Name: Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara la registrazione patch clamp whole-cell in cellule ciliate esterne isolate da cuccioli di ratto postnatale per studiare lo sviluppo funzionale dell'udito. Questo metodo elettrofisiologico permette di analizzare le proprietà delle cellule cocleari.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma del 973 (2014CB943002) e il National Natural Science Foundation della Cina (11534013, 31500841).

Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato di etica animale dell'Università medica del sud.
1. preparare le soluzioni per gli esperimenti
<ol><li>Preparare l'anestetico (Vedi Tabella materiali): sodio pentobarbital 1,5% disciolto in ddH2O.</li>
	<li>Preparare la soluzione di dissezione (Vedi Tabella materiali): sciogliere un sacchetto di polvere di L-15 di Leiboviz in 1 L di ddH2O. Adjust pH a 7,3 con 1 M NaOH. Regolare osmolarità di 300-330 mOsm utilizzando un Osmometro e 10 mM HEPES prima dell'uso.</li>
	<li>Sciogliere 2 mg/mL collagenasi IV (Vedi Tabella materiali) in soluzione di dissezione preparata al punto 1.2.</li>
	<li>Preparare le soluzioni di immunostaining (Vedi Tabella materiali): sciogliere la paraformaldeide al 4% in tampone fosfato salino (PBS). Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>Diluire l'agente di permeabilità di 0.3% in PBS. Diluire il siero di capra normale del 10% in PBS come il tampone di bloccaggio. Diluire l'anticorpo prestin s 1: 200 in tampone bloccante. Diluire l'anticorpo coniugato Alexa488 1:600 in tampone bloccante. Diluire 1: 200 isotiocianato falloidina-tetrametilrodamina B in PBS.</li>
	<li>Preparare la soluzione extracellulare (Vedi Tabella materiali): preparare mezzo L-15 di Leiboviz, come descritto in precedenza (punto 1.2).</li>
	<li>Preparare la soluzione intracellulare (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>2. ABR registrazione
Nota: Registrazione ABR precedentemente è stato descritto in dettaglio nel nostro precedente studio9.
<ol><li>Anestetizzare ratti Sprague Dawley (deviazione standard) (1-14 giorno vecchio cuccioli e adulti 2 - mesi-vecchi, entrambi i sessi) con una singola iniezione del 1,5% sodio pentobarbital (22 mg/kg per cuccioli e 30 mg/kg per gli adulti, intraperitoneali (i.p.)).</li>
	<li>Metti l'animale anestetizzato in uno stampo di schiuma di polietilene per immobilizzare il corpo dell'animale. Metti l'animale su un tavolo antivibrazione in una camera di attenuazione di suono. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37,5 ° C con un rilievo di riscaldamento.</li>
	<li>Pulire la zona della testa con etanolo al 70% (vol/vol). Utilizzando una forbice, praticare un'incisione di 1-2mm ventrolateral alla pinna esterno per posizionare l'elettrodo di riferimento o la terra. Un elettrodo ad ago ipodermico (elettrodo di registrazione) si trova sopra il vertice del cranio (Figura 1A).</li>
	<li>Utilizzando il generatore di funzioni, generare raffiche di tono calibrato (altopiano di 3 ms, 1 ms salita/discesa) di varie frequenze (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensità (è diminuito da 85 a 10 dB SPL nel passaggio 5 dB). Variare la frequenza e l'ampiezza manualmente o utilizzando un computer. Fornire stimoli sonori attraverso un altoparlante elettrostatico che si trova 10 cm distanza verso la testa dell'animale.</li>
	<li>Filtro (100-1.000 Hz), amplificare e media (256 volte) il suono hanno suscitato potenziale utilizzando un processore multi-funzione per ottenere l'ABR. Le tracce ABR viene monitorata online e memorizzati per l'analisi offline. Si impiegano circa 40 minuti per completare la registrazione da un animale ABR. Nota: Solitamente, il tre-sette cime (onda I ad onda VII) con latenze meno di 15 ms può essere identificato (Figura 1B). La soglia ABR è definita come il livello sonoro minimo al quale onda potremmo essere rilevati I e II.</li>
	<li>Eutanasia prima degli animali svegli dall'anestesia (con un'iniezione intraperitoneale di 0,3 mL 1,5% sodio pentobarbital).</li>
</ol>3. la dissezione dell'organo del Corti (OC)
<ol><li>Anestetizzare cuccioli del ratto. Per meno di 6 giorni vecchi ratti (< P6), mantenere l'animale in una piastra di coltura di 100 mm e coprire il recipiente con ghiaccio per 10 min. Per i ratti > P6, anestetizzare l'animale con una singola iniezione del 1,5% sodio pentobarbital (22 mg/kg, i.p.). Decapitare i cuccioli di ratto dopo l'anestesia.</li>
	<li>Sterilizzare la testa di spruzzatura con etanolo al 70% (vol/vol).</li>
	<li>Aprire il cranio lungo la linea mediana sagittale con le forbici; rimuovere il cervello per esporre l'orecchio interno.</li>
	<li>Trasferire l'orecchio interno in una capsula di Petri 35 mm riempito con 3 mL di L-15 ghiacciata (Figura 2A).</li>
