Name: Stereotactically-guida lablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Impara l'ablazione stereotassica della corteccia uditiva nel ratto per studiare la percezione del suono. Questo metodo consente la localizzazione precisa della lesione tramite mappa di coordinate e analisi postmortem.

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Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Ministero dell'economia e competitività (MINECO) del governo di Spagna, SAF2016-78898-C2-2-R.

questo studio è stato effettuato in stretta conformità con entrambi i regolamenti spagnoli (Royal decreto 53/2013 - legge 32/2007) e orientamenti dell'Unione europea (direttiva 2010/63/UE) sull'uso di animali nella ricerca biomedica e manutenzione.
 1. Preparazione del ratto Nota: abbiamo effettuato gli esperimenti in ratti maschii di evitare cambiamenti ormonali.
<ol><li>Anesthetize l'animale utilizzando un mix di ketamina cloridrato (30 mg/kg) e xilazina cloridrato (5 mg/kg) iniettato per via intramuscolare; con questa dose, ratto dovrebbe essere anestetizzato per circa 1 h.</li>
	<li>Pizzicare il ratto &#39; punta s; assenza di un ritiro riflesso indica che l'animale è pienamente cosciente. Se il ratto risponde per il pizzico, dare l'anestesia complementare a un terzo della dose iniziale.</li>
	<li>Radere il cuoio capelluto e disinfettare l'area chirurgica con povidone-iodio.</li>
	<li>Metti l'animale su un rilievo di riscaldamento per mantenere una temperatura di 38 ° C e stabilizzare l'animale &#39; testa di s in una cornice stereotassica utilizzando due orecchio bar e un morso. Usare cautela per evitare piercing la membrana timpanica con le barre di orecchio.</li>
	<li>Proteggono gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico o siero salino per ciascun occhio.</li>
</ol> 2. Posizione di AC nell'osso temporale del ratto <ol><li>usando un bisturi praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre la superficie del cranio.</li>
	<li>Utilizzare una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente qualsiasi sangue che copre la superficie del cranio di visualizzare bregma, lambda e interaural 0 secondo l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto 22.</li>
	<li>Fare un'incisione nel muscolo temporale vicino suo inserimento dorsale sul cranio con un bisturi. Tirare il muscolo utilizzando un ago e sutura materiale e fissare il materiale di sutura alla cornice stereotassica; Questo esporrà l'osso temporale. Caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione salina sterile fredda.</li>
	<li>Inserire un ago sterile dritto nel micromanipolatore stereotassica, assicurandosi che sia completamente fissato.</li>
	<li>Abbassare lentamente l'ago fino a quando non è proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago è impostata su 0 interaural. Impostare questo punto come zero e determinarne le coordinate da questo punto.</li>
	<li>a seconda della zona del cervello di interesse, variare le coordinate stereotassica. Determinare le coordinate utilizzando l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto 22. Una volta che le coordinate sono determinate, spostare l'ago per abbinare quelle coordinate.</li>
	<li>Target l'AC utilizzando le coordinate dei seguenti quattro punti: r: A / P =-5,80 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-8,67 mm. abbassare l'ago a destra sopra l'osso temporale per visualizzare ciascuno di questi quattro punti. Usando un pennarello, segnare i punti sull'osso temporale e collegarli al fine di disegnare un rettangolo; il rettangolo servirà come guida per aprire una finestra nell'osso ( Figura 1).</li>
</ol> 3. L'esposizione chirurgica dell'AC <ol><li>Apri finestra utilizzando un trapano elettrico e un piccolo trapano bit (Ø 0,6 mm). Forare il perimetro del rettangolo a 8.000 giri/min fino a quando l'osso dà via. Raffreddare la superficie di perforazione di risciacquo con soluzione salina sterile freddo per evitare danni alle strutture subcortical. Quando l'osso dà modo, può essere rilevato un calo di resistenza. Fare attenzione a non forare il cervello.</li>
	<li>Quando i bordi sono sciolti, tirare verso l'alto l'osso di rivestimento con una pinzetta e memorizzarlo in soluzione fisiologica sterile fredda.</li>
</ol> 4. Ablazione di AC <ol><li>usando un microscopio chirurgico (10x), delicatamente tagliare le meningi con un coltello microsurgical e rimuoverli utilizzando due punte belle forcipe. Caso di sanguinamento, sciacquare con soluzione salina sterile fredda.</li>
	<li>Aspirare delicatamente l'AC utilizzando un dispositivo di aspirazione chirurgico (pressione -0,24 bar) accoppiato ad un ago sterile di punta smussata 20 G. Questo punto è fondamentale e deve essere eseguita con molta attenzione: aspirare solo sei strati corticali e non la materia bianca sottostante.</li>
	<li>Aspirare fino a quando le arterie perforanti fermare emorragia.</li>
