Name: Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nellevoluzione della resistenza agli Antibiotico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri un metodo sperimentale per studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotici in E. coli. Questa tecnica utilizza metodi di biologia molecolare di base per analizzare le innovazioni batteriche.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Instituto de Salud Carlos III (Plan Estatal de I + D + io 2013-2016): concede CP15-00012, PI16-00860 e CIBER (CB06/02/0053), co-finanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale ' un modo per raggiungere l'Europa ' (FESR). JAE è supportato dal programma Atracción de talento del governo della regione di Madrid (2016-T1/BIO-1105) e I + D Excelencia di spagnolo Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM è supportato da un Miguel Servet Fellowship da Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) co-finanziato dal Fondo sociale europeo The "Investiamo nel vostro futuro" (FSE) e del FESR.

1. costruzione dell'apparato sperimentale, codifica il Gene di resistenza agli antibiotici
Nota: Qui MG1655 di e. coli è stato usato come il ceppo destinatario del gene di resistenza antibiotica plasmide o cromosoma-codificati. Il gene di resistenza agli antibiotici è codificato in cromosoma o un plasmide multicopia in un ceppo altrimenti isogeniche (Figura 1).
<ol><li>
Inserimento del gene di resistenza agli antibiotici a λ dei fagi integrazione sito (attB)20 del cromosoma di MG1655.
	<ol>
<li>Amplificare 500 bp-lungo regioni su entrambi i lati del sito cromosomico attB mediante PCR. Utilizzo di oligonucleotidi YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') e attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') per la regione di omologia sinistra e attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') e YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') per quello giusto. Amplificare il gene di resistenza diTEM-1 blautilizzando primers Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') e Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Disegnare primers con circa 20 bp (nel 5' UTR) della sequenza mostrando complementarità al frammento che sta per essere fusa a.</li>
		<li>Fusibile di regioni di omologia per il prodotto PCR del gene resistenza agli antibiotici (compresa la regione del promotore) utilizzando isotermici Assemblea21, a 50 ° C per 30 min.</li>
		<li>Electroporate MG1655 cellule contenenti plasmide pKOBEG. Nota: pKOBEG è un vettore termosensibile che contiene il λ rosso macchinari, promuovendo gli scambi allelico basati su omologia tra il cromosoma e di prodotti PCR22.<ol>
<li>Utilizzare 1 µ l di prodotto dal passaggio 1.1.223 in 40 µ l di celle electrocompetent in cuvette di 2 mm a 4 ° C e 2,5 kV. Risospendere le cellule in 1 mL di brodo LB + 0,2% arabinosio per mantenere l'espressione del λ rosso macchinari.</li>
			<li>Trasferire il volume totale in una provetta di microfuge e incubare 2 ore a 30 ° C (temperatura permissiva per pKOBEG) con intenso scuotimento (200 giri/min in un agitatore orbitale) per consentire l'espressione fenotipica dei marcatori di resistenza inserita nel cromosoma.</li>
			<li>Piastra le cellule su LB agar che contengono l'antibiotico adatto per selezionare per il gene di resistenza agli antibiotici (ampicillina o carbenicillina a 100 mg/l per blaTEM-1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Piastra di 100 µ l su una piastra di Petri e spin giù il resto del volume, e risospendere in 100 µ l di brodo LB fresco e piatto si su un'altra piastra di Petri. Incubare per una notte a 42 ° C. Nota: Questa temperatura è non permissivi per la replicazione del pKOBEG. Le colonie in grado di crescere in queste condizioni avrà perso pKOBEG e presenterà il gene di resistenza integrato nel sito attB (per semplicità si chiamerà questo ceppo MG1655::resA da qui su).</li>
