Name: Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per levoluzione Regia di proteine in E. coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri come creare librerie mutanti casuali in E. coli e identificare mutazioni vantaggiose tramite selezione funzionale su gradienti di crescita. Questo metodo accelera l'evoluzione di nuove attività enzimatiche per applicazioni industriali e biomediche.

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<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
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<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
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<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo articolo presenta un protocollo di mutagenesi che consente la generazione di grandi librerie casuali mutante senza la necessità di clonazione o PCR. Questo metodo è basato sul soggetto a errori di replica di un plasmide codifica di una sequenza di interesse. In teoria, le mutazioni devono essere in gran parte limitato ai 100-300 pb situato immediatamente a valle del DNA / RNA interruttore, la dimensione del leader filo intermedia prodotta da Pol I 2,10. Abbiamo trovato che, nelle condizioni presentate in questo protocollo, Pol mutazioni ho verificarsi in tutto il plasmide, anche se diminuisce la frequenza come la distanza dagli aumenti plasmide ori (Figura 3). Questa scoperta implica che la transizione o &quot;switch&quot; da Pol I, Pol III ColE1 durante la replicazione del plasmide è molto più graduale di quanto riportato in precedenza, almeno nelle nostre condizioni sperimentali 2, e concorda con studi precedenti suggeriscono una ridondanza funzionale tra Pol I e Pol III 11. Il nostro protocollo originale descritta mutagenesi in colture liquide (4). Questo protocollo produce mutazioni 0,41 / kb per d &lt;1000, cioè entro il 1000 bp adiacente al DNA / RNA interruttore (Tabella 1). Hypersaturation lasciando la coltura liquida nello shaker per 3 giorni senza l&#39;aggiunta di eventuali nuovi mezzi di comunicazione aumenta la frequenza di mutazione mutazioni a 0,70 / kb, ma si traduce in pessime resa plasmide (meno dell&#39;1% rispetto al giorno 1; dati non riportati) ( Tabella 1). Qui vi presentiamo un protocollo semplificato basato sulla placcatura direttamente la trasformazione del target plasmide su agar solido a 37 ° C (Figura 1). Questo procedimento produce la maggior frequenza di mutazione / ciclo di mutagenesi (0,92 mutazioni / kb per d &lt;1000) e facilita notevolmente l&#39;iterazione. Modifica condizioni di coltura di terreni solidi colpisce anche lo spettro di mutazione (Tabella 2). Mutagenesi placcatura diretta riduce la marcata asimmetria tra sostituzioni di coppie di basi complementari visto in coltura liquida (confrontare C → T vs G → A e A → G vs T → C). D&#39;altra parte, la placcatura diretto prodotto più indel (da meno 0,5% al ​​4%) e diminuito il numero di mutazioni G → A per 3 volte, portando ad una sovrarappresentazione di G / C mutazioni (74%). Nel complesso, crediamo che la maggiore semplicità e maggiore efficienza del protocollo placcatura diretta qui presentati supera i benefici dello spettro di mutazione leggermente più equilibrata prodotto da mutagenesi liquido. All&#39;interno dell&#39;obiettivo plasmide, le mutazioni generate dal nostro metodo non si limitano alla sequenza target desiderato. Tuttavia, l&#39;evoluzione del romanzo di attività biochimiche dovrebbe dipendere da mutazioni nel gene bersaglio, in quanto rappresenta una qualitativa piuttosto che un cambiamento quantitativo. Così, unendo le nostre mutagenesi plasmide con proiezione di mutanti su piastre gradiente sfrutta i punti di forza del nostro sistema (librerie di grandi dimensioni e disponibilità di selezione) per l&#39;evoluzione di nuove proprietà biochimiche. Altre applicazioni di mutagenesi casuale come ottimizzare gli attuali attività enzimatiche o randomizing aree specifiche di un gene hanno bisogno di clonazione seguenti mutagenesi casuale. In questo caso, essendo la biblioteca in un plasmide in contrapposizione ad un prodotto di amplificazione di PCR migliora l&#39;efficienza della clonazione, facilitando l&#39;amplificazione e restrizione. In sintesi, si dimostra un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante di un gene bersaglio, dato che si distingue per la sua semplicità e per la diversità delle librerie generate. Mostriamo come questo metodo può essere accoppiato con le selezioni per l&#39;evoluzione funzionale efficiente di nuove attività biochimiche. Inoltre, il nostro in vivo generata librerie possono essere facilmente clonati, permettendo mutagenesi sito-specifica o di ottimizzazione delle attività già esistenti.

