Name: Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri la visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con MALDI-IMS. Questo metodo utilizza il pre-trattamento con acido formico per mappare la distribuzione spaziale delle proteine amiloidi nella ricerca sull'Alzheimer.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (cervello proteina invecchiamento e demenza controllo 26117004; M.I. e T.M.). Questa ricerca era parzialmente supportata dal programma di ricerca strategico per le scienze del cervello dall'Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE.

Qui, presso il Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital, che fornisce servizi medici basati sulla comunità per la popolazione anziana in Giappone sono stati raccolti campioni di tessuto. I campioni di autopsia del cervello utilizzati nello studio sono stati registrati per la banca del cervello per ricerca di invecchiamento (BBAR) con il consenso informato dei parenti del defunto. Il BBAR è approvato dal comitato etico della Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital e Istituto di gerontologia. Per tutti i cervelli registrati presso la banca del cervello, abbiamo ottenuto consensi scritti per il loro uso per la ricerca medica da pazienti o le loro famiglie. I pazienti sono stati collocati in una camera fredda (4 ° C) entro 2 h dopo la morte per ridurre i cambiamenti post mortem del cervello. Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da Doshisha University e la banca del cervello di invecchiamento ricerca, ospedale geriatrico di Tokyo Metropolitan e Istituto di gerontologia.
1. preparazione delle sezioni del tessuto per IMS
<ol><li>Elaborazione dei campioni di tessuto di un cervello umano sottoposto ad autopsia Nota: Assicurarsi che il passaggio di preparazione del campione per IMS preserva lo stato originale del tessuto. Evitare contaminazione e post-mortem. Il passo successivo è cruciale.<ol>
<li>Ottenere campioni umani corticali per IMS da cervelli che sono stati rimossi, elaborati e conservati a-80 ° C entro 8 h post mortem. Prendere il campione di cervello dalla corteccia occipital di pazienti dell'annuncio e comandi di pari età21.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di sezioni di tessuto congelato
	<ol>
<li>Tagliare le sezioni di tessuto su un criostato. Posizionare i vetrini microscopio conduttivo ITO-rivestito all'interno del criostato21.</li>
		<li>Caldo l'esemplare del cervello di analisi da-80 ° C a-22 ° C all'interno del criostato.</li>
		<li>Fissare una nuova lama monouso al criostato per ogni esperimento. Cercare sempre di utilizzare una parte pulita della lama.</li>
		<li>Mettere i cervelli congelati autopsia sul palco insieme a una piccola quantità di composto di OCT (sufficiente a coprire la zona centrale del palco; Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Scegliere le condizioni per il taglio sottile. Per IMS, utilizzare uno spessore di 10 – 12 μm per le sezioni di cervello umano. Per IMS e IHC, tagliare cinque o sei sezioni da ogni campione di tessuto.</li>
		<li>Quando la lama è appena cominciando a tagliare il tessuto, girare la ruota e la "faccia" il blocco fino a tutto il tessuto è esposto. Se c'è una piccola striscia o strappo attraverso la sezione, attendere un po ' più del criostato che ripara automaticamente la regolazione della temperatura. Contare pochi secondi prima di aprire il anti-rotolo di con un tessuto sottostante.</li>
		<li>Posizionare immediatamente la fetta di tessuto sul lato rivestite con ITO del vetrino. Scongelare la fetta di tessuto mettendo un dito sotto la diapositiva sul lato non-ITO-rivestito. Il tessuto si attacchi alla diapositiva; Assicurarsi che il tessuto sia come piatto come possibile con senza rughe. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente. Nota: Indossare guanti, maschere e un abito di laboratorio perché i campioni umani possono contenere contaminanti biologici. Quando tutte le sezioni sono state fatte per il giorno, pulire il criostato, pennelli e mandrini con salviettine di laboratorio e 200 mL di etanolo al 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>Le sezioni di tessuto di risciacquo
	<ol>
<li>Immergere i campioni in 40 – 100 mL di etanolo al 70% per 30 s per rimuovere lipidi endogeni e sali inorganici. Utilizzare un vetro vaso di colorazione.</li>
		<li>Lavare i campioni con 40 – 100 mL di etanolo al 100% per 30 s, 40 – 100 mL di soluzione di Carnoy per 3 min, 40 – 100 mL di etanolo al 100% per 30 s, 40 – 100 mL di 0,1% acido trifluoroacetico (TFA) per 1 min e 40 – 100 mL di etanolo al 100% per 30 s. uso un bicchiere vaschetta di colorazione. Nota: Soluzione di Carnoy è un fissativo composto da sei parti etanolo, tre parti di acido acetico e cloroformio di una parte.</li>
