acuto In Vivo Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell'attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

In questo studio viene presentata la metodologia su come eseguire registrazioni elettrofisiologiche in vivo multi-site dal percorso iperdirezionale in anestesia uretanica.

L'obiettivo generale di questo esperimento è dimostrare come eseguire registrazioni elettrofisiologiche acute in vivo di potenziali di campo locali e attività multi-unità dal loop cortico-gangli della base di ratti anestetizzati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come le oscillazioni patologiche contribuiscono alla complessa fisiopatologia nelle malattie neuropsichiatriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per registrare contemporaneamente potenziali extracellulari da vari bersagli corticali e sottocorticali del cervello.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse malattie neuropsichiatriche perché i potenziali di campo locale possono essere potenzialmente utilizzati come biomarcatori per trattamenti come la stimolazione a circuito chiuso. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla fisiopatologia dei gangli della base, può essere applicato anche ad altre aree del cervello. Per iniziare questa procedura, preparare un filo d'argento lungo cinque centimetri con un diametro di 200 micrometri e rimuovere qualsiasi rivestimento se necessario.

Quindi, tieni la punta del filo verso il basso in una fiamma fino a quando la punta inizia a sciogliersi e forma una palla con un diametro di un millimetro. Quindi tagliare l'elettrodo a una lunghezza totale di 15 millimetri dall'inizio della punta a forma di sfera all'estremità del filo. Saldare un connettore di precisione all'estremità del filo che si adatta al sistema di registrazione elettrofisiologica.

Quindi coprire il punto di saldatura dall'estremità del filo al connettore con vernice d'argento conduttiva per migliorare la conduttività. Dopo che la vernice conduttiva si è asciugata, coprire il punto di saldatura con un tubo termorestringente da uno a tre millimetri. Appiattire con cura la punta a forma di palla a metà dello spessore usando un martello da orologiaio.

Successivamente, indossare i guanti da esplorazione e utilizzare un panno per la pulizia privo di lanugine con etanolo al 100% per rimuovere sporco e grasso. Quindi posizionare gli elettrodi in una provetta da centrifuga da 15 millilitri o in una provetta per colture cellulari e riempirla con candeggina al cloro per uso domestico fino a coprire completamente la punta a forma di sfera. Dopo 23 minuti, estrarre gli elettrodi e sciacquarli generosamente con acqua distillata.

La superficie dell'elettrodo dovrebbe apparire omogeneamente viola scuro nell'applicazione di successo del cloruro d'argento. Successivamente, lasciare asciugare gli elettrodi all'aria. Prelevare gli elettrodi con una pinzetta fine dopo che sono stati completamente asciugati.

Quindi utilizzare un pennello fine per applicare l'isolamento elettrico liquido sugli elettrodi. Iniziare dal filo direttamente dietro la punta dell'elettrodo e coprire il tutto fino al tubo termoretraibile. Successivamente, lasciare asciugare l'isolamento per almeno due ore.

In questo passaggio, fissare senza stringere il primo paio di elettrodi al blocco acrilico del supporto con pezzi di nastro adesivo. Gli elettrodi devono sporgere dal blocco acrilico di circa 12 millimetri. Quindi, fissare con cura il secondo elettrodo bipolare accanto al primo elettrodo.

Per mirare alle strutture del percorso iperdiretto, la distanza tra le coppie di elettrodi dovrebbe essere di due millimetri. Al microscopio, regolare il secondo elettrodo bipolare facendolo scorrere con cautela in una posizione in cui la punta più ventrale sia incassata di circa 200 micrometri rispetto al primo elettrodo. Premere sul nastro adesivo e quindi fissare gli elettrodi con la fascetta metallica del supporto.

Dopo aver anestetizzato l'animale, rasare la testa per ottenere un campo chirurgico pulito. Fissare l'animale nel telaio stereotassico e quindi disinfettare il sito di incisione e l'area circostante con un disinfettante chirurgico appropriato. Successivamente, eseguire un'incisione lunga due centimetri sul cuoio capelluto in direzione sagittale con un bisturi.