	<li>Quando l'aspirazione è finita, coprire la zona danneggiata con l'osso estratto e applicare una garza emostatica assorbibile.</li>
	<li>Lasciare il muscolo temporale recupera la sua posizione originale e poi suturare la pelle utilizzando clip ferita (9 mm). Applicare la pomata antibiotica (Vedi la Tabella materiali). Continuare ad applicare unguento alla ferita due volte al giorno per tre giorni. 
	Nota: Ogni applicazione è costituita da un sottile strato applicato sulla ferita.</li>
	<li>Buprenorfina iniettare sottocute nella parte posteriore del ratto (0,05 mg/kg) come un analgesico 1 h dopo l'intervento chirurgico e poi ogni 8 h durante 72 h.</li>
	<li>Tenere l'animale il rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia e restituirlo alla sua gabbia di alloggiamento per recuperare.</li>
	<li>Casa animali individualmente per impedire che i compagni di gabbia toccando la zona suturata e fornire alcuni elementi di arricchimento. Cambiare la segatura ogni giorno per prevenire l'infezione e controllare attentamente che l'animale recupera correttamente e non mostra segni di disagio.</li>
</ol> 5. Raccolta di tessuto Attenzione: quando si maneggia la paraformaldeide (PFA), sia solido e acquoso, indossare dispositivi di protezione individuale (PPE) e utilizzare un armadietto di sicurezza.
 Nota: preparare 750 mL di soluzione di formaldeide sciogliendo 4% (p/v) PFA in 1 x soluzione tamponato fosfato (PBS) usando il calore (55 ° C). Filtrare la soluzione di formaldeide con carta da filtro. Preparare la suoneria &#39; s soluzione sciogliendo 8,5 g di NaCl, 0,25 g di KCl e 0,2 g NaHCO 3 in 1.000 mL di acqua (soluzione di pH = 6.9).
<ol><li>Lasciare l'animale di sopravvivere per quanto è necessario per lo studio. Una volta ultimata la ricerca effettuata con il ratto ablato AC, terminali di anestetizzare tramite l'iniezione intra-peritoneale di 0,1 mL di sodio pentobarbital (60 mg/kg). Valutare la profondità dell'anestesia di pizzico di punta e l'assenza del riflesso di ritiro.</li>
	<li>Quando l'animale è anestetizzato, eseguire una perfusione intracardiaca 23 di 125 mL di Ringer &#39; s soluzione seguita da 750 mL di soluzione di formaldeide utilizzando un calibro di 1,8 mm di diametro interno.</li>
	<li>Una volta ultimata l'aspersione, decapitare ratto alla prima vertebra cervicale.</li>
	<li>Usare le forbici per togliere la pelle e muscolo dalla testa ed esporre il cranio. Usare le forbici per tagliare e aprire il foro occipitale e rimuovere la parte posteriore del cranio.</li>
	<li>Fare un trasversale tagliato l'osso orbitale usando le forbici Spencer e Pinze ossivore per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello. Fare attenzione a non danneggiare il cervello.</li>
	<li>Una volta che il cervello è esposto, rimuovere con cautela il mater di dura usando il forcipe ammenda-aguzzo. Utilizzare un dito delicatamente scoop sotto ed elevare il cervello. Alzate il cervello e tagliate i nervi until è gratuito. Immergete il cervello in soluzione di formaldeide e conservarla a 4 ° C per 24 h.</li>
</ol> 6. Localizzazione delle lesioni AC <ol><li>dopo la post-fissazione, posizionare con cura il cervello in una matrice di cervello di ratto sagittale esponendo la superficie laterale del cervello.</li>
	<li>Inserire una fotocamera 21 cm sopra la superficie della corteccia utilizzando un supporto di fotocamera, selezionare il &#34; riprese macro super &#34; modalità e scattare una foto della superficie del cervello.</li>
	<li>Mettere il cervello in una matrice di cervello di ratto coronale esponendo la superficie dorsale del cervello e scattare un'altra foto.</li>
	<li>Utilizzando un programma di editor di immagini, aprire le immagini e scalarle giù 50% per renderlo più facile lavorare con loro. Identificare il bregma, lambda e 0 interaural riferimenti sulla foto secondo Paxinos e Watson coordinate 19 e segnare la loro posizione nelle immagini ( Figura 2). Disegnare il contorno dell'ablazione sull'immagine laterale del cervello. Calcolare il perimetro.</li>
	<li>Importazione la coordinata mappa dove il primario (A1) e regioni secondarie (cortecce ventrale e dorsale) di AC sono trova 18 per il file del programma editor dove si lavora con le immagini. Clicca sulla mappa e trascinarlo per esso a sovrapporre alla fotografia laterale del cervello ablato.
	<ol><li>Rendere il bregma e riferimenti di lambda della mappa delle coordinate coincidono con i riferimenti di bregma e lambda identificati nell'immagine del cervello laterale.</li>
		<li>Utilizzare la fessura rhinal come riferimento per regolare l'immagine del cervello per la mappa e farli coincidere ( Figura 2B).</li>