		<li>Secco in un vuoto per 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento delle sezioni del tessuto con un vapore di acido formico per una migliore ionizzazione delle proteine dai tessuti di cervello autopsia Aβ
	<ol>
<li>Preparare il forno e l'incubazione vetrino da utilizzarsi per la vaporizzazione successiva con 5 mL di acido formico al 100%. Per ottenere un soddisfacente trattamento acido, mantenere l'umidità dell'aria nel piatto di vetro di incubazione a livello di saturazione durante questo passaggio e mantenere la temperatura a 60 ° C. Porre i vetrini di tessuto in piatto di vetro di incubazione, evitando l'immersione in acido formico e trattare per 6 min.</li>
		<li>Prendere un'immagine ottica dei campioni utilizzando un film scanner, scanner di gel, o un microscopio digitale, ecc. eseguire questo passaggio a temperatura ambiente. L'allineamento dell'immagine ottica dei campioni è necessario quando la destinazione di campione viene inserita all'interno dello strumento. Di solito, non sarà possibile riconoscere la sezione di tessuto sotto lo strato di matrice. Nota: Il modo più conveniente per prendere un'immagine ottica consiste nell'utilizzare uno scanner di ufficio. È una buona idea per salvare l'immagine nella cartella di archiviazione dei dati immagine.</li>
		<li>Per correlare le immagini ottiche con i campioni, fare segni di guida che sono visibili nell'immagine ottico sia sotto lo strato di matrice nell'ottica della fotocamera. Il modo più semplice è di individuare segni di fluido di correzione almeno tre intorno al campione prima di prendere l'immagine ottica.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicazione di matrice
	<ol>
<li>
Preparazione della soluzione di matrice
		<ol>
<li>In un'organica solvente-tollerante microtube, preparare un 10 mg/mL soluzione SA in 50% acetonitrile (ACN) e 0,1% TFA. Sciogliere completamente la SA composto da Vortex o breve sonicazione per 10 min. Store la soluzione a temperatura ambiente fino all'utilizzo. Nota: Ci sono tre diverse opzioni per la spruzzatura di matrice: utilizzando un aerografo, uno spruzzatore ad ultrasuoni o uno spruzzatore automatico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
La matrice di spruzzatura con un aerografo
		<ol>
<li>Eseguire l'operazione a una temperatura costante (20 – 23 ° C) e umidità (40 – 60%). I parametri per regolare irrorazione ottimale includono la dimensione della goccia, la quantità di nebbia, l'angolo e la distanza tra l'ugello e la sezione di tessuto e il laboratorio temperatura e umidità. Regolare queste condizioni controllando i risultati di microscopia. Nota: Come il cristallo, dimensioni e l'omogeneità della copertura matrix e la migrazione/diffusione indesiderabile degli analiti includono fattori limitanti, piccolo è meglio per la dimensione della goccia. Omogeneità è anche il punto di ispezione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
La matrice di spruzzatura con un nebulizzatore ad ultrasuoni
		<ol>
<li>Rimuovere il tessuto per essere spruzzato dall'essiccatore e posizionarlo nella camera. Assicurarsi che il tessuto non copra la finestra del sensore.</li>
			<li>Inizia la preparazione premendo il tasto Start ; di solito, tempo di preparazione è di circa 90 min. La preparazione sarà regolata automaticamente tramite il monitoraggio delle spessore dello strato di matrice e umidità. Dopo aver completata la preparazione, rimuovere il vetrino e memorizzarlo in un essiccatore per 15 min prima della lettura dello strumento di MALDI.</li>
			<li>Pulire lo spruzzatore con 2 – 3 mL di 100% MeOH fino a quando la testa di spruzzo appare pulito. Nota: Una foschia fine di goccioline di matrice è consentita ad affondare nel tessuto di un foglio gravitazionale. Viene generato un formato della gocciolina medio di 20 μm; tutti i diametri di goccia sono meno di 50 μm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
La matrice di spruzzatura con uno spruzzatore automatico
		<ol>
<li>Spruzzare la soluzione di matrice sulla superficie del tessuto con uno spruzzatore automatico. Un flusso costante di gas guaina riscaldata (N2, fissato a 10 psi e 75 ° C) sarà consegnato congiuntamente con lo spruzzo di soluzione di matrice. Utilizzare un sistema di pompa solvente (fissato a 10 psi e 0,15 mL/min) per offrire la soluzione di matrice. Nota: La cosa più importante, funziona sotto un armadietto per evitare di inalare aerosol matrice di sicurezza. Controllare la temperatura e l'umidità per riprodurre la cristallizzazione omogenea matrice.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. MALDI-IMS
<ol><li>
Eseguire la spettrometria di massa ad altissima velocità.
