Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

L'obiettivo generale di questo metodo sperimentale è quello di testare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli antibiotici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione delle innovazioni batteriche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede solo metodi di biologia molecolare di base e un semplice disegno sperimentale.

È davvero fantastico. In primo luogo, costruire il ceppo di e coli MG1655 che trasporterà il gene di resistenza agli anticorpi nel cromosoma nel fago lambda nell'equazione lato ATTB. Per fare ciò, la PCR amplifica le 500 regioni di base del paralong su entrambi i lati del sito ATTB.

Quindi la PCR amplifica il gene della resistenza agli antibiotici. Quindi utilizzare l'assemblaggio isotermico a 50 gradi Celsius per 30 minuti per fondere le regioni di omologia con il prodotto PCR. Dopo l'assemblaggio isotermico, trasferire un microlitro di prodotto in 40 microlitri di celle elettrocompetenti MG1655 in una cuvetta da due millimetri.

Quindi elettroporare le celle a 4 gradi Celsius e 2,5 kilovolt. Dopo l'elettroporazione, trasferire le cellule in un millilitro di brodo LB con lo 0,2% di arabinosio. Quindi pipettare il brodo LB contenente le cellule in una provetta per microfuge.

Agitare intensamente il tubo per due ore a 30 gradi Celsius. Dopo due ore, preparare 100 microlitri di coltura sulla piastra di agar LB, integrata con antibiotici. Quindi fai girare le celle rimanenti.

E risospendere il pellet in 100 microlitri di brodo fresco LB. Ri-impiattare queste cellule su un'altra piastra di agar LB. Quindi incubare le piastre a 42 gradi Celsius per una notte.

Il giorno seguente, la PCR amplifica i cloni per verificare il costrutto utilizzando i primer esterni ybhC extern e ybhB extern. Quindi confermare la dimensione dell'amplicone attraverso l'elettroforesi del guscio di agarosio. Parallelamente, condurre il sequenziamento del DNA per verificare la sequenza del gene inserito.

Per costruire il ceppo in grado di trasportare il gene di resistenza agli anticorpi nel plasmide multicopia, prima la PCR amplifica il gene di resistenza agli antibiotici blaTEM-1. Al termine della PCR, fosforilare il prodotto amplificato utilizzando la polinucleotide chinasi T4. Successivamente, utilizzare la polimerasi ad alta fedeltà e gli oligonucleotidi PBAD FINV e PBAD RINV, per amplificare con la PCR la spina dorsale del plasmide PBAD.

Quindi legare i due frammenti di PCR utilizzando la ligasi T4. Successivamente, elettroporare 40 microlitri di cellule DH5 alfa con 1 microlitro di prodotto di legatura. Quindi selezionare l'antibiotico appropriato per il gene di resistenza agli antibiotici e la spina dorsale del plasmide sulle piastre di agar.

Quindi eseguire l'estrazione del plasmide utilizzando un kit di estrazione del DNA, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi eseguire il sequenziamento di Sanger del gene di resistenza di interesse per confermare l'assenza di eventuali mutazioni prima degli esperimenti di evoluzione. Dopo la verifica della sequenza, elettroporare il plasmide nel ceppo di e coli MG1655 per ottenere infine il plasmide che trasporta il ceppo MG1655.

Le fasi più critiche di questo protocollo sono la costruzione dei ceppi dei sistemi modello e la ricostruzione delle mutazioni osservate durante l'evoluzione sperimentale. Innanzitutto, striare i ceppi MG1655 di interesse sulle piastre di agar LB. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno LB in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.

Successivamente, inoculare 48 colonie isolate di ciascun ceppo in pozzetti individuali della piastra. Dopo l'inoculazione, incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri al minuto. Anche in questo caso, inoculare due microlitri della coltura da ciascun pozzetto con la popolazione fondatrice in una nuova piastra da 96 pozzetti con 198 microlitri di terreno LB in pozzetti individuali.

Questo avvierà l'esperimento di salvataggio evolutivo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri al minuto per 20 ore. Ogni giorno, raddoppiare la concentrazione dell'antibiotico rispetto a quella del giorno precedente.

Il giorno successivo, trasferire 2 microlitri della rispettiva coltura su una piastra fresca a 96 pozzetti e continuare ogni giorno. Registrare la lettura della densità ottica a 600 nanometri dai singoli pozzetti su un lettore di piastre. Una fase critica del protocollo è l'evoluzione sperimentale e le loro crescenti concentrazioni di antibiotici.

Il tasso di variazione delle concentrazioni di antibiotici è uno dei parametri che possono essere modificati per promuovere l'evoluzione della resistenza agli antibiotici. Ancora una volta, incubare la piastra a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri al minuto per 20 ore. Quindi misurare la lettura della densità ottica a 600 nanometri per ogni popolazione sopravvissuta ogni giorno sul lettore di piastre.

Congelare le popolazioni periodicamente, ogni tre-cinque giorni. Estrarre il DNA totale dalle popolazioni evolute e dai cloni di diversi ceppi e trattamenti. Successivamente, misurare i rapporti di assorbanza a 260:280 e 260:230 nanometri sullo spettrofotometro per determinare la qualità del DNA.

Quindi utilizzare un colorante legante il DNA fluorescente e confermare la concentrazione del DNA misurando la fluorescenza sul lettore di piastre. Inoltre, sottoporre il DNA all'elettroforesi su gel di agarosio per confermare che non vi sia degradazione del DNA o contaminazione dell'RNA. Quindi, eseguire il sequenziamento profondo del DNA con campioni ottenuti da intere popolazioni e singoli cloni per studiare le basi genetiche della resistenza agli antibiotici.

Questo studio è un esempio dei possibili risultati del sistema sperimentale che utilizza tre ceppi di e coli. Questi ceppi sono gli e coli MG1655, MG1655 che trasportano il gene di resistenza nel cromosoma MG1655 resA e MG1655 che trasportano il gene di resistenza nel plasmide multicopia, MG1655 pRESA. Gli antibiotici utilizzati sono ceftazidima e meropenem.

Questo pannello di sinistra mostra le curve di sopravvivenza in presenza di concentrazioni crescenti di ceftazidima. Dal grafico, è chiaro che il sottogruppo della popolazione del ceppo MG1655 pRESA è in grado di crescere oltre i 14 giorni anche dopo aver raddoppiato la concentrazione di ceftazidima ogni giorno. Al contrario, gli altri ceppi non sopravvivono oltre gli 8 giorni se esposti a concentrazioni simili di ceftazidima.

Tuttavia, gli stessi ceppi non mostrano differenze significative nel periodo di sopravvivenza quando esposti a concentrazioni simili di un altro antibiotico, il meropenem. Tutti e tre i ceppi sopravvivono solo tra i 6 e gli 8 giorni se esposti al meropenem. Ciò indica che la presenza del gene resA nel plasmide multicopia potenzia l'evoluzione della resistenza contro ceftazidima ma non contro meropenem.

Una volta padroneggiato, il protocollo sperimentale completo può essere eseguito in poche settimane se eseguito correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione delle innovazioni nei batteri.