	</ol></li> <li>Calcola la percentuale della lesione rispetto all'area occupata dall'AC.</li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Un intervento chirurgico al cervello successo dipende da due fattori: mantenere l'animale vivo durante e dopo la procedura e localizzare con precisione l'area di interesse. Garantire che il ratto è anestetizzato durante l'intervento (test del riflesso di ritiro) e riceve un'adeguata analgesici e antibiotici non ototossici dovrebbero aiutare la sopravvivenza. Il ratto, inoltre, dovrebbe essere tenuto su un rilievo di riscaldamento fino a quando si sveglia dall'anestesia per evitare l'ipotermia. Sutura farà diminuire la suscettibilità all'infezione, e la tecnica corretta è fondamentale: gli animali vi verrà a prendere al loro clips di ferita, così che deve essere impiantati abbastanza stretto per impedire la rimozione senza porre troppa tensione sulla ferita.
Per individuare con precisione l'AC (o qualsiasi altra area corticale), è importante determinare la posizione di bregma, lambda e interaural 0 a utilizzarli come riferimenti per calcolare i limiti della regione di destinazione. Qualsiasi errore nel calcolo delle coordinate comporterà l'ablazione parziale di AC o l'aspirazione indesiderato di altre zone circostanti. Così, la punta dell'ago deve solo toccare l'osso a interaural 0 e poi tradurre le coordinate antero-posteriore e medio-laterale secondo ciò che è descritto in questo protocollo.
In questo manoscritto, abbiamo anche descritto come chirurgicamente esporre e l'ablazione l'AC. Ci sono tre fasi critiche: il processo di perforazione, l'apertura e la rimozione di meningi e l'ablazione di aspirazione. Foratura deve essere eseguito a bassa velocità con pressione minima, come un'alta velocità di perforazione genera calore che può interessare è vicino a strutture subcortical. Tuttavia, mantenere una bassa velocità e punto di foratura con soluzione salina sterile fredda di raffreddamento dovrebbe impedire eventuali danni. Inoltre, la pressione minima è essenziale per evitare una rottura improvvisa del cranio e del conseguente pregiudizio alla corteccia sottostante. L'apertura e la rimozione delle meningi che coprono l'AC deve essere eseguite con attenzione per evitare la rottura dei vasi sanguigni. Se il sanguinamento si verifica, la prognosi precoce e tardiva è generalmente sfavorevole ed è lecito chiedersi se tale animale soddisfa i criteri di inclusione per uno studio affidabile. Si consiglia in questo caso l'eutanasia. Infine, l'aspirazione (probabilmente l'aspetto più difficile nell'esecuzione di un'effettiva lesione), deve essere limitato alla materia grigia. Ci sono due indicatori che consentono di rilevare la presenza della materia bianca: (1) un cambiamento in contrasto di colore, come la materia bianca è più luminoso rispetto alla materia grigia; e (2) la cessazione del sanguinamento dalle arterie perforanti.
Dopo qualsiasi manipolazione eseguita nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione della procedura effettuata nella corteccia per la successiva analisi e validazione dei dati ottenuti dall'animale. In questo manoscritto, dettagliamo come localizzare l'ablazione eseguita nella corteccia usando una mappa delle coordinate precedentemente descritta dal nostro gruppo di18. Questa mappa è stata costruita utilizzando riferimenti anatomici ottenuti dalle ricostruzioni sezione seriale delle sezioni istologiche, correlate con l'Atlante Paxinos e Watson del cervello del ratto22. Di conseguenza, la mappa differenzia fra il primario (A1) e cortecce secondarie (dorsale e ventrale) di AC. Il vantaggio principale di questa mappa delle coordinate è che permette la rapida localizzazione della lesione sovrapponendo una foto scattata dalla superficie laterale del cervello inserito in una matrice sagittale del cervello. Un altro vantaggio è che i laboratori con meno esperienza in anatomia possono utilizzare la mappa adattandola ai loro modelli animali. Solo è necessario impostare le distanze tra bregma, lambda e interaural 0 riferimenti in un cervello di controllo irrorato e ridimensionare la mappa verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Utilizzare la fessura Rhinal come riferimento per regolare l'immagine del cervello alla mappa. La profondità dell'ablazione non può essere determinata in questa mappa delle coordinate, così dovrebbe essere determinato nelle sezioni istologiche del cervello.
La combinazione di metodi stereotactic con l'esposizione chirurgica dell'AC sono metodi di base che potrebbero essere facilmente adattati da qualsiasi ricercatore che vuole indirizzare l'AC nel ratto. Questo potrebbe essere per un esperimento acuto o uno che richiede l'impianto di dispositivi permanenti. Inoltre, l'ablazione chirurgica di AC è stato precedentemente utilizzato come modello per studiare gli effetti di privazione cronica corticale in udienza. Ablazioni AC potrebbero essere utilizzati anche per studiare gli effetti che ablazioni unilaterali di AC esercitano in altre aree corticali, o servono come un modello del colpo. Così, i disegni sperimentali descritti qui sono metodi utili che possono essere applicate singolarmente o in combinazione ad una vasta gamma di disegni sperimentali.