	<ol>
<li>Eseguire esperimenti di imaging ad alta velocità e ad alta risoluzione spaziale con MALDI-IMS equipaggiato con un ND: YAG di 10 kHz (355 nm) laser.</li>
		<li>Per misure di spettrometria di massa, definire le aree di tessuto utilizzando il software di controllo MALDI e software di analisi dati.</li>
		<li>Acquisire spettri in modalità lineare positiva con un intervallo di massa di m/z 2.000-20.000 e una risoluzione spaziale di 20 e 100 µm.</li>
		<li>Per effettuare la taratura standard, sciogliere lo standard di calibrazione del peptide e la calibrazione di proteina standard con un rapporto di 1:4 con acido alfa-ciano-4-idrossi-cinnamici (CHCA) in soluzione TA30 (TFA ACN:0.1% = 30: 70) e poi diluirlo 10x. Posto 1 μL di calibrazione standard sulla diapositiva in quattro posizioni diverse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando software di istologia molecolare (Vedi Tabella materiali), sovrapposizione di più immagini singole per trovare la correlazione spaziale di segnali diversi, come diversi peptidi Aβ colocalizing in SPs e pareti arteriose.</li>
</ol>3. elaborazione dei dati
<ol><li>Per allineamento spettrale, allineare tutti gli spettri a un elenco selezionato di m/z da una precedente pubblicazione21.</li>
	<li>Importare il set di dati di MALDI-IMS nel software di analisi statistica (Vedi Tabella materiali) con sottrazione della linea di base.</li>
	<li>
Regioni di interesse (ROI) sulla base della conoscenza istologica di traccia.
	<ol>
<li>Eseguire un'analisi univariata per le intensità medie, deviazioni standard, scoprendo di discriminativo m/z-marcatori (analisi ROC), test di ipotesi e scoperta di colocalized valori m/z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Creare una mappa di segmentazione.
	<ol>
<li>Eseguire un'analisi multivariata non supervisionata per la segmentazione territoriale di DataSet di grandi dimensioni e un'analisi delle componenti per l'estrazione delle tendenze di fondo.</li>
		<li>Selezionare ROIs anatomico basato sulle caratteristiche istologiche, come il parenchima e lo spazio subaracnoideo.</li>
		<li>Assegnare strutture come singoli ROIs e correlarli con i dati di MS elaborati al fine di identificare i peptidi associati che ha permesso la segmentazione di immagini della regione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kakuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+%CE%B3-secretase+activity+in+mild+cognitive+impairment+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).</li>
<li>Carlred, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+amyloid-b+pathology+in+transgenic+Alzheimer%E2%80%99s+disease+%28tgArcSwe%29+mice+using+MALDI+imaging+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry.</a> Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui abbiamo dimostrato un protocollo dettagliato e risultati della visualizzazione di Aβ e sue isoforme da diversi cervelli sottoposti ad autopsia con l'annuncio e CAA con MALDI-IMS. Il profilo di deposizione di Aβs drasticamente è stato cambiato da Aβ1-42 a sue variazioni di N - e C-terminale. Aβ1-41 è stato prima identificato e visualizzate in cervelli umani con il protocollo attuale e più ulteriormente è stata convalidata con IHC21. Considerando che la morfologia di Aβ depositato da IMS con un'analisi ad alta risoluzione (20 μm) dovrà essere in buon accordo con IHC, IMS e IHC ugualmente contribuire a distinguere i depositi Aβ dalla loro posizione e il contenuto di proteine, così come dalla loro morfologia. Come l'intero esperimento descritto qui è stato condotto nella corteccia occipitale, studiando la localizzazione di diverse specie di beta-amiloide in tutte le regioni del cervello sarà generalizzato con futuri esperimenti utilizzando il protocollo corrente.