		<li>Test per la perdita di pKOBEG replicando le colonie di interesse in piastre con cloramfenicolo (antibiotico contro cui pKOBEG contiene un indicatore di resistenza). Nota: La mancanza di crescita nelle piastre di cloramfenicolo alla temperatura permissiva di 30 ° c è indicativo dell'assenza del plasmide.</li>
		<li>Al fine di verificare i cloni, PCR amplificano la costruzione utilizzando primer esterno YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') e YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), verificare, mediante elettroforesi su gel, la dimensione corretta del amplicon e sequenza la prodotto purificato per assicurare che la sequenza del gene inserito sia corretta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inserire il gene di resistenza agli antibiotici in un plasmide multicopia. Nota: Poiché plasmidi con numero di copie di altissima tendono a imporre una forte riduzione nella forma fisica host batterica, si consiglia l'uso di plasmidi multicopia con un'origine naturale di replica, ad esempio p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-tipo origine di replica24). Questi plasmidi di solito presentano un numero di copia moderata di circa 15-20 copie per cellula.<ol>
<li>PCR amplificare il gene di resistenza agli antibiotici di scelta (tra cui la regione del promotore), il prodotto PCR di fosforilare e lega i alla dorsale della PCR amplificati del plasmide:<ol>
<li>PCR amplificano il gene di resistenza agli antibiotici; per blaTEM-1 utilizzare primer Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') e Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').</li>
			<li>Fosforilare il prodotto purificato utilizzando della chinasi di polinucleotide T4, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
			<li>PCR amplificano la spina dorsale del plasmide usando un ad alta fedeltà della polimerasi e oligonucleotidi pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') e pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').</li>
			<li>Lega i due frammenti di PCR utilizzando T4-ligasi seguendo le linee guida del produttore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Electroporate, come descritto in precedenza, 40 µ l di celle electrocompetent Escherichia coli DH5-α con un massimo di 1 µ l di prodotto di legatura e selezionare sugli antibiotici adatti per il gene di resistenza agli antibiotici (ampicillina o carbenicillina a 100 mg/L per blaTEM-1) e la spina dorsale del plasmide. Nota: Completare LB con arabinosio qui è inutile.</li>
		<li>Estrarre il plasmide utilizzando il kit commerciale mini-preparazione di scelta del lettore:<ol>
<li>Raccogliere 5 mL di una coltura durante la notte mediante centrifugazione a 12.000 x g a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 250 µ l di soluzione di risospensione e mescolare bene. Aggiungere 250 µ l di soluzione di lisi e mescolare bene. Aggiungere 350 µ l di neutralizzazione e mescolare bene.</li>
			<li>Trasferire il surnatante nella colonna di associazione DNA fornita con il kit, centrifugare per 1 min e scartare il flusso attraverso. Lavare due volte la colonna con 500 µ l di soluzione di lavaggio, centrifugazione per 1 minuto e scartando l'attraversamento a ogni lavaggio. Centrifugare la colonna vuota per ulteriori 1 min rimuovere il tampone di lavaggio residua.</li>
			<li>Inserire la colonna in una provetta pulita e aggiungere 50 µ l di acqua ultra-pura per la membrana per eluire il DNA purificato. Centrifugare per 1-2 min e raccogliere il flusso attraverso che contiene il plasmide purificato. Sequenza del gene di interesse nel plasmide utilizzando primers da fuori la sequenza inserita per confermare che la sequenza è corretta e che nessuna mutazione sono presente nel gene di resistenza prima gli esperimenti di evoluzione di Sanger.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Una volta verificata la sequenza, electroporate il plasmide nel ceppo di e. coli MG1655, come descritto in precedenza. Nota: Questo produce ceppo MG1655/pRESA.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. evolutivo Rescue approccio ad evolversi sperimentalmente la resistenza agli antibiotici (Figura 1)