Usa il bisturi per raschiare leggermente l'aponeurosi del cranio e disinfetta il cranio con perossido di idrogeno al 3%. Quindi utilizzare dei cotton fioc imbevuti di perossido di idrogeno al 3% per rimuovere il tessuto residuo. Quindi, regolare la barra incisiva fino a quando la parte superiore del cranio non è livellata, il che significa che il bregma e il lambda come punti di riferimento stereotassici sono sullo stesso piano.

Al microscopio, utilizzare uno strumento di allineamento stereotassico standard per ratti per calibrare la punta designata per il bregma e regolare la barra incisiva fino a quando i punti designati per il bregma e il lambda sullo strumento toccano contemporaneamente il cranio. Utilizzando un supporto stereotassico con cannula, calibrarlo sulla bregma e quindi calcolare la posizione di tutti i fori sul cranio. Quindi segnare le posizioni dei fori da praticare grattando accuratamente il cranio o utilizzando un pennarello colorato chirurgico.

Quindi, utilizzando un micro trapano, praticare con cura tutti i fori con un diametro di circa un millimetro. Per STN e SNr, praticare un foro comune di circa due millimetri per tre millimetri. Prendi una cannula sottile e piega la punta per formare due uncini.

Quindi utilizzare i ganci per rimuovere eventuali detriti dai fori e tagliare e rimuovere con cura la dura madre nel foro comune STN/SNr. Successivamente, sciacquare i fori con soluzione fisiologica. Applicare una goccia di soluzione fisiologica ogni 15 minuti sui fori per evitare che il cervello e la dura si secchino.

Quindi prendi un micro trapano e una micro vite in acciaio inossidabile abbinata, pratica un foro e avvita una micro vite tra i fori degli elettrodi epidurali di riferimento sopra il cervelletto. Quindi, guidare le punte degli elettrodi con una pinzetta sottile e farle scorrere direttamente sotto l'osso del cranio nei fori. Fissare tutti gli elettrodi epidurali con uno stencil acrilico a due componenti.

Assicurarsi di non coprire il punto di bregma né di intaccare il comune foro STN/SNr. Quindi inserire il supporto preparato con gli elettrodi a microfilo di tungsteno nel telaio stereotassico. Calibrare l'elettrodo più ventrale al bregma che ha lo scopo di colpire l'STN.

Regolare la posizione calcolata sopra il foro STN/SNr comune e abbassare gli elettrodi fino al cervello. Assicurati che gli elettrodi a micro filo di tungsteno entrino nel cervello senza intoppi. In questa procedura, impostare il software di registrazione, ad esempio il filtro passa-banda, e amplificare il segnale dei dati grezzi.

Quindi utilizzare un filtro LFP e spike online con le impostazioni appropriate. Per tutti i filtri, utilizzare un filtro di tipo Butterworth. Imposta una soglia di picco per l'ordinamento dei picchi online.

La maggior parte dei software di registrazione consente l'impostazione di una soglia di picco, che è un valore di ampiezza al di sopra della soglia in cui un segnale è contrassegnato come picco dal software. Quindi, abbassare lentamente gli elettrodi a microfilo di tungsteno a un millimetro sopra l'STN e attendere che il segnale si stabilizzi se necessario. Per la mappatura elettrofisiologica, far avanzare gli elettrodi ventralmente a passi di 100 micrometri.

Ad ogni passo, valutare il modello di cottura, la velocità di sparo e la forma delle punte confrontandole con gli esempi tipici forniti nella figura due del manoscritto allegato. Una volta che gli elettrodi si trovano nelle strutture desiderate, impostare il filtraggio online e l'ordinamento degli spike, quindi avviare la registrazione dei dati. Ecco una registrazione LFP rappresentativa di 600 secondi della corteccia motoria primaria.

È possibile differenziare i periodi di tempo con attività ad alta frequenza, bassa ampiezza, corrispondenti allo stato attivato, e i periodi di tempo con il ritmo più lento e l'ampiezza più alta corrispondente allo stato di attività dell'onda lenta. E questo è il grafico della frequenza temporale corrispondente su un intervallo di 600 secondi che illustra la potenza relativa da zero a 20 Hertz degli LFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire registrazioni elettrofisiologiche extracellulari in vivo dall'ansa dei gangli cortico-basali di ratti anestetizzati.