Protocollo per acuto e prove di ecotossicità cronica del turchese Killifish Nothobranchius furzeri

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare gli effetti delle sostanze tossiche sul killifish turchese Nothobranchius furzeri. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecotossicologia, come gli effetti a lungo termine dei fattori di stress su importanti tratti della storia della vita, come il tempo di maturazione, la crescita o la fecondità. Il vantaggio principale di questo esperimento è che utilizziamo un vertebrato con un ciclo di vita molto veloce, con conseguente efficienza in termini di tempo e costi.

Questi killifish sono modelli ideali per studiare l'impatto degli effetti a lungo termine e multigenerazionali dei fattori di stress. In ultima analisi, contribuiranno a una migliore comprensione dell'impatto ambientale delle sostanze tossiche. Sebbene questo metodo possa fornire nuove informazioni sugli effetti combinati delle sostanze tossiche e della temperatura, può essere applicato anche ad altri fattori di stress come le radiazioni UV, la privazione di cibo e le alterazioni del PH.

I killifish sono difficili da lavorare, perché sono un nuovo sistema modello in ecotossicologia e perché la loro sensibilità a molti inquinanti è ancora sconosciuta. Abbiamo sviluppato l'idea di questo metodo sperimentale quando abbiamo appreso per la prima volta dell'eccezionale durata di vita dei killifish e della loro capacità di produrre uova dormienti che possono essere conservate per anni sullo scaffale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il tipo di esperimento, così come la gestione degli individui, possono alterare i risultati.

Per iniziare, seleziona le uova di gona ray, o GRZ, nella fase D3, che sono riconoscibili dalla presenza di occhi dorati. E usa un paio di pinzette morbide per trasferirli delicatamente in un serbatoio di plastica da due litri. Aggiungi un centimetro del mezzo di schiusa a 12 gradi Celsius e lascia che la temperatura dell'acqua si adatti gradualmente alla temperatura ambiente.

Dopo 24 ore, somministrare ai piccoli una dose concentrata di naupli di artemia appena nati e aumentare la profondità dell'acqua a cinque centimetri aggiungendo il mezzo di coltura per pesci. 48 ore dopo la schiusa, trasferire le larve sane e galleggianti in contenitori individuali con mezzo di esposizione e concentrazioni tossiche come descritto nel protocollo di testo. Ogni mattina e sera, controlla i pesci per la mortalità, lo stress e la malattia e calcola i valori di LC50 secondo il protocollo di testo.

Eseguire una prova di esposizione cronica riempiendo i singoli contenitori con il mezzo di esposizione corretto e aggiungere un tubo dell'aria per aerare il barattolo. Trasferisci il pesce nei barattoli per il resto dell'esperimento. Da due a 23 giorni dopo la schiusa o DPH, nutrire il pesce con naupli di artemia due volte al giorno ad libitum.

Quindi, dopo aver integrato con larve di chironomus tritate fino a 37 DPH, utilizzare larve di chironomus congelate per nutrire il pesce ad libitum due volte al giorno, tutti i giorni, andando avanti. Per determinare la crescita, misurare le dimensioni corporee su base settimanale, trasferendo il pesce in una capsula di Petri riempita con terreno dal serbatoio. Scatta da quattro a cinque foto con vista dorsale calibrata per le dimensioni del pesce a un'altezza fissa.

E usa un programma di misurazione spaziale per analizzarli digitalmente. Da 15 DPH in poi, ispezionare visivamente il pesce maschio per la colorazione, per determinare la maturazione. Controlla le pinne per i primi segni di colorazione nuziale e usa il giorno in cui la colorazione del pugno era visibile come proxy per il tempo di maturazione del maschio.

A partire da 30 DPH, verificare la fecondità allestendo una vasca di deposizione delle uova da un litro per coppie mature maschio e femmina all'interno di ogni trattamento, utilizzando il mezzo di esposizione dell'acquario del maschio e integrandola con il substrato di deposizione delle uova. Trasferisci sia il maschio che la femmina nella vasca di deposizione delle uova. E riducendo al minimo l'attività umana o il disturbo intorno ai contenitori per la deposizione delle uova, consenti loro di deporre le uova per due ore.