<ol><li>Striscia fuori i ceppi in fase di studio sulle piastre di LB: MG1655::resA e MG1655/pRESA oltre il ceppo parentale suscettibile, MG1655. Nota: Plasmide pRESA dovrebbe essere stabile in MG1655, c'è nessuna necessità di aggiungere antibiotici per le piastre LB. Tassi di mutazione in e. coli sono abbastanza bassi, quindi una volta verificata la costruzione non è necessario verificare la sequenza di plasmide ad ogni passo.</li>
	<li>Preparare le piastre da 96 pozzetti con 200 µ l di LB in ciascun pozzetto e inoculare 48 colonie isolate di ogni ceppo in pozzetti indipendenti (una piastra per ceppo). Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C e 200 giri/min. Tenere una scorta congelata di queste popolazioni fondatrici. Nota: Per prevenire e controllare per cross-contaminazione della coltura in piastre da 96 pozzetti, utilizzare un design piatto della scacchiera di intercalanti pozzetti inoculati con medium senza batteri in tutta la piastra a 96 pozzetti. Utilizzare questo disegno piastra durante l'intero sviluppo sperimentale.</li>
	<li>Iniziare l'esperimento evolutivo salvataggio inoculando 2 µ l da ogni pozzetto delle piastre con le popolazioni del fondatore in nuove piastre da 96 pozzetti con 198 µ l di LB in ciascun pozzetto con una sub concentrazione di antibiotico in fase di studio. Per l'approccio evolutivo salvataggio inizia con ¼ o 1/8 della concentrazione inibitoria minima (MIC, determinato precedentemente25) dell'antibiotico in LB per ciascuno dei tre ceppi e raddoppiare la concentrazione del quotidiano antibiotico. Utilizzare questo approccio per massimizzare le possibilità delle popolazioni di acquisire resistenza mutazioni26. Incubare le piastre a 37 ° C e 200 giri/min per 20 h. Nota: Misurare il pernottamento OD delle popolazioni fondatore. Se ci sono differenze significative nella OD tra ceppi correggere l'inoculo iniziale per avviare l'esperimento con lo stesso numero di cellule per pozzetto.</li>
	<li>Ogni giorno, misurare il diametro esterno di ogni popolazione dopo una notte cultura ed eseguire un trasferimento delle culture, come descritto al punto 2.3, a nuove piastre da 96 pozzetti con doppio della concentrazione dell'antibiotico rispetto al giorno prima. Incubare le piastre 20 h a 37 ° C e 200 giri/min. Nota: Il fattore di diluizione di 1: 100 produce circa 6-7 generazioni al giorno.</li>
	<li>In parallelo, è necessario propagare controllare le popolazioni di ogni ceppo nelle stesse condizioni come descritto ai punti 2.3 e 2.4, ma in assenza di antibiotici. Nota: Controllare le popolazioni di aiutare a discriminare tra mutazioni derivanti a causa della presenza di antibiotici e di mutazioni generale aiutando i batteri di adattarsi alle condizioni sperimentali. Parallele mutazioni derivanti in assenza di antibiotici sono suscettibili di essere aiutare i batteri di adattarsi alle condizioni sperimentali e non correlate alla resistenza agli antibiotico.</li>
	<li>Tenere traccia del numero delle popolazioni sopravvissute, ogni giorno, misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 600 nm (OD) delle culture utilizzando un lettore di piastra. Nota: I valori di densità ottica inferiore a 0,1 indicano l'estinzione della popolazione. Vedere la Figura 2 per un esempio di curve di sopravvivenza.</li>
	<li>Tenere una scorta congelata di tutte le popolazioni periodicamente (ogni 3-5 giorni).</li>
	<li>Utilizzare test log-rank [pacchetto "sopravvivenza" in RStudio (versione 0.99.486)] per determinare le differenze statistiche nella sopravvivenza delle popolazioni di diversi ceppi nel corso del tempo sotto la crescente concentrazione di antibiotici12. Nota: Questo esperimento determinerà se plasmidi multicopia potenziare l'evoluzione della resistenza agli antibiotico per la particolare antibiotico e gene in esame.</li>
</ol>3. base molecolare dell'evoluzione della resistenza agli antibiotici (Figura 1)
