto tra i trascritti di ratti ablati con AC-ablati e animali di controllo fittizi ha mostrato una sottoregolazione per GluA2 e una sovraregolazione per GluA3 in entrambe le coclee, che è in accordo con il nostro studio precedente.

Durante il tentativo di eseguire l'intervento chirurgico, è importante ricordare tre cose: perforare l'osso temporale alla velocità più bassa con la minima pressione, rimuovere con cura le meningi per evitare di rompere i vasi sanguigni e limitare l'aspirazione alla materia grigia. Una volta padroneggiata, l'esposizione chirurgica e l'ablazione della corteccia uditiva possono essere eseguite in 45 minuti se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti metodi fisiologici, comportamentali e/o immunocitochimici per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come la mancanza della corteccia uditiva influenzi la funzione di ulteriori sistemi sensoriali.