Il ratto è uno dei modelli animali più comunemente usati in neuroscienze uditiva. La robustezza del suo comportamento lo rende in grado di lavorare per centinaia di prove al giorno. La sua sensibilità e acutezza spettrale per udienza1,2e l'organizzazione anatomica e funzionale del suo sistema centrale, paragonabile ad altri mammiferi3, fare il topo un modello animale adatto per analizzare una vasta gamma di temi di ricerca in neuroscienze uditiva. La corteccia uditiva di ratto (AC), in particolare, è stato oggetto di numerosi studi anatomici e fisiologici che hanno cercato di capire la sua struttura, organizzazione e ruolo nell'elaborazione del suono3. Oggi, l'AC è diventato popolare tra i neuroscienziati interessati a plasticità esperienza-dipendenza, percezione uditiva, la base sinaptica dell'organizzazione del campo recettivo e del controllo corticale dell'elaborazione del suono nel subcortical uditivo i nuclei4,5,6,7,8,9. Per affrontare le sfide che pongono questi nuovi approcci, procedure che possono individuare con precisione ed esporre chirurgicamente l'AC accelerare gli sforzi di ricerca. Stereotactic tecniche lo rendono facile da localizzare specifiche regioni all'interno del cervello senza test di fisiologia. Anche se le dimensioni del cervello varia leggermente tra gli animali, la posizione di ogni area del cervello può essere determinata utilizzando le coordinate stereotactic impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello del ratto.
L'ablazione con restrizioni di AC è la rimozione chirurgica della regione sensoriale della corteccia più direttamente correlata con problemi di udito. A differenza di altri metodi utilizzati per bloccare l'attività di AC, come raffreddamento o locale lidocaina iniezioni10,11,12, l'ablazione chirurgica dei risultati AC la cronica perdita di funzione. Così, ablazioni AC sono più adatti per studiare gli effetti a lungo termine della privazione corticale, così come i successivi fenomeni di plasticità di lesione. La combinazione di metodi stereotactic con ablazioni chirurgiche di AC è stata utilizzata con successo per studiare gli effetti fisiologici, comportamentali e molecolari del controllo corticale privazione13,14,15 ,16,17,18,19. Ad esempio, un modello del ratto con ablazioni AC bilaterale è stato utilizzato per studiare gli effetti dell'ablazione corticale nel riflesso dello startle uditiva e uditive del tronco cerebrale (ABR) risposte16. Recentemente, abbiamo confrontato gli effetti che unilaterali contro bilaterale ablazioni dei prodotti del ratto AC in soglie ABR, ampiezze e latenze in diversi momenti dopo l' infortunio18. Inoltre, il modello del ratto di ablazione AC restrittiva è stato utilizzato anche per studiare l'effetto di degenerazione di via corticofugal le inferiori collicus13,14,15 e l' orecchio interno17 ,19. Dopo una tale manipolazione avviene nel cervello, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Anche se molto utile, la principale limitazione di tonotopico mappe basate su risposte neuronali20,21 sono le tecniche elettrofisiologiche necessarie per individuare i campi uditivi nel cervello del ratto. Poiché non tutti i laboratori hanno l'attrezzatura necessaria e/o perizia per fare tali registrazioni, abbiamo costruito una mappa delle coordinate basata sul trasferimento dei limiti cytoarchitectural di AC a un'immagine della superficie del cervello18. Questa mappa può essere molto utile per individuare l'AC senza test di fisiologia.
Il presente protocollo descrive un metodo per la posizione stereotactically guidate, l'esposizione chirurgica e ablazione di AC in ratti. Viene inoltre descritto come utilizzare la nostra mappa delle coordinate18 per localizzare facilmente l'estensione della lesione sopra un'immagine della superficie dei cervelli ablati.