Fasi critiche all'interno del protocollo sono passaggi di preparazione di tessuto per ottenere un efficace ionizzazione di aggregati proteici nei tessuti del cervello umano. Uno strato di matrice è necessaria per assorbire l'energia del laser ed indurre la ionizzazione degli analiti e desorbimento. In questo processo, una sezione intera del tessuto è rivestita in modo omogeneo con piccoli cristalli. Cocrystallization omogenea dell'analita con la matrice è cruciale per l'imaging ad alta sensibilità e priva di artefatti. Ciascuno dei tre spray metodi ha i suoi vantaggi. Verniciatura a spruzzo manuale è uno dei metodi più frequentemente usati. L'aerografo è conveniente; Tuttavia, esso richiede operazione abile. Come precisa e riproducibile tecnica sperimentale è essenziale, utilizzando uno spruzzatore ad ultrasuoni e/o uno spruzzatore automatico come descritto nei protocolli correnti è raccomandato. Per quanto riguarda un spruzzatore ad ultrasuoni, esso non sarà non essere influenzato dall'umidità e la temperatura della stanza in perché esso viene spruzzato in una camera. Nel frattempo, con uno spruzzatore automatico, risoluzione spaziale relativamente conservata con buona riproducibilità è ottenuta. In genere, la risoluzione spaziale ottenuta con l'aumento di tre metodi nell'ordine 1) aerografo, dispositivo 2) automatico e spruzzatore 3) ad ultrasuoni.
La cosa più importante, questo protocollo originalmente è stato generato per rilevare e visualizzare Aβs nei campioni di cervello umano sottoposto ad autopsia. La visualizzazione di Aβs con MALDI-IMS per topi APP23, che viene generata come un modello animale dell'annuncio basato sulla mutazione svedese-tipo di APP umana, è stata segnalata prima di altri utenti con un esistente metodo18,19. Tuttavia, l'ex protocollo applicato a APP23 non era sufficiente a visualizzare Aβ nella sua risoluzione laterale e la sensibilità. Opere precedenti discusso che alte concentrazioni di Aβ all'esterno del contorno di tessuto sono chiaramente artefatti in APP23 imaging con loro protocollo18,19. Ciò significa che il cosiddetto 'blur' tra real SPs e IMS immagini a causa della fase di estrazione di matrice era inevitabile con formazione immagine MALDI-tipo. Tuttavia, nel protocollo attuale, la sfocatura è sparito ed ogni spettro rappresentato ogni singolo SP nel parenchima del cervello.
Come mostrato qui, possiamo rintracciare Aβ1-41 per la prima volta in annuncio e cervelli di CAA con MALDI-IMS, nonché con IHC, con un anticorpo specifico dalla nostra generazione21. Secondo il modello di elaborazione di Aβ, Aβ1-38 deriva da Aβ1-45 via Aβ1-42, mentre Aβ1-41 deriva da Aβ1-45 di γ-secretasi graduale scissione27,28,29,30,31 . Ciò significa che l'attuale protocollo supporta questo modello. Per quanto riguarda le limitazioni di questa tecnica, dobbiamo considerare l'eterogeneità dei campioni dal cervello umano autopsia. La fase più critica, in un certo senso, è quello di valutare qualificato autopsia tessuto cerebrale con prova di etica. Con l'attuale protocollo su quei tessuti di cervello autopsia qualificato, MALDI-IMS individualmente può tenere traccia l'intera distribuzione delle molecole complesse avendo più modifiche, nonché a fattori sconosciuti che regolano la patogenesi dell'annuncio, che devono ancora essere definito. Inoltre, nella comprensione della patogenesi globale di vari neuropatologia in cervelli umani invecchiati, deve essere fattibile adottare MALDI-IMS come un approccio standard, in combinazione con le osservazioni cliniche, genetiche e patologiche nelle malattie neurologiche .