<ol><li>Eseguire estrazioni di DNA totale da un numero rappresentativo di popolazioni e cloni tra ceppi e trattamenti. Comprendono i ceppi parentali (MG1655, MG1655::resA e MG1655/pRESA) per essere in grado di rilevare le mutazioni accumulando durante l'esperimento. Nota: Per esempi di kit di estrazione del DNA, vedere la tabella dei materiali. Ogni kit contiene diversi protocolli; seguire le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Quantificare la concentrazione e la qualità del DNA. Ci sono diversi metodi per determinare la concentrazione e la qualità del DNA. Determinare la qualità della misura dei rapporti di assorbanza 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm. Utilizzare un colorante fluorescente, di legame al DNA per misurare la concentrazione di DNA seguendo le istruzioni del produttore, e l'elettroforesi del gel dell'agarosi per confermare che non c' non è Nessuna degradazione del DNA o RNA contaminazione.</li>
	<li>Sequenziamento di DNA profondo uso da campioni di intere popolazioni e singoli cloni di indagare le basi genetiche della resistenza agli antibiotico. Nota: Abbiamo condotto sequenziamento tutti presso il Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Oxford, UK. Per maggiori dettagli vedere San Millan et al. 201612.</li>
	<li>Utilizzare il breseq 0.26.1 pipeline27,28 per rilevare le mutazioni, utilizzando la modalità di polimorfismo per valutare la frequenza delle mutazioni nella popolazione. Confrontare i diversi genomi evoluti al genoma parentale per rilevare le mutazioni che si sono accumulate durante l'esperimento.</li>
	<li>Confronta le mutazioni accumulate in parallelo nelle popolazioni di controllo con quelle delle popolazioni si è evoluto sotto la crescente concentrazione di antibiotici per differenziare tra mutazioni aiutando i batteri di adattarsi alle condizioni sperimentali ( quelli hanno trovato nelle popolazioni di controllo) e coloro che sono coinvolti nella resistenza agli antibiotici (quelli trovati esclusivamente in popolazioni sottoposte alla pressione antibiotica). Nota: Il numero di mutazioni parallele è solitamente basso, così diverse mutazioni parallele fra i trattamenti è facilmente valutabile. A parte le mutazioni nel gene della resistenza agli antibiotici in fase di studio che è molto probabile trovare altre mutazioni associate resistenza antibiotica nel cromosoma, tali mutazioni in porins o efflusso sistemi12.</li>
	<li>Ricostruire le mutazioni nel gene della resistenza agli antibiotici in ceppo parentale utilizzando lo stesso approccio come sezione 1 del presente protocollo. Seguire i punti 1.1 e 1.2 del protocollo per introdurre le nuove mutazioni in background parentale (utilizzando i geni evoluti come un modello PCR). Analizzare i fenotipi di resistenza agli antibiotici di queste nuove costruzioni per confermare il ruolo delle mutazioni.</li>
</ol>

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<li>Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycoside+modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist+Updat%22%5BJournal%5D)">Aminoglycoside modifying enzymes.</a> Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).</li>
<li>Jerison, E. R., Desai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+investigations+of+evolutionary+dynamics+and+epistasis+in+microbial+evolution+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).</li>
<li>Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genomic+Basis+of+Evolutionary+Innovation+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genet. 12 (5), 1006005(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Vi presentiamo un nuovo protocollo che unisce la biologia molecolare, evoluzione sperimentale e sequenziamento del DNA profondo destinato per studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico nei batteri. Sebbene questo protocollo combina tecniche provenienti da diversi campi, tutti i metodi necessari per svilupparlo sono semplici e possono essere eseguiti in un laboratorio di microbiologia regolari. I passaggi più critici nel protocollo sono probabilmente la costruzione di ceppi...

