Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare una libreria di mutanti casuali per una data sequenza di DNA bersaglio e di identificare e caratterizzare rapidamente i mutanti utilizzando la selezione funzionale semi-quantitativa. Ciò si ottiene trasformando prima un plasmide con un coli, un'origine di replicazione contenente la sequenza bersaglio, nel ceppo mutatore. Dopo la placcatura e l'incubazione delle cellule durante la notte, vengono raccolte e il plasmide bersaglio viene isolato per ottenere la libreria mutante, la libreria mutante viene quindi trasformata in un ceppo di lettura per caratterizzare le mutazioni nella seconda parte del protocollo, viene costruita una piastra di crescita a gradiente e le colture batteriche del ceppo di lettura vengono caricate in una piastra di Petri separata contenente aer morbido.

La fase finale della procedura consiste nel trasferire queste colture batteriche nel gradiente. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano cambiamenti nel profilo fenotipico di una data sequenza bersaglio attraverso differenze di crescita su un gradiente di farmaco. Questo video presenta un metodo per l'evoluzione diretta delle proteine nell'e coli.

Questo processo imita l'evoluzione naturale nella generazione di librerie di nutrienti casuali, seguita da una selezione che limita tale diversità. Così, quindi, migliora la nostra capacità di generare nuove attività biochimiche per scopi industriali o biomedici. Questa procedura ha due componenti, la generazione di una libreria di mutanti casuali e la selezione funzionale per ottenere mutazioni con guadagno di funzione. A dimostrazione di questa procedura sarà Jennifer Allen, un tecnico del mio laboratorio.

Prima dell'inizio di questo protocollo, le celle JS 200 elettrocompetenti esprimono una variante a bassa fedeltà della DNA polimerasi uno o un polo a bassa fedeltà, che era stata precedentemente preparata come descritto nel protocollo scritto, queste cellule contengono un allele sensibile alla temperatura del polo uno, tale che l'attività del polo uno a bassa fedeltà predomina a 37 gradi Celsius, costruire. Un plasmide bersaglio contenente un coli, un'origine di replicazione con la sequenza bersaglio clonata adiacente all'origine di replicazione, polo uno a bassa fedeltà avvia coli, una replicazione plasmidica. Introducendo così mutazioni per avviare la mutagenesi.

Combina 40 microlitri di cellule elettrocompetenti e tra 30 e 250 nanogrammi di DNA plasmatico bersaglio in uno spazio di due millimetri. Elettroporazione vet pulse, la miscela nell'elettro a 1800 volt. Controllare la costante di tempo o TC per garantire condizioni di uniformità per ciascun campione.

Idealmente TC equivale a cinque o sei millisecondi. Lasciare che la miscela di DNA cellulare si riprenda in un millilitro di brodo LB per 40 minuti a 37 gradi Celsius agitando a 250 giri/min. Ottenere una piastra di Petri LV da 100 millimetri di preriscaldamento a 37 gradi Celsius contenente antibiotici appropriati per selezionare per entrambi i plasmidi piastre le cellule recuperate a una diluizione appropriata per ottenere una concentrazione vicina al prato, che è definita come un numero distinto ma non numerabile di colonie come mostrato in questo esempio.

Dopo l'incubazione notturna, raccogliere le colonie batteriche delle piastre di Petri con brodo LB. Isolare il plasmide, il DNA dalle cellule raccolte, il plasmide risultante. Il DNA costituisce la libreria dei mutanti casuali.

Eseguire un digest di restrizione tagliando la libreria plasmidica con un enzima di restrizione che linearizza sia il plasmide bersaglio che il polo. Un plasmide esegue un aro gel analitico sul DNA plasmidico isolato per confermare la qualità e la quantità. Una volta verificati i plasmidi, digerire un microgrammo della libreria con un enzima di restrizione che linearizza il plasmide polo uno, ma non taglia il plasmide bersaglio.

Al termine del digest di restrizione, ripulisci la libreria utilizzando un kit di purificazione del DNA. Infine, trasformare la libreria pulita in un ceppo di lettura per caratterizzare le mutazioni. Per iniziare la preparazione del gradiente, segnare 10 corsie distanziate uniformemente su un bordo del fondo della capsula di Petri quadrata.

Posizionare il piatto su un'inclinazione tale che il bordo inferiore segnato sia sollevato di sette millimetri. Versare 25 millilitri di agar caldo da libbra mescolato bene con una concentrazione appropriata dell'agente selezionatore nel piatto inclinato. Questo è il livello inferiore della sfumatura.