Un altro passo fondamentale di MALDI-IMS è il processo di data mining da set di dati ottenuti, che è sempre molto tempo. Estrazione manuale dei dati di ogni distribuzione di picco richiede agli utenti di fare clic su ogni immagine e cercare di distribuzioni che possono correlare alla morfologia del campione analizzato. Segmentazione automatica spaziale può essere utilizzato come il primo passo di data mining, fornendo una panoramica del set di dati e che consente la rapida identificazione di caratteristiche prominenti. In questo approccio, statisticamente sono determinate somiglianze tra spettri di una determinata regione e spettri simili sono raggruppati in un cluster. Tutti i pixel hanno colori diversi secondo la loro assegnazione di cluster (Figura 5). Nello studio presente annuncio/CAA, l'area di interesse è lo spazio delle deposizioni di Aβ nella placca parenchimatica e le strutture vascolari subaracnoidea e parenchimale. Le due cime distintive che sono stati ulteriormente convalidate con IHC erano i valori m/z da Aβ1-40 e Aβ1-4221. Così, è facile trovare colocalized m/z con Aβ1-40 e Aβ1-42, che era già Aβ troncato con annotazioni a N - e C-terminale, come pure i peptidi sconosciuti, per ulteriori analisi.
Weller e colleghi hanno riferito che Aβ si accumula nelle pareti del vaso, più nei dintorni di arterie che intorno vene21. Inoltre, è stato proposto che il fluido interstiziale (ISF) include Aβs escreto dal parenchima cerebrale per il linfonodo tramite un perivascolare drenaggio via22,23,24,25 ,26. Il protocollo corrente per generare una mappa di segmentazione basata su un set di dati di MALDI-IMS a una risoluzione di µm 20 supporta la possibile esistenza di vie di drenaggio perivascolare del cervello (Figura 5), che contribuiscono significativamente alla CAA in annuncio21 , 32. Inoltre, possiamo scoprire le proteine marker colocalized con placca e subaracnoidea vasculature calcolando la correlazione di ogni valori m/z. Nella comprensione della patogenesi globale di vari neuropatologia in cervelli umani invecchiati, deve essere fattibile adottare MALDI-IMS come un approccio potente in combinazione con dati IHC stabiliti di clinici, genetici e osservazioni patologiche in neurologiche malattie.

Al fine di rendere la diagnosi e per capire la patogenesi di malattie neurodegenerative, precisa identificazione molecolare di depositi patologici è essenziale1. Nel corso della D.C., Aβ è prodotto per rendere SPs nel parenchima cerebrale e depositati nei vasi molto prima malattia inizio2,3,4,5,6. Mentre Aβ1-42 è il peptide predominante in SP di cervelli dell'annuncio, altre varianti Aβ, quali N-terminale o C-terminale troncato o modificato Aβs, vengono identificati anche interessato AD cervelli7,8,9, 10. Un quadro completo delle specie di ampia gamma di Aβ in cervelli umani, soprattutto con l'annuncio e cerebrale angiopatia amiloide (CAA)11, aiuterà gli scienziati capire produzione di Aβ, metabolismo e deposizione.
Come l'approccio classico di neuropatologia, immunohistochemistry (IHC) è stato il metodo più conclusivo per determinare la posizione di Aβs nel cervello tessuti12,13,14,15. In generale, IHC non può distinguere molecole quando parecchi epitopi coesistono simultaneamente. Al contrario, un'analisi basati sulla spettrometria di massa proteomica emergenti è un valido approccio soprattutto per analizzare una varietà di specie Aβ nei tessuti del cervello, che non possono essere differenziati con anticorpi16,17. L'analisi basati sulla spettrometria di massa convenzionale di cervello lisati e campioni immuno-precipitato non riesce a rilevare peptidi Aβ secondari e perde informazioni sulla distribuzione di Aβ nel tessuto cerebrale.
Nelle opere precedenti, visualizzando i depositi Aβ in cervelli di topo ha avuto successo utilizzando un modello animale transgenico di annuncio, ad esempio APP23. Tuttavia, questo processo deve ancora avanzamenti tecnici per confrontare IMS e IHC rispetto ad alta risoluzione e sensibilità18,19,20. Neuropatologia annuncio dovrebbe essere studiato su cervelli umani, e abbiamo utilizzato tecnologia MALDI-IMS su tessuti di cervello umano autopsia per ottenere la proteina completa mappatura21. Per questo scopo, abbiamo sviluppato un protocollo per un tipo avanzato di spettrometria di massa che ha vantaggi nella sua rapidità, sensibilità e riproducibilità.