Resistenza agli antibiotici nei batteri è un problema di salute importante1. A un livello fondamentale, la diffusione della resistenza agli antibiotico nei batteri patogeni è un semplice esempio dell'evoluzione attraverso la selezione naturale2,3. In parole povere, l'uso di antibiotici genera la selezione di ceppi resistenti. Un problema chiave nella biologia evolutiva, pertanto, è di comprendere i fattori che influenzano la capacità delle popolazioni batteriche di evolvere la resistenza agli antibiotici. Esperimenti di selezione sono emerse come uno strumento molto potente per studiare la biologia evolutiva dei batteri, e questo campo ha prodotto incredibili intuizioni in una vasta gamma di problemi evolutivi4,5,6. In evoluzione sperimentale, popolazioni batteriche avviate da un unico ceppo parentale in serie sono attraversate in condizioni definite e strettamente controllate. Alcune delle mutazioni che si verificano durante la crescita di queste culture aumentare la forma fisica batterica, e questi diffondere attraverso le culture tramite la selezione naturale. Durante l'esperimento, campioni delle popolazioni sono periodicamente criogenicamente conservati per creare un record di fossili congelato non in evoluzione. Un ampio numero di approcci può essere utilizzato per caratterizzare in evoluzione di popolazioni batteriche, ma i due metodi più comuni sono saggi di fitness, che misura la capacità dei batteri evoluti per competere contro i loro lontani antenati e sequenziamento del genoma intero, che è utilizzato per identificare i cambiamenti genetici che l'adattamento in auto. A seguito di lavoro pionieristico di Richard Lenski e colleghi7,8, l'approccio standard in evoluzione sperimentale è stato quello di sfidare un numero relativamente piccolo di popolazioni replicare (in genere < 10) con adattamento a un nuovo sfida ambientale, come ad esempio nuove fonti di carbonio, la temperatura o un fago predatorio.
Infezioni causate da batteri resistenti agli antibiotici diventano un grosso problema quando la resistenza è abbastanza alta che non è possibile aumentare le concentrazioni di antibiotiche a livelli letali nei tessuti del paziente. I clinici sono quindi interessati a ciò che permette ai batteri di evolvere la resistenza ad alte dosi di antibiotico che si trovano sopra questa concentrazione di antibiotico di soglia, il punto di interruzione clinica. Come studiare sperimentalmente questo? Se un piccolo numero di popolazioni batteriche è sfidato con un'alta dose di antibiotico, come in uno stile di Lenski esperimento, quindi il risultato più probabile è che l'antibiotico guiderà tutte le popolazioni all'estinzione. Allo stesso tempo, se la dose di antibiotico utilizzato è bassa, sotto la concentrazione inibitoria minima (MIC) del ceppo parentale, allora è improbabile che popolazioni batteriche si evolveranno clinicamente rilevanti livelli di resistenza, soprattutto se resistenza comporta un costo grande. Un compromesso tra questi due scenari consiste nell'utilizzare un "salvataggio evolutivo" esperimento9,10,11. In questo approccio, un numero molto elevato di culture (in genere > 40) è contestato con dosi di antibiotici che aumentano nel tempo, in genere raddoppiando la concentrazione di antibiotica ogni giorno12. Il segno distintivo di questo esperimento è che qualsiasi popolazione che non si evolve la resistenza aumentata sarà guidato all'estinzione. La maggior parte delle popolazioni che si sono sfidate in questo modo saranno guidate estinte, ma una piccola minoranza persisterà evolvendosi elevati livelli di resistenza. In questa carta, indichiamo come questo disegno sperimentale può essere utilizzato per studiare multicopia plasmide contributo all'evoluzione della resistenza.
I batteri acquisire resistenza agli antibiotici attraverso due itinerari principali, le mutazioni cromosomiche e l'acquisizione di elementi genetici mobili, per lo più plasmidi13. Plasmidi gioca un ruolo chiave nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico, perché essi sono in grado di trasferire geni di resistenza tra i batteri da coniugazione14,15. Plasmidi possono essere divisi in due gruppi secondo la loro dimensione e biologia: "più piccoli", con numero di alta copia per cellula batterica e "grandi", con bassa copiare numero16,17. Il ruolo dei plasmidi grande nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico è stata ampiamente documentato perché essi comprendono plasmidi coniugativi, che sono fattori chiave della diffusione di resistenza e resistenza multi tra batteri15. Piccoli plasmidi multicopia anche sono estremamente comuni in batteri17,18, ed essi spesso codice per geni di resistenza agli antibiotici19. Tuttavia, il ruolo dei piccoli plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico è stato studiato in misura minore.