<table><tbody><tr><td>Cornice stereotassica</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromotore dentale</td><td>W& H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>Fresa diamantata</td><td>B Braun</td><td>GD021R</td><td>0,6 mm</td></tr><tr><td>Dispositivo di aspirazione chirurgica</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Merial</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Bayer</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodio</td><td>Meda</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>siero salino sterile</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G ago sterile</td><td>Terumo Neolus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punte</td><td></td><td></td><td></td>in cotone</tr><tr><td>Materiale di sutura</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unguento antibiotico</td><td>Quadriderm (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcipe</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>Aghi chirurgici</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>Forbice</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>Forbice Spencer</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi microchirurgici</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>Garza emostatica assorbibile</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital ratto Brain Matrix</td><td>Activational systems Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital di sodio</td><td>Vetoquinolo</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Olympus 5,1 MP</td><td>C-5060 obiettivo zoom grandangolare</td><td>F2,8-4,8</td></tr><tr><td>Clip per ferite</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>Tela 12</td><td>ACD Systems</td><td></td><td></td></tr> calibro <tr><td>dell'ago</td><td></td><td></td><td>diametro 1,8 mm</td></tr><tr><td>Imbuto separatore</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Primer GluA2 Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td></tr><tr><td>GluA3 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

La corteccia uditiva di ratto (AC) sta diventando popolare tra gli investigatori di neuroscienze uditiva che sono interessati a plasticità esperienza-dipendenza, processi percettivi uditivi e controllo corticale di elaborazione nei nuclei uditivi subcorticali del suono. Per affrontare nuove sfide, una procedura per individuare con precisione e chirurgicamente esporre la corteccia uditiva sarebbe accelerare questo sforzo di ricerca. Neurochirurgia stereotassica è usata ordinariamente in ricerca pre-clinica in modelli animali per attecchire un ago o un elettrodo ad una posizione pre-definita all'interno della corteccia uditiva. Nel protocollo seguente, usiamo metodi stereotactic in modo inedito. Identifichiamo i quattro punti di coordinate sulla superficie del temporal bone del ratto per definire una finestra che, una volta aperto, accuratamente espone sia il primario (A1) e secondario (dorsale e ventrale) cortecce del AC. utilizzando questo metodo, quindi eseguiamo un chirurgico ablazione di AC. Dopo una tale manipolazione viene eseguita, è necessario valutare la localizzazione, la dimensione e l'estensione delle lesioni fatta nella corteccia. Così, inoltre descriviamo un metodo per individuare facilmente l'autopsia di ablazione AC utilizzando una mappa delle coordinate costruita trasferendo i limiti cytoarchitectural di AC alla superficie del cervello. La combinazione della posizione stereotactically-guida e l'ablazione di AC con la localizzazione della zona danneggiata in un post mortem delle coordinate mappa facilita la convalida delle informazioni ottenute dall'animale e conduce ad una migliore analisi e comprensione dei dati.

