Name: Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: Impara lo screening di piccole molecole e la valutazione della tossicità nelle larve di Danio rerio in fase iniziale. Questo metodo consente di analizzare gli effetti di farmaci sullo sviluppo embrionale con osservazione morfologica.

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<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
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<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
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<li>Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+the+management+of+patients+treated+with+bosutinib+for+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Hematol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia.</a> Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 &; L micropipetta (P10)</td><td>Gilson</td><td>F144802&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10/20 & micro; L puntali per pipette</td><td></td><td>Starlab S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L micropipetta (P1000)</td><td>Gilson</td><td>F123602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L puntali per pipette</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>Sterile, monofascio, non trattato, con coperchio</td></tr><tr><td>20 &; L micropipetta (P20)</td><td>Gilson</td><td>F123600&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L micropipetta (P200)</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L pipetta multicanale&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntali per pipette a L</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>Sterile, a avvolgimento singolo, a fondo piatto, non trattato, con coperchio</td></tr><tr><td>Vasche di allevamento con griglia interna a fondo inclinato, divisori e coperchi Tecniplast</td><td></td><td>ZB17BTISLOP, ZB17BTE,&nbsp; ZB17BTL, ZB17BTD</td><td>Serbatoio interno inclinato</td></tr><tr><td>Filtro a rete</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Mercator</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Petri-dish&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394/CC7672-3359</td><td>100 x 20 mm o 60 x 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA Stereomicroscopio a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore raffreddato a Peltier con 2 ripiani con modulo luminoso bianco freddo</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>Dotato di ciclo</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> giorno/notte <tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td><td>Preparare una soluzione all'1% in E3</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Biochem Chemopharma</td><td></td><td>303080500 Preparare E3</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td><td>Preparare E3</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>316030500</td><td>Preparare E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL&nbsp; Wnt Pathway library (Bosutinib)</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>Per preparare E3</td></tr></tbody></table>

screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

Le anomalie possono essere osservate singolarmente o cumulativamente nel corso della sequenza temporale sperimentale fino a 7 dpf. Il punteggio morfologico massimo per anomalia può essere utilizzato per calcolare le anomalie morfologiche come percentuale del numero di larve utilizzate. Ad esempio, se il giorno 7 i punteggi morfologici dell'edema pericardico sono rispettivamente a 19 e 20 per i punteggi 1 e 2, su un punteggio possibile di 24, il che significa che 19 o 20 larve su 24 mostrano edema pericardico, il punteggio percentuale può essere calcolato come:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg">
La tabella supplementare S1 mostra i risultati del punteggio morfologico (di entrambi i punteggi) a 4 dpf a seguito di test di tossicità per il composto Bosutinib, un inibitore della tirosin-chinasi indicato per il trattamento della leucemia mieloide cronica15. Lo stesso punteggio morfologico viene ripetuto per i pesci esposti di età compresa tra 5 dpf e 7 dpf. Il composto è stato testato utilizzando un intervallo di concentrazione da 100 μM a 6,25 μM. Tre repliche tecniche sono state condotte in momenti diversi e il tasso medio di mortalità cumulativa a 7 dpf è stato utilizzato per determinare LC50, la concentrazione alla quale sopravvive il 50% delle larve. La LC50 può essere determinata in qualsiasi momento di esposizione. Tuttavia, si consiglia di calcolarlo a 7 dpf.
La mortalità media cumulativa a 7 dpf è stata utilizzata per generare una curva LC50 , che può essere vista nella Figura 3. Per Bosutinib, la concentrazione di LC50 è stata stimata in 37,95 μM.
NOTA: Questa concentrazione stimata di LC50 si applica strettamente a questo sistema modello e può quindi essere utilizzata per ulteriori saggi di fenotipizzazione a valle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg"> 
Figura 1: Schema dello screening farmacologico proposto nelle larve a 3-7 dpf. Le piastre di prova a 96 pozzetti sono predisposte per lo studio di cinque concentrazioni che vanno da 100 μM a 6,25 μM per il composto Bosutinib. Abbreviazione: dpf = giorni dopo la fecondazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg"> 
Figura 2: Difetti morfologici rappresentativi osservati nelle larve di zebrafish a 5 dpf esposte a varie concentrazioni chimiche (a 2 giorni dall'esposizione). (A) Zebrafish di controllo (non affetto), (B) Larva di zebrafish che mostra lieve edema pericardico, (C) Zebrafish con grave edema pericardico ed emorragia del tuorlo, (D) Zebrafish con ritardo dello sviluppo, pigmentazione ridotta, vescica natatoria piccola, (E) Zebrafish con tuorlo gonfio e pinna caudale attorcigliata, (F) Zebrafish con assenza di pinna caudale, (G) Zebrafish con notocorda ricurva, (H) Zebrafish con coda tronca, e (I) Pesce zebra morto con necrosi. I difetti sono indicati con punte di freccia rosse. Barre della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg"> 
Figura 3: Curva LC50 che mostra la concentrazione rispetto alla % di mortalità. Le cinque concentrazioni testate erano 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM e 6,25 μM, con una percentuale di mortalità rispettivamente del 100%, 100%, 29,2%, 12,5% e 12,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Difetti morfologici</td>
			<td>Descrizione</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edema pericardico</td>
			<td>Accumulo di liquidi intorno al cuore con cuore teso e malfunzionamento della circolazione sanguigna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battiti cardiaci (al minuto)</td>
			<td>Riduzione del numero di battiti al minuto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuorlo</td>
			<td>Presenza o assenza di edema o emorragia del tuorlo che possono verificarsi contemporaneamente a difetti cardiaci</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolunga del tuorlo</td>
			<td>Tuorlo gonfio, sottile o assente</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notocorda curva</td>
			<td>Presenza di una notocorda attorcigliata o ondulata e/o di una coda curva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vescica natatoria</td>
			<td>Presenza, assenza o sviluppo parziale della vescica natatoria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pigmentazione</td>
			<td>Meno o nessun melanocito rispetto ai pesci non trattati della stessa età</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necrosi</td>
			<td>Presenza (lieve o grave) o assenza di necrosi in qualsiasi parte del corpo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sviluppo ritardato</td>
			<td>Sviluppo ritardato o in stallo rispetto ai controlli wild-type della stessa età.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Risposta al tocco</td>
			<td>Risposta ritardata o assente a seguito di uno spavento (ad esempio, utilizzando un puntale per pipetta)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troncamento</td>
			<td>Assenza del corpo posteriore del pesce zebra (cioè formazione della coda)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinne</td>
			<td>Presenza o assenza della pinna caudale che può essere accompagnata da una sottile estensione del tuorlo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asse del corpo ridotto</td>
			<td>Pesci che sembrano normali ma che vengono misurati sono di lunghezza inferiore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Un elenco di difetti morfologici visivi che possono essere osservati a seguito di studi sull'esposizione ai farmaci.
Tabella supplementare S1: Risultati morfologici rappresentativi per Bosutinib a 4 dpf (1 giorno dopo l'esposizione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

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