<table><tbody><tr><td>Criostato</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio rivestito con ossido di indio e stagno (ITO)</td><td>Bruker Daltonics</td><td>#237001</td><td></td></tr><tr><td>Blade (monouso)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td>#117394</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td>FSC 22 Blue</td><td></td></tr><tr><td>Scanner</td><td>EPSON</td><td>GT-980</td><td></td></tr><tr><td>Aerografo</td><td>GSI Creos</td><td>PS274</td><td></td></tr><tr><td>Compressore</td><td>MRHOBBY</td><td>Mr.Linear compressore L5</td><td></td></tr><tr><td>Spruzzatore ad ultrasuoni</td><td>Bruker Daltonics</td><td>ImagePrep</td><td></td></tr><tr><td>Spruzzatore automatico</td><td>HTX</td><td>Technologies TM Spruzzatore</td><td></td></tr><tr><td>confocale a scansione laser</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Strumento MALDI ad altissima velocità</td><td>Bruker Daltonics</td><td>rapifleX MALDI Tissuetyper</td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo MALDI</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexControl 3.8</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi dati</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexImaging 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Software di istologia molecolare</td><td>SCiLS, Brema, Germania</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Software statistico</td><td>SCiLS, Brema, Germania</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Acido sinapinico (SA)</td><td>Nacalai tesque</td><td>30494-91</td><td></td></tr><tr><td>Acido alfa-ciano-4-idrossil-cinnamico (CHCA)</td><td>Wako</td><td>037-19261</td><td></td></tr><tr><td>Standard di calibrazione</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi IgG anti-topo biotinilati</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi IgG anti-coniglio biotinilati</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin e complesso HRP biotinilato.</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Kit Vectastain Elite ABC</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidina (DAB)</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Kit</td><td></td> Vectastain Elite ABC</tr></tbody></table>

visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con matrix-assisted laser desorption/ionization imaging spettrometria di massa

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

La neuropatologia del morbo di Alzheimer (annuncio) è caratterizzata dall'accumulo e aggregazione dei peptidi β amiloide (Aβ) nelle piastre extracellulare del cervello. I peptidi Aβ, composti di 40 aminoacidi, sono generati da proteine del precursore dell'amiloide (APP) di β - e γ-secretasi. Aβ è depositato non solo nel parenchima cerebrale, ma anche in leptomeningeal e pareti cerebrali del vaso, noti come angiopatia amiloide cerebrale (CAA). Mentre una varietà di peptidi Aβ sono stati identificati, la dettagliata di produzione e distribuzione di singoli peptidi Aβ in tessuti patologici dell'annuncio e CAA non sono stati completamente risolti. Qui, sviluppiamo un protocollo matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione-based imaging della spettrometria di massa (MALDI-IMS) sui tessuti di cervello umano autopsia per ottenere la mappatura completa della proteina. Per questo scopo, esemplari umani corticali sono stati ottenuti da Brain Bank presso il Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Cryosections congelati vengono tagliati e trasferito a ossido di indio-stagno (ITO)-rivestito di lastre di vetro. Gli spettri vengono acquisiti utilizzando il sistema MALDI con una risoluzione spaziale fino a 20 µm. Acido sinapico (SA) è uniformemente depositato sulla diapositiva utilizzando uno spruzzatore manuale o automatica. Con l'attuali vantaggi tecnici del MALDI-IMS, un set di dati tipico di varie specie Aβ entro le stesse sezioni di cervelli sottoposti ad autopsia umani possono essere ottenuto senza sonde specifiche. Inoltre, ad alta risoluzione (20 µm) formazione immagine di un cervello dell'annuncio e severa CAA campione mostra chiaramente che Aβ1-36 a Aβ1-41 sono stati depositati nei vasi leptomeningeal, mentre Aβ1-42 e Aβ1-43 sono stati depositati nel parenchima cerebrale come placca senile (SP). È possibile adottare MALDI-IMS come un approccio standard in combinazione con le osservazioni cliniche, genetiche e patologiche nella comprensione della patologia dell'annuncio, CAA, e altre malattie neurologiche basano sulla strategia attuale.

Pazienti dell'annuncio sporadici con CAA (n = 5; età media = 83,2 y) e soggetti con placca senile gratis (O SP) e CAA di età (n = 5; età media = 77,2 y) sono stati analizzati (tabella 1). I fenotipi di CAA del paziente #3 erano più prominenti in questo studio. Distribuzioni di Aβ1-40 e depositi di Aβ1-42 nel tessuto cerebrale da paziente #3 sono stati visualizzati con MALDI-IMS (Figura 1). Non c'erano nessun segnale significativo in cervelli di controllo isoamilasi (pazienti #9 e #10), come illustrato nella Figura 1. Qui, MALDI-IMS visualizzato chiaramente che Aβ1-42 è stato depositato preferenzialmente come SPs nel parenchima cerebrale. Al contrario, Aβs più breve, ad esempio Aβ1-36 a 1-41, sono state depositate preferenzialmente sulle aree vascolari leptomeningea (Figura 1).