Abbiamo effettuato una posizione stereotactically guidate, l'esposizione chirurgica e ablazione unilaterale di AC in tre ratti Wistar. La localizzazione della lesione ha confermato che ablazioni eseguite nei tre ratti ha invaso le principali suddivisioni di AC (cortecce primarie, dorsale e ventrale) e comprende una gamma di 80 al 100% dell'area totale di AC (Figura 2B).
Il protocollo descritto qui per eseguire ablazioni AC restrittive è stato utilizzato in precedenza nel nostro laboratorio per studiare gli effetti a lungo termine della privazione di controllo corticale nei nuclei uditivi subcorticali, così come i successivi fenomeni di plasticità. In questi studi, il protocollo di ablazioni di AC è stato convalidato applicando fisiologico (ABR), comportamentali (startle risposte, prepulse inibizione; PPI) e molecolari (DNA microarrays, qPCR e Western Blot) metodi13,14,15,16,17,18,19. Qui, per dimostrare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo lasciato tre ratti AC ablazione sopravvivere per una settimana, e raccolti le coclee durante l'accumulazione del tessuto passo per studiare i cambiamenti nell'espressione delle subunità AMPA più rilevanti presenti nella coclea adulta , GluA2 e GluA3, di qPCR. Il confronto tra le trascrizioni da AC ablazione ratti e animali di controllo sham dove tutto il processo di chirurgia ma non l'ablazione corticale è stato effettuato ha mostrato una down-regulation per GluA2 e un su-regolamento per GluA3 a due coclee (Figura 3) , che è in accordo con il nostro precedente studio19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figura 1: immagini dell'osso temporale del ratto alle tre diverse fasi chirurgiche. (A) trasferimento delle coordinate stereotassiche di AC all'osso temporale. Le coordinate dei quattro punti sono: r: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P = -2,7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P = -5,8 mm, M/L = + /-8,67 mm. (B) le coordinate vengono utilizzate come riferimento per disegnare un rettangolo sulla superficie dell'osso temporale che guiderà l'apertura di una finestra. (C) Mostra la finestra aperta nell'osso dopo la foratura. Le meningi con vasi sanguigni possono essere osservate sulla superficie del cervello. R: rostrale, d: dorsale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figura 2: procedura per l'individuazione di lesioni nel cervello del ratto. (A) fotografia della superficie dorsale di un cervello di AC ablazione con aghi stereotactically impiantati in Lambda e Bregma (secondo Paxinos e Watson coordinate19). Linee tratteggiate segnare la posizione di Bregma e Interaural 0 nella griglia 9 x 9 cm, così come la superficie dorsale del cervello. (B) fotografia della superficie laterale del cervello ablato sovrapposto alla mappa delle coordinate di AC. Il perimetro della lesione è etichettato in rosso nella foto. Il perimetro dell'area di AC è etichettato in nero nella mappa. In questo esempio, la percentuale di ablazione AC rispetto all'area totale occupata dall'AC è 84,79%. AC: corteccia uditiva, IA: inter aural, FR: Rhinal fenditura. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figura 3: cambiamenti nei livelli di mRNA di subunità del recettore AMPA GluA2 e GluA3 dopo post-lesione unilaterale del di 7 giorni di AC ablazioni. Risultati sono presentati come media ± deviazione standard del cambiamento di piega. Modifiche per GluA2 trascrizioni sono rappresentate in blu. Cambiamenti per le trascrizioni GluA3 sono presentati in rosso. Una diminuzione significativa in GluA2 e un aumento in GluA3 è osservati in due coclee (ipsi - e controlaterale l'ablazione) relativi comandi finti con nessun ablazioni corticale a 7 giorni dopo l'intervento chirurgico; Questo è in accordo con i nostri precedenti risultati19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo un metodo per la posizione stereotactically-guida, l'esposizione e l'ablazione della corteccia uditiva in ratti. La localizzazione dell'ablazione è valutata usando un post mortem delle coordinate mappa.

Stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere l'ablazione stereotassicamente guidata della corteccia uditiva e l'uso di una mappa di coordinate per localizzare la lesione su un'immagine della superficie del cervello. Questo metodo può aiutare i ricercatori delle neuroscienze uditive ad affrontare il ruolo delle corticali nel percorso nella percezione del suono. Così come i meccanismi e la plasticità di posizione della linea.Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'esposizione chirurgica e l'ablazione della corteccia uditiva utilizzando metodi di base che possono essere adattati da qualsiasi investigatore. Quindi questo metodo può essere utile nel campo delle neuroscienze uditive, può essere applicato anche in altri sistemi come quello visivo e somatosensoriale. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare i difetti che l'ablazione unilaterale della corteccia uditiva esercita in altre aree corticali.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, perché la corretta identificazione e traduzione delle coordinate stereotassiche nell'osso temporale è essenziale per localizzare con precisione la corteccia uditiva. Per iniziare questa procedura, posizionare il ratto anestetizzato su un termoforo per mantenere la sua temperatura corporea. Quindi stabilizzare la testa dell'animale in un telaio stereotassico utilizzando due barre auricolari e una barra per il morso.Radere il cuoio capelluto e disinfettare l'area chirurgica con iodio povidone. Usando un bisturi, praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che copre la superficie del cranio. Successivamente, usa una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente il sangue che copre la superficie del cranio.Per visualizzare Bregma, Lambda e la linea interaurale, praticare un'incisione nel muscolo temporale vicino alla sua inserzione dorsale sul cranio con un bisturi. Successivamente, estrarre il muscolo utilizzando un ago e un materiale di sutura e fissare il materiale di sutura al telaio stereotassico per esporre l'osso temporale. Abbassare lentamente un ago dritto sterile fino a quando non si trova proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell'ago sia impostata sullo zero interaurale.Impostate questo punto su zero. Successivamente, punta all'AC usando quattro punti. Quindi abbassa l'ago proprio sopra l'osso temporale per visualizzare ciascuno di questi quattro punti.Segna i punti con un pennarello sull'osso temporale e collegali in modo da disegnare un rettangolo. Il rettangolo servirà da guida per aprire una finestra nell'osso. In questa procedura, aprire la finestra utilizzando un trapano elettrico e una piccola punta da trapano.Forare il perimetro del rettangolo a 8.000 giri/min fino a quando l'osso cede. Raffreddare la superficie di foratura risciacquandola con soluzione fisiologica sterile fredda per evitare danni alle strutture sottocorticali. Quando l'osso cede, fai attenzione a non perforare il cervello.Quando i bordi sono perduti, sollevare l'osso di copertura con una pinza fine e conservarlo in soluzione salina sterile fredda. Utilizzando un microscopio operatorio, tagliare delicatamente le meningi con un bisturi microchirurgico e rimuoverle utilizzando due pinze a punta fine. In caso di sanguinamento, sciacquare il sito chirurgico con soluzione fisiologica sterile fredda.Successivamente, aspirare delicatamente l'aria condizionata utilizzando un dispositivo di aspirazione chirurgica accoppiato a un ago sterile a punta smussata calibro 20. Aspirare solo i sei strati corticali e non la sostanza bianca sottostante. Questo punto è critico e deve essere eseguito con molta attenzione.Al termine dell'aspirazione, coprire il sito chirurgico con l'osso estratto e applicare una garza emostatica riassorbibile. Lascia che il muscolo temporale recuperi la sua posizione originale e poi sutura la pelle usando clip per ferite. Successivamente, applica un unguento antibiotico sulla ferita.Successivamente, iniettare Buprenorfina per via sottocutanea nella parte posteriore del ratto come analgesico, un'ora e otto ore dopo la fine dell'intervento. Tieni l'animale sul termoforo fino a quando non si sveglia e rimettilo nella sua gabbia di alloggiamento per il recupero. Quando la ricerca eseguita con il ratto ablato con AC è completata, anestetizzarlo terminalmente mediante iniezione intraperitoneale di 0,1 millilitri di pentobarbital di sodio.Dopo aver eseguito una profusione intracardiaca di soluzione di Ringer e formaldeide, rimuovere la pelle e il muscolo dalla testa per esporre il cranio. Usando le forbici Spencer, fai un taglio trasversale nell'osso orbitale. Dopodiché, rimuovi la parte posteriore del cranio e usa i rongeur per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello.Fai attenzione a non danneggiare il cervello. Una volta che il cervello è esposto, rimuovere con cura la dura madre utilizzando una pinza a punta fine. Usa un dito per raccogliere delicatamente sotto ed elevare il cervello.Quindi solleva il cervello e taglia i nervi finché non è libero. Successivamente, immergere il cervello in una soluzione di formaldeide e conservarlo a quattro gradi Celsius per 24 ore. Dopo la post-fissazione, posizionare con cura il cervello in una matrice sagittale di cervello di ratto, esponendo la superficie laterale del cervello.Posiziona una fotocamera a 21 centimetri sopra la superficie della corteccia utilizzando un supporto per fotocamera. Quindi, seleziona la modalità di scatto super-macro e scatta una foto della superficie del cervello. Successivamente, utilizzando un programma di editor di immagini, apri le immagini e ridimensionale del 50%Identifica i riferimenti Bregma, Lambda e zero interaurale e segna la loro posizione nelle immagini.Disegna il contorno dell'ablazione sull'immagine laterale del cervello. Importa la mappa delle coordinate in cui si trovano le regioni primarie e secondarie della corteccia uditiva nel file del programma di editing. Quindi fare clic sulla mappa e trascinarla per sovrapporla alla fotografia laterale del cervello ablato.Fare in modo che i riferimenti Bregma e Lambda della mappa delle coordinate coincidano con i riferimenti Bregma e IA identificati nell'immagine del cervello laterale. Successivamente, utilizzare la fessura del Reno come riferimento per adattare l'immagine del cervello alla mappa e farle coincidere. È importante confermare che la sostanza bianca sia intatta.Questo può essere fatto inizialmente con l'immunocolorazione della sezione seriale del cervello. Per dimostrare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo tenuto i tre ratti AC-ablati sopravvissuti per una settimana e poi abbiamo raccolto le coclee per studiare i cambiamenti nell'espressione delle subunità AMPA più rilevanti presenti nella coclea adulta, GluA2 e GluA3 mediante qPCR. Il confronto tra i trascritti di ratti ablati con AC-ablati e animali di controllo fittizi ha mostrato una sottoregolazione per GluA2 e una sovraregolazione per GluA3 in entrambe le coclee, che è in accordo con il nostro studio precedente.Durante il tentativo di eseguire l'intervento chirurgico, è importante ricordare tre cose: perforare l'osso temporale alla velocità più bassa con la minima pressione, rimuovere con cura le meningi per evitare di rompere i vasi sanguigni e limitare l'aspirazione alla materia grigia. Una volta padroneggiata, l'esposizione chirurgica e l'ablazione della corteccia uditiva possono essere eseguite in 45 minuti se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti metodi fisiologici, comportamentali e/o immunocitochimici per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come la mancanza della corteccia uditiva influenzi la funzione di ulteriori sistemi sensoriali.