	<li>Sotto il microscopio di dissezione, è necessario utilizzare una pinzetta per rimuovere la capsula ossea della coclea (Figura 2B).</li>
	<li>Scartare l'OC e associati vascularis dello stria (SV) dal modiolus.</li>
	<li>Tenendo la porzione basale della SV con il forcipe, separare l'OC da SV completamente tramite rimozione lentamente dalla base all'apice (Figura 2).</li>
	<li>Tagliare in modo uniforme l'OC in tre pezzi utilizzando forbici bene (Figura 2D).</li>
</ol>4. immunofluorescenza
<ol><li>Utilizzando una punta di pipetta 200 µ l, trasferire i segmenti di OC (punto 3.8) su un vetrino e difficoltà con 100 µ l di paraformaldeide al 4% per almeno 4 ore a 4 ° C. Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata.</li>
	<li>Lavare il tessuto spostando il paraformaldeide con 100 µ l di PBS fresco. Lavare il tessuto tre volte per 10 min.</li>
	<li>Incubare il tessuto con agente di permeabilità di 0.3% in PBS per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Scartare l'agente di permeabilità in PBS e lavare il tessuto tre volte con PBS.</li>
	<li>Bloccare con 10% siero di capra normale in PBS per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare con l'anticorpo anti-prestin-C-terminale (1: 200) in blocco soluzione per 2 h a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS per 5 min.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari coniugati Alexa488 (1:600) in soluzione bloccante per 1 h a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS per 5 min al buio.</li>
	<li>Incubare con rodamina-falloidina (1: 200) per 10 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS per 5 min al buio.</li>
	<li>Montare su un vetrino con mezzo di montaggio (contenente DAPI). Immagine con microscopia confocale utilizzando 405 nm, 488 nm e 594 nm laser. Impostare la potenza del laser a 0,1-0,5 mW e la scansione velocità a 0,5 fotogrammi/s.</li>
</ol>5. Patch clamp registrazione di OHCs isolato
<ol><li>Utilizzare la levetta della pipetta e micro-falsario per rendere patch pipette con una punta di diametro 2-3 µm. Back-riempimento le pipette con soluzione intracellulare. Solitamente, la resistenza iniziale della pipetta patch era MΩ 2.5-3.5 nella soluzione del bagno.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta 200 µ l, trasferire un pezzo di the OC (dal punto 3.8) in una capsula di Petri da 35 mm. Digerire il tessuto con 100 µ l di terreno di digestione enzimatica (collagenasi IV, Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Spostare il mezzo di digestione enzimatica con 100 µ l di L-15. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi utilizzando un micro bisturi per isolare le cellule ciliate.</li>
	<li>Dopo delicato pipettaggio, trasferire le cellule in un piccolo alloggiamento di plastica fatti in casa (diametro ~ 1,5 cm) riempito con soluzione del bagno senza enzima (~ 1,5 mL, Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Posizionare la camera sul palco di un microscopio invertito. Trovare il OHCs solitario che appaiono sani.</li>
	<li>Caricare la pipetta patch in fase di testa di un amplificatore di 700B. Muoversi con cautela la pipetta patch di un micromanipolatore e posizionarlo intorno alla parte inferiore della cella capelli esterna (Figura 3A).</li>
	<li>Morsetto della intero-cellula patch OHC sigillando la parete laterale del corpo cellulare. Applicare l'aspirazione di luce fino a quando la membrana cellulare è rotto. Impostare l'azienda potenziale a -70 mV. Cellule con accesso ha variato da 10 a 17 MΩ e resistenza di membrana hanno variato da 100 a 500 MΩ e sono considerate una corretta configurazione di cellule intere.</li>
	<li>Utilizzando il computer di controllo, applicare hyperpolarizing e depolarizzazione tensione (durata 250 ms e che vanno da −140 a + 94 mV in 13 passi mV) alla cella di suscitare correnti della intero-cellula.</li>
	<li>Amplificare le correnti della intero-cellula, (angolo frequenza di 5 kHz) del filtro da un amplificatore di 700B. Convertire i dati da un convertitore 1440A e archivio per l'analisi offline.</li>
	<li>Misurare la capacità di membrana del OHCs utilizza un protocollo di stimolo di tensione due sinusoidale controllato da un software di patch clamp. Impostare l'intervallo di tensione di stimolare da -140 a 110 mV. Memorizzare i dati per l'analisi offline.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In ratti più giovani di giorno 11, nessun potenziale d'azione in risposta a stimolazione sonora potrebbe essere osservato nella corteccia uditiva6,7. Di conseguenza, postnatale giorno 11 è descritto come "inizio dell'udito"10. Lo sviluppo della funzione uditiva prima insorgenza di udienza non è stato ben studiato ancora. Utilizzando il metodo simile per la registrazione di ABR adulto, dimostriamo che ABRs potrebbe essere suscitata da scopp...