Assicurati che l'agar LB rivesta la capsula di Petri in modo tale che l'estremità rialzata e contrassegnata della piastra contenga circa un millimetro di agar LB e la parte inferiore contenga circa otto millimetri. Coprire la piastra con il coperchio KU per la ventilazione e lasciare riposare l'agri per 10-15 minuti. Dopo che lo strato inferiore di agar LB si è indurito, spostare il piatto su una superficie piana.

Quindi, versare 25 millilitri di agar caldo da libbra senza l'agente selezionatore per sovrapporre la prima superficie agricola, assicurandosi di coprire l'intero strato inferiore. Coprire la piastra con il coperchio KU per la ventilazione, quindi lasciare riposare l'agri per 10-15 minuti per eseguire il trasferimento del timbro dei batteri. Innanzitutto, ottenere colture batteriche del ceppo di lettura e diluirle per avere densità cellulari identiche con una densità ottica a 600 nanometri inferiore a 1,0.

Successivamente, trasferire due millilitri di agar morbido liquido bilanciato a 42 gradi Celsius sul fondo di una piastra di Petri rotonda da 100 millimetri, pipettare 40 microlitri di coltura batterica nel più morbido e quindi mescolare facendo oscillare la piastra. Rivestire il bordo lungo del vetrino del microscopio in vetro con la miscela più morbida. Quindi allineare il bordo rivestito della diapositiva con il segno inferiore sul piatto sfumato.

Tocca il vetrino sulla superficie dell'agar. Un tocco morbido è sufficiente per trasferire un nastro di agar morbido sulla superficie sfumata. Il vetrino viene quindi messo da parte per la pulizia e il riutilizzo.

Ripeti questo processo. I campioni rimanenti, i controlli sperimentali devono essere inclusi su ciascun piatto a gradiente. Se vengono eseguiti più gradienti, incubare il piatto del gradiente dall'alto verso il basso durante la notte a 37 gradi Celsius e le temperature di incubazione possono differire per i diversi ceppi batterici letti, ma durante la notte a 37 gradi Celsius è in genere sufficiente per una crescita visibile.

Infine, visualizza e analizza la crescita cellulare come descritto nel protocollo scritto. Mostrato. Ecco le immagini di un ceppo di lettura trasformato con P-G-F-U-V non mutato o con una libreria di mutanti PG FPUV che sono stati portati avanti. Quattro cicli di mutagenesi, colonie scure o deboli indicano che il plasmide contiene mutazioni inattivanti la GFP.

Questa cifra rappresenta la frequenza delle mutazioni in tutta la sequenza neutra del plasmide bersaglio a intervalli di 100 coppie di basi. Si noti che le mutazioni si verificano in tutta la sequenza plasmidica, ma alla frequenza più alta più vicina all'origine della replicazione. Qui, la crescita dei mutanti è mostrata contro un gradiente di farmaci.

La distanza cresciuta verso la parte superiore del gradiente indica un profilo differenziale di resistenza ai farmaci tra i mutanti. In questo esempio, le librerie plasmidi della demetilasi ossidativa umana ABH 2 sono state sottoposte a screening per mutanti con maggiore resistenza al metilmetano solfonato utilizzando gradienti di selezione del farmaco. Due. Tali librerie che rappresentano due e quattro iterazioni del protocollo di mutagenesi sono mostrate in confronto al tipo jolly parentale e al vettore vuoto.

La linea bianca indica la soglia oltre la quale sono state isolate le singole colonie mutanti. Per ulteriori analisi fenotipiche, i mutanti beta-lattamasi, R 1 64 H ed E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R precedentemente identificati utilizzando la mutagenesi P one a bassa fedeltà e la selezione di astri e m sono mostrati su un 0,4 microgrammi per millilitro e quattro microgrammi per millilitro. La protezione del gradiente di cefotaxima contro la cefotaxima è indicativa dell'attività della beta-lattamasi a spettro esteso.

Si noti che l'enzima beta-lattamasi wild type non conferisce alcuna protezione rispetto alle cellule che esprimono un vettore vuoto. Pertanto, questi mutanti rappresentano l'adattamento o l'evoluzione di una nuova attività biochimica. Qui abbiamo presentato una potente combinazione di mutagenesi e selezione funzionale per questa generazione di nuove attività biochimiche.

Una selezione funzionale può essere ottenuta sia attraverso la selezione di farmaci che attraverso la complementazione genetica, e sfrutta la nostra capacità di generare una grande diversità genetica. La patogenesi può dover essere limitata a una data sequenza al fine di ottimizzare le attività proteiche preesistenti o per la patogenesi sito-diretta. Questi possono essere fatti facilmente mediante clonazione.

Inoltre, la mutagenesi può essere disaccoppiata da una selezione funzionale al fine di ottenere attacchi di firma o impronte mutazionali.