Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

L'obiettivo generale di questo test elettrofisiologico è quello di studiare i cambiamenti morfologici e funzionali delle cellule ciliate cocleari durante lo sviluppo postnatale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'assistente acustico, ad esempio quando le nostre cellule ciliate acquisiscono le loro funzioni durante l'inizio dell'udito? Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di valutare la funzione delle singole cellule ciliate fuori, isolate dai cuccioli di ratto postnatale.

A dimostrare la procedura saranno Wenlu Pan, Shasha Guo e Nana Xu, studenti del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, posizionare l'animale anestetizzato in uno stampo in schiuma di polietilene per immobilizzare il corpo dell'animale. Quindi, posizionare l'animale su un tavolo antivibrante in una stanza fonoassorbente.

Mantieni la temperatura corporea dell'animale a 37,5 gradi Celsius con un termoforo. Quindi, pulisci la zona della testa con etanolo al 70%. Praticare un'incisione da uno a due millimetri ventrale-lateralmente al padiglione auricolare esterno per posizionare l'elettrodo di riferimento o l'elettrodo di terra.

Quindi, posizionare un elettrodo di registrazione sottocutaneo sul vertice del cranio. Utilizzando il generatore di funzioni, genera esplosioni di tono calibrate di varie frequenze e intensità. Eroga gli stimoli sonori attraverso un altoparlante elettrostatico situato a 10 centimetri di distanza dalla testa dell'animale.

Per ottenere le risposte uditive del tronco encefalico, i potenziali suscitati dal suono vengono filtrati, amplificati e mediati utilizzando un processore multifunzione. La registrazione ABR di 40 minuti viene monitorata online e archiviata per l'analisi offline. In questa sezione, sterilizzare la testa dell'animale spruzzando con etanolo al 70%.

Quindi, apri il cranio lungo la linea mediana sagittale con le forbici e rimuovi il cervello per esporre l'orecchio interno. Quindi, trasferisci l'orecchio interno in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con tre millilitri di L-15 Medium ghiacciato di Leibovitz. Sotto il microscopio di dissezione, utilizzare una pinza fine per rimuovere la capsula ossea della coclea.

Dopodiché, scartare OC e SV associati da modiolus. Tenendo la porzione basale della SV con una pinza, separare completamente l'OC dalla SV svolgendo lentamente dalla base all'apice. Successivamente, tagliare OC in modo uniforme in tre pezzi utilizzando le forbici fini.

Tutti i passaggi devono essere eseguiti in L-15 ghiacciato il più velocemente possibile al fine di ridurre al minimo la degradazione e il deterioramento dei tessuti. In questa fase, utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, trasferire i segmenti di OC su un vetrino. Fissarli con 100 microlitri di paraformaldeide al 4% per almeno quattro ore a quattro gradi Celsius.

Successivamente, lavare il fazzoletto spostando la paraformaldeide con 100 microlitri di PBS fresco. Quindi, lavare il fazzoletto tre volte per 10 minuti ogni volta. Successivamente, incubare il tessuto con l'agente di permeabilità allo 0,3% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo 30 minuti, scartare l'agente di permeabilità e lavare il tessuto tre volte con PBS. Successivamente, bloccare il tessuto con il 10% di siero di capra normale e PBS per un'ora a temperatura ambiente. Incubare il tessuto con anticorpo anti-prestin C terminus e soluzione bloccante per due ore a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius durante la notte.

Quindi, lavare il fazzoletto tre volte con PBS per cinque minuti ogni volta. Successivamente, incubare il tessuto con l'anticorpo secondario coniugato Alexa 488 in soluzione bloccante per un'ora a temperatura ambiente al buio. Lavare il fazzoletto tre volte con PBS per cinque minuti ogni volta al buio.

Quindi, incubare il tessuto con la falloidina della rodamina per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare il fazzoletto tre volte con PBS per cinque minuti al buio. Quindi, montare il campione su un vetrino con mezzo di montaggio.

Visualizzalo con la microscopia confocale utilizzando laser a 405 nanometri, 488 nanometri e 594 nanometri. In questa procedura, utilizzare l'estrattore per pipette e il microforgiatore. Realizzare pipette per cerotti con un diametro del puntale di due o tre micron.

Quindi, riempire nuovamente le pipette con la soluzione intracellulare. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri, trasferire un pezzo di OC in una capsula di Petri da 35 millimetri. Digerire il tessuto con 100 microlitri di terreno di digestione enzimatica per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, spostare il mezzo di digestione enzimatica con 100 microlitri di L-15. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi usando un microbisturi per isolare le cellule ciliate. Dopo un pipettaggio delicato, trasferire le cellule in una piccola camera di plastica fatta in casa riempita con una soluzione da bagno priva di enzimi.

Quindi, posiziona la camera sul tavolino di un microscopio invertito e trova gli OHC solitari dall'aspetto sano. Successivamente, caricare la pipetta patch nello stadio principale di un amplificatore 700B. Posizionare la pipetta per cerotti attorno alla parte inferiore della cellula ciliata esterna.

Successivamente, il cerotto a cellula intera blocca l'OHC sigillando la parete laterale del corpo cellulare. Applicare una leggera aspirazione fino alla rottura della membrana cellulare. Quindi, impostare il potenziale di mantenimento a 70 millivolt.

Le celle con resistenza di accesso compresa tra 10 e 17 megaohm e resistenza di membrana compresa tra 100 e 500 megaohm sono considerate una configurazione di cella intera di successo. Applicare una tensione iperpolarizzante e depolarizzante alla cella per suscitare correnti di intere cellule. Misura la capacità di membrana degli OHC utilizzando un protocollo di stimolo di tensione a due onde sinusoidali controllato dal software patch clamp.

Impostare l'intervallo di tensione di stimolazione da 140 a 110 millivolt e memorizzare i dati per l'analisi offline. Dopo una digestione delicata, gli OHC sono stati isolati dall'OC. Le registrazioni del voltage clamp dell'intera cellula sono state eseguite da OHC acutamente isolati dalla coclea di ratto. Qui è mostrato un esempio rappresentativo della corrente dell'intera cella registrata da un OHC P9 isolato in risposta al potenziale di membrana modificato da 140 a 107 millivolt.

Questa figura mostra la capacità di membrana non lineare ottenuta da due OHC ad età diverse. Le risposte in tensione di capacità sono state adattate alla funzione di Boltzmann. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore, se eseguita in modo appropriato.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come il Western blotting e la PCR per rispondere a ulteriori domande, come la valutazione del livello di espressione di alcune proteine, come la prestin nelle cellule ciliate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule ciliate per esplorare le proprietà elettrofisiologiche nel sistema cocleare e vestibolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare i cambiamenti morfologici e funzionali delle cellule ciliate cocleari durante lo sviluppo postnatale.