Due funzioni distinte di cellule ciliate sensoriali cocleari sono essenziali per l'udito dei mammiferi: trasduzione del mechanoelectric (MET) ed electromotility1,2. Dai canali MET situati nel fascio di capelli, IHCs (IHCs) e OHCs Converti vibrazione sonora in variazioni di potenziale di membrana, come pure i segnali elettrici dei neuroni del ganglio spirale innervate. OHCs cambiano la loro lunghezza di cella con il potenziale di membrana e amplificare la vibrazione del suono di basso livello. Questa attività definita electromotility è derivata dalla proteina motore prestin situato nella parete laterale del OHCs3.
In molte specie, tra cui roditori, la funzione uditiva è immatura in epoca postnatale iniziale4,5. Nessun potenziale d'azione in risposta ai segnali audio potrebbe essere rilevato nella corteccia uditiva prima della udienza inizio6,7. Sviluppo della morfologia e funzione della coclea è stata ampiamente studiate in mouse, gerbillo e ratto4,5,8. La meccanotrasduzione ed electromotility delle cellule ciliate sono anche sviluppati nei primi anni di vita epoca5.
Al fine di valutare la sensibilità di udienza dei ratti a diverse età postnatale, abbiamo sviluppato un metodo per la risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) registrazione nei cuccioli di ratto. Intero-cellula patch clamp è una tecnologia ideale per indagare il OHCs electrophysiologically. Tuttavia, confrontato con il morsetto di patch eseguito in neuroni ed altre cellule epiteliali, il basso tasso di cellule intere tenuta limitata l'inchiesta del electromotility di OHCs isolato.
Qui descriviamo una procedura per studiare il OHCs morfologicamente ed electrophysiologically nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Questo metodo può essere modificato per studiare i meccanismi molecolari che regolano la funzione e lo sviluppo della cellula ciliata interna.