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

Ricerca

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Abbiamo sviluppato un metodo per il controllo simultaneo risonanza magnetica funzionale e la registrazione elettrofisiologica del cervello dei roditori, fornendo una piattaforma per l'indagine del rapporto tra attività neurale e il livello di ossigenazione blood dipendente (BOLD) segnale RM.

FMRI simultanea ed Elettrofisiologia nel cervello roditori

Ablazione mirata della regione specifica del cervello (s) mediante infusione di uno eccitotossina utilizzando le coordinate stereotassico descritto. Questa tecnica può anche essere adattato per l'infusione di altre sostanze chimiche nel cervello di ratto.

La chirurgia stereotassica della lesione eccitotossico di specifiche aree cerebrali nel ratto adulto

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acuto<em&gt; In Vivo</em&gt; Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell&#39;attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

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Una connessione Wireless, interfaccia bidirezionale per registrazione In Vivo e la stimolazione dell'attività neurale a comportarsi liberamente ratti

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Registrazione simultanea di co-localizzato elettroencefalografia e potenziali di campo locale nel roditore

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In vivo Tomografia ad emissione di positroni per rivelare i modelli di attività indotti dalla stimolazione cerebrale profonda nei ratti

Impara l'ablazione stereotassica della corteccia uditiva nel ratto per studiare la percezione del suono. Questo metodo consente la localizzazione precisa della lesione tramite mappa di coordinate e analisi postmortem.

Stereotactically-guida l'ablazione della corteccia uditiva del ratto e localizzazione della lesione nel cervello

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