In un recente lavoro, abbiamo proposto che plasmidi multicopia potrebbero accelerare l'evoluzione dei geni che portano aumentando i tassi di mutazione genica dovuta al maggior numero di copia del gene per cellula12. Utilizzando un modello sperimentale con Escherichia coli ceppo MG1655 e il β-lactamase gene blaTEM-1 è stato indicato che plasmidi multicopia accelerato il tasso di comparsa di TEM-1 mutazioni che conferiscono resistenza alla terza generazione ceftazidime cefalosporina. Questi risultati hanno indicato che i plasmidi multicopia potrebbero svolgere un ruolo importante nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico.
Qui, presentiamo una descrizione dettagliata del metodo abbiamo sviluppato per studiare l'evoluzione multicopia plasmide-mediata della resistenza agli antibiotico. Questo metodo ha tre diverse fasi: primo, inserimento del gene in esame in un plasmide multicopia o il cromosoma del batterio ospite. In secondo luogo, utilizzare dell'evoluzione sperimentale (salvataggio evolutiva) per valutare il potenziale dei diversi ceppi di adattarsi alla pressione selettiva. E terzo, determinare la base molecolare sottostante plasmide-mediata evoluzione usando il DNA sequencing e ricostruendo le mutazioni sospetta individualmente nel genotipo parentale.
Infine, anche se il protocollo descritto qui è stato destinato per studiare l'evoluzione della resistenza agli Antibiotico, si può sostenere che questo metodo potrebbe essere generalmente utile per analizzare l'evoluzione delle innovazioni acquisite dalle mutazioni in qualsiasi multicopia gene di plasmide-codificati.

<table><tbody><tr><td>Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Determinare la qualità del DNA misurando i rapporti di assorbanza 260nm/280nm e 260nm/230nm Incubatore</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore (agitatore)</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore per elettroforesi</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td></tr><tr><td>Camera per elettroforesi</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td> <td>multicanaleBiohit</td><td>728220, 728230, 728240</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>Anelli di inoculazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimerasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Enzimi di rescissione</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Kit di estrazione plasmidico</td></tr><tr><td>Wizard Kit di purificazione del DNA genomico</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>kit di estrazione del gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit per tessuti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Kit per l'estrazione del gDNA</td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>piastre Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>Cryotube</td><td>ClearLine</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti (-80&ordm; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Quantificazione della concentrazione di DNA</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td></tr><tr><td>50x tampone TAE</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>Elettroforesi su gel di agarosio</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Plasmidi multicopia sono estremamente abbondanti nei procarioti, ma il loro ruolo nell'evoluzione batterica rimane capita male. Recentemente abbiamo dimostrato che l'aumento nel numero di copia del gene per cellula fornito dai plasmidi multicopia potrebbe accelerare l'evoluzione dei geni del plasmide-codificati. In questo lavoro, vi presentiamo un sistema sperimentale per testare la capacità di plasmidi multicopia di promuovere l'evoluzione. Utilizzando metodi di biologia molecolare semplice, abbiamo costruito un sistema di modello dove un gene di resistenza agli antibiotici può essere inserito in Escherichia coli MG1655, il cromosoma o su un plasmide multicopia. Usiamo un approccio sperimentale evoluzione di propagare i diversi ceppi sotto aumento delle concentrazioni di antibiotici e misuriamo la sopravvivenza delle popolazioni batteriche nel corso del tempo. La scelta della molecola antibiotica e il gene di resistenza è quindi che il gene solo può conferire resistenza attraverso l'acquisizione di mutazioni. Questo approccio "evolutivo salvataggio" fornisce un metodo semplice per verificare il potenziale dei plasmidi multicopia per promuovere l'acquisizione della resistenza agli antibiotico. Nel passaggio successivo del sistema sperimentale, le basi molecolari della resistenza agli antibiotico sono caratterizzate. Per identificare le mutazioni responsabili dell'acquisizione della resistenza agli antibiotico usiamo profonda sequenziamento del DNA dei campioni ottenuti da cloni e intere popolazioni. Infine, per confermare il ruolo delle mutazioni del gene sotto studio, ricostruirli in background parentale e testare il fenotipo di resistenza dei ceppi risultante.