Successivamente, senza inutile miscelazione dell'acqua, che farebbe roteare le uova nel substrato di deposizione delle uova, trasferisci delicatamente i pesci nei loro contenitori originali. Filtrare le uova versando il substrato di deposizione delle uova su una maglia di 500 micrometri. Contare le uova e utilizzare una pipetta per trasferirle nel muschio di torba umido in piastre di Petri.

Rimuovere le uova morte ogni giorno. Dopo una settimana, utilizzare una pellicola sigillante per sigillare la capsula di Petri. E conservalo in un'incubatrice a temperatura controllata a 28 gradi Celsius, con un ciclo da 14 a 10 da luce a buio, per uno sviluppo immediato alla fase D3.

Per una conservazione a lungo termine, conservare le uova in un'oscurità costante a 17 gradi Celsius, dopodiché le uova entrano nella fase dormiente e rimangono vitali per diversi anni. Per reclutare i pesci dalle uova dormienti, trasferite le uova a 28 gradi Celsius e un ciclo da 14 a 10 da luce a buio, per circa tre settimane, per consentire loro di svilupparsi fino alla fase D3. Per misurare il massimo termico critico, o CT max, dei pesci adulti, iniziare con un bagno d'acqua a circolazione continua, riscaldato a una velocità costante di 0,33 gradi Celsius al minuto.

Aggiungete diversi acquari da un litro, per ogni singolo pesce. Inizia il percorso aggiungendo il pesce all'acquario, quando l'acqua ha raggiunto la temperatura di allevamento sperimentale del pesce. Utilizza un termometro digitale per monitorare la temperatura negli acquari da un litro del bagno CT max, ogni cinque minuti.

Quando il pesce non riesce a mantenere una posizione eretta ventrale dorsale, o inizia a contrarsi pesantemente, misura la temperatura nell'acquario da un litro, che è la temperatura massima critica. Quindi, trasferisci il pesce nel suo alloggiamento sperimentale per il recupero. Come mostrato in questo grafico, l'esposizione acuta di enfurzeri a diverse concentrazioni di rame, ha causato un aumento della mortalità con l'aumentare della concentrazione di sostanze tossiche.

I valori di LC50 diminuiscono nel tempo, il che significa che con concentrazioni decrescenti, passa più tempo prima che il 50% delle repliche muoia. Nel test di esposizione cronica, utilizzando rame acquoso, i pesci sono più corti in lunghezza, misurata dopo tre settimane quando allevati alla massima concentrazione testata. In questo esperimento con clorpirifos o CPH a base acquosa, quando allevato a 28 gradi Celsius, i pesci hanno prodotto meno uova quando esposti alla più alta concentrazione di CPF, tuttavia, a 30 gradi Celsius, i pesci di controllo hanno prodotto più uova rispetto ai pesci esposti a entrambe le concentrazioni di CPF, indicando che la combinazione di CPF e un aumento della temperatura ha influenzato la fecondità più di ciascun fattore di stress separatamente.

Qui è riportata l'età media in cui sono comparsi i primi segni di colorazione nei maschi enfurzeri, esposti a CPF a 28 e 30 gradi Celsius. Dopo l'esposizione a quattro microgrammi per litro di CPF, il pesce maschio ha impiegato il 18% in più per maturare rispetto al pesce di controllo. La misurazione del CT max dei pesci allevati a 24 o 28 gradi Celsius e l'esposizione all'inquinante 3,4-DCA hanno rivelato che il nuoto irregolare, l'aumento del movimento opercolare e la perdita della capacità di rimanere in posizione eretta dorsoventralmente si sono verificati a una temperatura più bassa quando i pesci sono stati allevati a 24 gradi Celsius.

Una volta padroneggiato, questo protocollo, compresi gli effetti sulla fecondità, può essere misurato in due mesi. Per misurare gli effetti sull'intero periodo riproduttivo o anche su una generazione successiva, il protocollo può essere esteso, ma può ancora essere eseguito in sei mesi.