<table><tbody><tr><td>carbenicillina</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>0,1 mg/ml finale</td></tr><tr><td>tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>0,05 mg/ml finale</td></tr><tr><td>cloramfenicolo</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>0,03 mg/ml finale</td></tr><tr><td>Agar LB Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>Brodo LB Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Agar morbido</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>Preparato in laboratorio</td></tr><tr><td>Arancio di acridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>Emulsione Antifoam B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>Piastra quadrata 100x100x15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra rotonda 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino microscopico 25x75x1 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette con spaziatura da 2 mm</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Kit per mini-prep Zippy</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione regia di proteine ​​in e. coli</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

La generazione efficiente della diversità genetica rappresenta un prezioso strumento molecolare che può essere utilizzato per etichettare la sintesi del DNA, per creare uniche firme molecolari, o per evolvere le proteine ​​in laboratorio. Qui, vi presentiamo un protocollo che consente la generazione di grandi dimensioni (&gt; 10 11) biblioteche mutante per una sequenza bersaglio determinato. Questo metodo si basa sulla replica di un plasmide codifica ColE1 sequenza desiderata da una bassa fedeltà variante della DNA polimerasi I (LF-Pol I). L&#39;obiettivo plasmide si trasforma in un ceppo di E. mutatore coli e placcato su un supporto solido, producendo tra 0,2 e 1 mutazioni / kb, a seconda della posizione del gene bersaglio. Frequenze di mutazione superiori si ottengono iterando questo processo di mutagenesi. Rispetto a metodi alternativi di mutagenesi, il nostro protocollo si distingue per la sua semplicità, in quanto non la clonazione o PCR sono coinvolti. Così, il nostro metodo è ideale per l&#39;etichettatura mutazionali di plasmidi o altri modelli io Pol o per esplorare ampie sezioni di sequenza spazio per l&#39;evoluzione delle attività non presenti nel target originale. Lo stretto controllo dello spazio che la PCR o randomizzati oligonucleotide a base di offrire metodi possono anche essere ottenuto attraverso la clonazione di successive specifiche sezioni della biblioteca. Qui forniamo protocolli che mostra come creare una libreria casuale mutante e le modalità per stabilire farmaco a base di selezioni in E. coli per identificare mutanti espositrici nuove attività biochimiche.

Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

La generazione efficiente di diversità genetica rappresenta uno strumento molecolare inestimabile che può essere utilizzato per marcare la sintesi del DNA, per creare molecole uniche...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare una libreria di mutanti casuali per una specifica sequenza di DNA bersaglio e identificare rapidamente e caratterizzare i mutanti mediante una selezione funzionale semi-quantitativa. Questo viene ottenuto innanzitutto trasformando un plasmide con un'origine di replicazione contenente la sequenza bersaglio in un ceppo mutatore di coli. Dopo aver effettuato la semina e incubato le cellule per tutta la notte, queste vengono raccolte ed il plasmide bersaglio viene isolato per ottenere la libreria di mutanti; successivamente, la libreria di mutanti viene trasformata in un ceppo di lettura per caratterizzare le mutazioni nella seconda parte del protocollo. Viene costruita una piastra di crescita a gradiente e colture batteriche del ceppo di lettura vengono inoculate in una piastra Petri separata contenente agar morbido.L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'improntare e trasferire queste colture batteriche sul gradiente. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano variazioni nel profilo fenotipico di una sequenza bersaglio specifica attraverso differenze nella crescita su un gradiente di farmaco. Questo video presenta un metodo per l'evoluzione diretta di proteine in e coli.Questo processo imita l'evoluzione naturale nella generazione di librerie casuali di nutrienti, seguita da una selezione che limita tale diversità. In questo modo, migliora la nostra capacità di generare nuove attività biochimiche per scopi industriali o biomedici. Questa procedura comprende due componenti: la generazione di una libreria casuale di mutanti e la selezione funzionale per ottenere mutazioni con acquisizione di funzione. A dimostrare questa procedura sarà Jennifer Allen, una tecnica del mio laboratorio.Prima dell'inizio di questo protocollo, si considerino cellule elettrocompetenti JS200 che esprimono una variante a bassa fedeltà della DNA polimerasi uno o polimerasi a bassa fedeltà, una che era stata precedentemente preparata come descritto nel protocollo scritto; queste cellule contengono un allele termosensibile di pol uno, tale che l'attività della polimerasi a bassa fedeltà predomini a 37 gradi Celsius. Si costruisca un plasmide bersaglio contenente un'origine di replicazione di coli uno con la sequenza bersaglio clonata adiacente all'origine di replicazione. La polimerasi a bassa fedeltà uno inizia la replicazione del plasmide di coli uno, introducendo così mutazioni per avviare la mutagenesi.Combinare 40 microlitri di cellule elettrocompetenti e da 30 a 250 nanogrammi di DNA plasmidico bersaglio in un interstizio di due millimetri. Sottoporre la miscela a un impulso di elettroporazione nell’elettroporatore a 1800 volt. Verificare la costante di tempo (TC) per garantire condizioni uniformi di elettroporazione per ogni campione.Il TC idealmente corrisponde a cinque-sei millisecondi. Lasciare riposare la miscela di DNA cellulare in un millilitro di brodo LB per 40 minuti a 37 gradi Celsius, agitando a 250 giri al minuto. Preparare una piastra di Petri LV da 100 millimetri, preriscaldata a 37 gradi Celsius, contenente gli antibiotici appropriati per la selezione di entrambi i plasmidi; piastrare le cellule rigenerate a un'opportuna diluizione per ottenere una concentrazione quasi uniforme (lawn), definita come un numero distinto ma non quantificabile di colonie, come mostrato in questo esempio.Dopo un'incubazione notturna, raccogliere le colonie batteriche delle piastre di Petri con brodo LB. Isolare il plasmide, il DNA dalle cellule raccolte e il plasmide risultante. Il DNA costituisce la libreria di mutanti casuali.Eseguire un digestione con enzimi di restrizione tagliando la libreria di plasmidi con un enzima di restrizione che linearizza sia il plasmide bersaglio che il plasmide palo. Eseguire un gel analitico ARO sul DNA plasmidico isolato per confermare qualità e quantità. Una volta verificati i plasmidi, digerire un microgrammo della libreria con un enzima di restrizione che linearizza il plasmide palo, ma non taglia il plasmide bersaglio.Al termine della digestione con enzimi di restrizione, purificare la libreria utilizzando un kit di purificazione del DNA. Infine, trasformare la libreria purificata in una ceppo di lettura per caratterizzare le mutazioni. Per iniziare la preparazione del gradiente, segnare 10 corsie equidistanti lungo un bordo della base della piastra di Petri quadrata.Posizionare la piastra in inclinazione in modo che il bordo inferiore marcato sia sollevato di sette millimetri. Versare 25 millilitri di agar LB tiepido, mescolato accuratamente con una concentrazione appropriata dell'agente selettivo, nella piastra inclinata. Questo costituisce lo strato inferiore del gradiente.Assicurarsi che l'agar LB ricopra la piastra in modo che l'estremità rialzata e contrassegnata contenga circa un millimetro di agar LB, mentre la parte abbassata ne contenga circa otto millimetri. Coprire la piastra con il coperchio KU per garantire la ventilazione e lasciare solidificare l'agar per 10-15 minuti. Una volta che lo strato inferiore di agar LB si è indurito, spostare la piastra su una superficie piana.Successivamente, versare 25 millilitri di agar LB tiepido senza l'agente selettivo per ricoprire il primo strato di agar, assicurandosi di coprire completamente lo strato inferiore. Coprire la piastra con il coperchio KU per garantire ventilazione, quindi lasciare