Nel nostro lavoro precedente, è stata studiata l'evoluzione del β-lactamase gene blaTEM-1 verso che conferiscono resistenza alla terza generazione cefalosporina ceftazidime12 . Questo gene è stato scelto perché, anche se TEM-1 non conferisce resistenza a ceftazidime, mutazioni nel blaTEM-1 possono ampliare la gamma di attività di TEM-1 per idrolizzare cefalosporine come ceftazidime29. Le mutazioni in e...

Qui presentiamo un metodo sperimentale per testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotico.

Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è quello di testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione delle innovazioni batteriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede solo metodi di biologia molecolare di base e un semplice disegno sperimentale.È davvero fantastico. In primo luogo, costruire il ceppo di e coli MG1655 che trasporterà il gene di resistenza agli anticorpi nel cromosoma nel fago lambda nell'equazione lato ATTB. Per fare ciò, la PCR amplifica le 500 regioni di base del paralong su entrambi i lati del sito ATTB.Quindi la PCR amplifica il gene della resistenza agli antibiotici. Quindi utilizzare l'assemblaggio isotermico a 50 gradi Celsius per 30 minuti per fondere le regioni di omologia con il prodotto PCR. Dopo l'assemblaggio isotermico, trasferire un microlitro di prodotto in 40 microlitri di celle elettrocompetenti MG1655 in una cuvetta da due millimetri.Quindi elettroporare le celle a 4 gradi Celsius e 2,5 kilovolt. Dopo l'elettroporazione, trasferire le cellule in un millilitro di brodo LB con lo 0,2% di arabinosio. Quindi pipettare il brodo LB contenente le cellule in una provetta per microfuge.Agitare intensamente il tubo per due ore a 30 gradi Celsius. Dopo due ore, preparare 100 microlitri di coltura sulla piastra di agar LB, integrata con antibiotici. Quindi fai girare le celle rimanenti.E risospendere il pellet in 100 microlitri di brodo fresco LB. Ri-impiattare queste cellule su un'altra piastra di agar LB. Quindi incubare le piastre a 42 gradi Celsius per una notte.Il giorno seguente, la PCR amplifica i cloni per verificare il costrutto utilizzando i primer esterni ybhC extern e ybhB extern. Quindi confermare la dimensione dell'amplicone attraverso l'elettroforesi del guscio di agarosio. Parallelamente, condurre il sequenziamento del DNA per verificare la sequenza del gene inserito.Per costruire il ceppo in grado di trasportare il gene di resistenza agli anticorpi nel plasmide multicopia, prima la PCR amplifica il gene di resistenza agli antibiotici blaTEM-1. Al termine della PCR, fosforilare il prodotto amplificato utilizzando la polinucleotide chinasi T4. Successivamente, utilizzare la polimerasi ad alta fedeltà e gli oligonucleotidi PBAD FINV e PBAD RINV, per amplificare con la PCR la spina dorsale del plasmide PBAD.Quindi legare i due frammenti di PCR utilizzando la ligasi T4. Successivamente, elettroporare 40 microlitri di cellule DH5 alfa con 1 microlitro di prodotto di legatura. Quindi selezionare l'antibiotico appropriato per il gene di resistenza agli antibiotici e la spina dorsale del plasmide sulle piastre di agar.Quindi eseguire l'estrazione del plasmide utilizzando un kit di estrazione del DNA, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi eseguire il sequenziamento di Sanger del gene di resistenza di interesse per confermare l'assenza di eventuali mutazioni prima degli esperimenti di evoluzione. Dopo la verifica della sequenza, elettroporare il plasmide nel ceppo di e coli MG1655 per ottenere infine il plasmide che trasporta il ceppo MG1655.Le fasi più critiche di questo protocollo sono la costruzione dei ceppi dei sistemi modello e la ricostruzione delle mutazioni osservate durante l'evoluzione sperimentale. Innanzitutto, striare i ceppi MG1655 di interesse sulle piastre di agar LB. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno LB in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.Successivamente, inoculare 48 colonie isolate di ciascun ceppo in pozzetti individuali della piastra. Dopo l'inoculazione, incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri al minuto. Anche in questo caso, inoculare due microlitri della coltura da ciascun pozzetto con la popolazione fondatrice in una nuova piastra da 96 pozzetti con 198 microlitri di terreno LB in pozzetti individuali.Questo avvierà l'esperimento di salvataggio evolutivo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri al minuto per 20 ore. Ogni giorno, raddoppiare la concentrazione dell'antibiotico rispetto a quella del giorno precedente.Il giorno successivo, trasferire 2 microlitri della rispettiva coltura su una piastra fresca a 96 pozzetti e continuare ogni giorno. Registrare la lettura della densità ottica a 600 nanometri dai singoli pozzetti su un lettore di piastre. Una fase critica del protocollo è l'evoluzione sperimentale e le loro crescenti concentrazioni di antibiotici.Il tasso di variazione delle concentrazioni di antibiotici è uno dei parametri che possono essere modificati per promuovere l'evoluzione della resistenza agli antibiotici. Ancora una volta, incubare la piastra a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri al minuto per 20 ore. Quindi misurare la lettura della densità ottica a 600 nanometri per ogni popolazione sopravvissuta ogni giorno sul lettore di piastre.Congelare le popolazioni periodicamente, ogni tre-cinque giorni. Estrarre il DNA totale dalle popolazioni evolute e dai cloni di diversi ceppi e trattamenti. Successivamente, misurare i rapporti di assorbanza a 260:280 e 260:230 nanometri sullo spettrofotometro per determinare la qualità del DNA.Quindi utilizzare un colorante legante il DNA fluorescente e confermare la concentrazione del DNA misurando la fluorescenza sul lettore di piastre. Inoltre, sottoporre il DNA all'elettroforesi su gel di agarosio per confermare che non vi sia degradazione del DNA o contaminazione dell'RNA. Quindi, eseguire il sequenziamento profondo del DNA con campioni ottenuti da intere popolazioni e singoli cloni per studiare le basi genetiche della resistenza agli antibiotici.Questo studio è un esempio dei possibili risultati del sistema sperimentale che utilizza tre ceppi di e coli. Questi ceppi sono gli e coli MG1655, MG1655 che trasportano il gene di resistenza nel cromosoma MG1655 resA e MG1655 che trasportano il gene di resistenza nel plasmide multicopia, MG1655 pRESA. Gli antibiotici utilizzati sono ceftazidima e meropenem.Questo pannello di sinistra mostra le curve di sopravvivenza in presenza di concentrazioni crescenti di ceftazidima. Dal grafico, è chiaro che il sottogruppo della popolazione del ceppo MG1655 pRESA è in grado di crescere oltre i 14 giorni anche dopo aver raddoppiato la concentrazione di ceftazidima ogni giorno. Al contrario, gli altri ceppi non sopravvivono oltre gli 8 giorni se esposti a concentrazioni simili di ceftazidima.Tuttavia, gli stessi ceppi non mostrano differenze significative nel periodo di sopravvivenza quando esposti a concentrazioni simili di un altro antibiotico, il meropenem. Tutti e tre i ceppi sopravvivono solo tra i 6 e gli 8 giorni se esposti al meropenem. Ciò indica che la presenza del gene resA nel plasmide multicopia potenzia l'evoluzione della resistenza contro ceftazidima ma non contro meropenem.Una volta padroneggiato, il protocollo sperimentale completo può essere eseguito in poche settimane se eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione delle innovazioni nei batteri.

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