<table><tbody><tr><td>Anestetico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1,5% in acqua</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Soluzione di dissezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 confezione in 1 L di acqua</td></tr><tr><td>Collagenasi IV Sigma</td><td></td><td>C5138</td><td>2 mg/mL in L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</ forte></td></tr><tr><td><forte>Soluzioni immunocoloranti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific 10010023</td><td></td><td>PH 7,3</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0,3% in PBS</td></tr><tr><td>Siero normale di capra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% in PBS</td></tr><tr><td>anticorpo prestin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-anticorpo coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Falloidina-Tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Nome</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Soluzione extracellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 confezione in 1 L di acqua</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Soluzione intracellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM<</td></tr><tr><td>strong>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmometro</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 Basic</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>WPI</td><td>14095</td><td>Pinzette dumont</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Strumento</td><td>Sutter MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini sistema operativo</td><td>Strumento Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati a basso rumore</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 relatore</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema TDT 3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP software</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software BioSigRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animal</strongCentro</td> Animale Sperimentale per Ratti ><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD</td><td>della Southern Medical University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere patch clamp registrazione in ratti postnatali

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

L'esterno della cellula ciliata è uno dei due tipi di cellule ciliate sensoriali nella coclea dei mammiferi. Essi alterano la loro lunghezza di cella con il recettore potenziale per amplificare la vibrazione debole del segnale a basso livello sonoro. La morfologia e la proprietà elettrofisiologiche delle cellule ciliate esterne (OHCs) si sviluppano in età postnatale precoce. La maturazione della cellula ciliata esterna può contribuire allo sviluppo del sistema uditivo. Tuttavia, il processo di sviluppo di OHCs non è ben studiato. Questo è in parte a causa della difficoltà per misurare la loro funzione da un approccio elettrofisiologico. Con lo scopo di sviluppare un metodo semplice per risolvere il problema di cui sopra, qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la funzione di OHCs nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Con questo metodo, possiamo valutare la risposta coclea agli stimoli di tono puro ed esaminare il livello di espressione e la funzione della proteina motore prestin nel OHCs. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare le cellule ciliate interne (IHCs).

ABR può essere suscitata da cuccioli del ratto anestetizzato oltre postnatale giorno 7 anni di età (P7) utilizzando gli scoppi di tono puro (Figura 1A). Come mostrato in Figura 1B, le forme d'onda ABR ottenuti da cuccioli del ratto ha mostrati solo tre o quattro distinte ondate con piccola ampiezza. Di solito, fino a sette cime sono state osservate nelle forme d'onda ABR di animali adulti (Figura 1B)...

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

L'obiettivo generale di questo test elettrofisiologico è quello di studiare i cambiamenti morfologici e funzionali delle cellule ciliate cocleari durante lo sviluppo postnatale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'assistente acustico, ad esempio quando le nostre cellule ciliate acquisiscono le loro funzioni durante l'inizio dell'udito? Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di valutare la funzione delle singole cellule ciliate fuori, isolate dai cuccioli di ratto postnatale.A dimostrare la procedura saranno Wenlu Pan, Shasha Guo e Nana Xu, studenti del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, posizionare l'animale anestetizzato in uno stampo in schiuma di polietilene per immobilizzare il corpo dell'animale. Quindi, posizionare l'animale su un tavolo antivibrante in una stanza fonoassorbente.Mantieni la temperatura corporea dell'animale a 37,5 gradi Celsius con un termoforo. Quindi, pulisci la zona della testa con etanolo al 70%. Praticare un'incisione da uno a due millimetri ventrale-lateralmente al padiglione auricolare esterno per posizionare l'elettrodo di riferimento o l'elettrodo di terra.Quindi, posizionare

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Whole-cell patch-clamp registrazioni da dendriti delle fibre nervose uditivo interno alla sinapsi nastro capelli cellule nella coclea di mammifero.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l'ultima generazione di software di analisi di immagine.