solidificare l'agar per 10-15 minuti prima di eseguire il trasferimento mediante stampaggio dei batteri. Per prima cosa, ottenere colture batteriche del ceppo indicatore e diluirle in modo da ottenere densità cellulari identiche, con una densità ottica a 600 nanometri inferiore a 1,0.Successivamente, trasferire due millilitri di agar molle liquido equilibrato a 42 gradi Celsius sul fondo di una piastra di Petri rotonda da 100 millimetri, pipettare 40 microlitri della coltura batterica nell'agar molle e quindi mescolare agitando delicatamente la piastra. Rivestire il bordo lungo del vetrino microscopico con la miscela di agar molle. Quindi allineare il bordo rivestito del vetrino con il segno inferiore sulla piastra graduata.Toccare la lametta alla superficie dell'agar. Un contatto leggero è sufficiente per trasferire una striscia dell'agar morbido sulla superficie del gradiente. La lametta viene quindi messa da parte per essere pulita e riutilizzata.Ripetere questo processo. I campioni rimanenti e i controlli sperimentali devono essere inclusi in ogni piastra con gradiente. Se si eseguono più gradienti, incubare la piastra con il coperchio rivolto verso il basso tutta la notte a 37 gradi Celsius; i tempi e le temperature di incubazione possono variare a seconda dei ceppi batterici utilizzati per il saggio, ma un'incubazione tutta la notte a 37 gradi Celsius è generalmente sufficiente per ottenere una crescita visibile.Infine, acquisire e analizzare la crescita cellulare come descritto nel protocollo scritto. Qui sono mostrate immagini di una ceppa indicatore trasformata con P-G-F-U-V non mutato o con una libreria mutante di PG FPUV, sottoposte a quattro cicli di mutagenesi. Colonie scure o debolmente fluorescenti indicano plasmidi contenenti mutazioni inattivanti per GFP.Questa figura rappresenta la frequenza di mutazioni lungo tutta la sequenza neutra del plasmide bersaglio a intervalli di 100 paia di basi. Si noti che le mutazioni si verificano lungo l'intera sequenza del plasmide, ma con la frequenza più alta nelle regioni più vicine all'origine di replicazione. Qui, la crescita dei mutanti è mostrata in presenza di un gradiente di farmaco.La distanza percorsa verso la sommità del gradiente indica un profilo differenziale di resistenza al farmaco tra i mutanti. In questo esempio, librerie di plasmidi della demetilasi ossidativa umana ABH due sono state analizzate per identificare mutanti con resistenza aumentata al metil metansolfonato, utilizzando gradienti di selezione farmacologica. Due. Tali librerie, rappresentanti due e quattro iterazioni del protocollo di mutagenesi, sono mostrate in confronto con il tipo selvatico parentale e il vettore vuoto.La linea bianca indica la soglia al di sopra della quale sono state isolate colonie mutanti singole. Per ulteriori analisi fenotipiche, i mutanti della beta-lattamasi, R 1 64 H ed E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, precedentemente identificati mediante mutagenesi con bassa fedeltà P one e selezione astri e m, sono mostrati su un gradiente di 0,4 microgrammi per millilitro e di quattro microgrammi per millilitro. La protezione contro la cefotaxime è indicativa di un'attività di beta-lattamasi a spettro esteso.Si noti che l'enzima beta-lattamasi di tipo selvatico non conferisce alcuna protezione rispetto alle cellule che esprimono un vettore vuoto. Pertanto, questi mutanti rappresentano un adattamento o l'evoluzione di una nuova attività biochimica. In questo studio abbiamo presentato una potente combinazione di mutagenesi e selezione funzionale per generare nuove attività biochimiche.Una selezione funzionale può essere ottenuta attraverso la selezione farmacologica o mediante complementazione genetica, sfruttando la nostra capacità di generare una grande diversità genetica. La patogenesi potrebbe dover essere limitata a una sequenza specifica al fine di ottimizzare attività proteiche preesistenti o per una patogenesi mirata a un sito specifico. Questo può essere facilmente realizzato mediante clonazione.Inoltre, la mutagenesi può essere dissociata da una selezione funzionale al fine di ottenere attacchi specifici o impronte mutazionali.

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