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

Lo scopo di questo video è dimostrare procedure per ottenere cellule sane capelli intatte dagli organi dell'orecchio interno di zebrafish adulti e poi li utilizzano per studi di patch clamp per caratterizzare le proprietà biofisiche di loro canali voltaggio-dipendenti.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Questo video mostra un metodo per registrare le risposte uditive del tronco encefalico (ABR) da cuccioli di ratto. Descrive i passaggi per il posizionamento degli elettrodi, l'applicazione dello stimolo sonoro e l'analisi dell'elaborazione del segnale nel tronco encefalico per valutare le risposte neurali.

Registrazione delle risposte uditive del tronco encefalico in un cucciolo di ratto

Questo video mostra la procedura per impiantare un dispositivo cocleare in un topo sordo e applicare stimoli elettrici per registrare le risposte uditive del tronco encefalico. Questa procedura consente di comprendere i meccanismi di base dell'udito elettrico e può contribuire ai progressi nella tecnologia degli impianti cocleari e nelle neuroscienze uditive.

Registrazione delle risposte uditive del tronco encefalico evocate elettricamente in un topo sordo

Questo video mostra la tecnica del patch-clamp per misurare le correnti ioniche nei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno. Descrive in dettaglio la preparazione e l'uso di una pipetta patch-clamp lucidata riempita con una soluzione interna contenente amfotericina B, che perfora la membrana per consentire il movimento degli ioni preservando le condizioni intracellulari. Gli impulsi di tensione vengono applicati per innescare e registrare l'attività dei canali ionici,...

Registrazioni perforate Patch-Clamp dei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno

Questo video dimostra l'esame dell'eccitabilità dei neuroni sensoriali nei gangli della radice dorsale utilizzando la tecnica del patch clamp per misurare la reobase e il potenziale di membrana, analizzando le risposte dei neuroni alle iniezioni di corrente incrementale.

Registrazioni di patch clamp a cellule intere su gangli della radice dorsale di ratto intatti

Questo manoscritto descrive come preparare i gangli delle radici dorsali intatti per le registrazioni con patch clamp. Questo preparato mantiene il microambiente per i neuroni e le cellule gliali satelliti, evitando così i cambiamenti fenotipici e funzionali osservati utilizzando i neuroni DRG dissociati.

Bloccare Registrazioni patch intatta dei gangli dorsali da ratti adulti

Presentiamo una tecnica per somministrazione localizzata di farmaci attraverso la via trans-timpanica nella coclea. Somministrazione di farmaci attraverso questa rotta non avrebbe interferito con l'efficacia anticancro dei farmaci chemioterapici come il cisplatino.

Veicolazione Trans-timpanico per il trattamento dell'ototossicità

L'audiometria di risposta evocata dal tronco encefalico è uno strumento importante nella neurofisiologia clinica. Al giorno d'oggi, l'audiometria di risposta evocata dal tronco encefalico viene applicata anche nella scienza di base e negli studi preclinici che coinvolgono modelli animali farmacologici e genetici. Qui forniamo una descrizione dettagliata di come le risposte del tronco encefalico uditivo possono essere registrate e analizzate con successo nei topi.

Acquisizione e analisi dei dati nel cervello evocato Audiometria di risposta nei topi

Di seguito sono presentati metodi che forniscono istruzioni dettagliate per la dissezione, la dissociazione, la coltura e la registrazione di patch-clamp dai neuroni gangliari vestibolari e gangliari a spirale dell'orecchio interno.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

Impara la registrazione patch clamp whole-cell in cellule ciliate esterne isolate da cuccioli di ratto postnatale per studiare lo sviluppo funzionale dell'udito. Questo metodo elettrofisiologico permette di analizzare le proprietà delle cellule cocleari.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali (Video) | JoVE Journal

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

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