Distribuzioni di Aβ40 e Aβ42 sono stati ulteriormente convalidati con IHC utilizzando sezioni congelate adiacenti dei tessuti. L'anticorpo anti-Aβ40 con etichetta CAA (frecce in Figura 2B), che è in netto contrasto con la distribuzione di Aβ42 nel parenchima cerebrale come SPs. Per Aβ1-41, siamo i primi a rilevare questo frammento in cervelli umani e abbiamo generato anticorpi specifici che possono differenziarsi Aβ41 da Aβ40 andAβ4221.
La risoluzione spaziale di MALDI-IMS è generalmente il fattore più importante per essere migliorato. Nella Figura 1 e Figura 2 Visualizza MALDI-IMS con una risoluzione di passo 100 µm e ottenere un profilo complessivo di distribuzione per un'area relativamente vasta21. È difficile definire esattamente presso lo spazio subaracnoideo, compreso struttura vascolare dell'amiloide. Di rappresentare strutture di tessuto fine dei vasi subaracnoidea e la superficie della corteccia, imaging ad alta risoluzione di MALDI (40 µm: Figura 3; 20 µm: Figura 4 e Figura 5) è stato effettuato. Di conseguenza, MALDI-IMS ha dimostrato chiaramente che Aβs più breve, ad esempio Aβ1-36 a 1-41, sono distribuiti nelle pareti delle arterie, che è paragonabile con IHC.
MALDI-IMS ha dimostrato le distribuzioni dettagliate di Aβx-40 e di Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 11pE) in annuncio accompagnato con moderata del cervello di CAA. Ad esempio, mentre Aβx-40 specie ha mostrato un profilo di distribuzione simile a Aβ1-40, Aβx-42 specie ha mostrato un modello di distribuzione diversa con Aβ1-4221. Dal protocollo attuale, immagini di singolo ione dei singoli peptidi Aβ osservati con MALDI-IMS sono assegnate a specie Aβ. Al contrario, ha acquisito immagine dati possono essere studiati utilizzando statistica multivariata senza supervisione al fine di ottenere la segmentazione di immagini delle regioni anatomiche di interesse per l'ulteriore analisi di proteine non definiti. Figura 5 Mostra una mappa di segmentazione ottenuta con un'analisi k-means eliminammo applicata alla stessa sezione da paziente #321. Questo metodo di clustering identificato correttamente piastra-come le strutture nel parenchima (blu nella Figura 5) e le strutture vascolari nello spazio subaracnoideo (verde in Figura 5). È interessante trovare una piccola area circolare nel parenchima, che viene individuato proprio dietro una piccola arteriola nel parenchima, così come nello spazio subaracnoideo (viola in Figura 5). Questo è verificato da immagini di singolo ione di questi singoli peptidi Aβ in Figura 5-5F.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig1.jpg"> Figura 1: sezione del cervello MALDI-IMS di un annuncio/CAA congelato. Vari C-terminale troncato Aβ peptidi in annuncio severo CAA (paziente #3) di accompagnamento sono visualizzati nel pannello di sinistra e controlli (paziente #9 a destra e paziente #10 sulla sinistra in tutte le immagini) nel pannello di destra. Aβ1-36 a Aβ1-41 si depositano preferenzialmente nei vasi sanguigni di leptomeningeal, mentre Aβ1-42 e Aβ1-43 sono depositati nel parenchima cerebrale come placche senili nel caso #3, mentre non c'era nessun segnale nei pazienti di referenza cervelli (casi #9 e #10). Risoluzione = 100 μm. Barra della scala = 5 mm. Questa figura è stata modificata con il permesso di Kakuda et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig2.jpg"> Figura 2: sezioni e sezioni adiacenti della corteccia occipitale da cervelli dell'annuncio del cervello MALDI-IMS di congelato AD/CAA. (A - C) (D ed E) sezioni adiacenti della corteccia occipitale da cervelli dell'annuncio e i sezioni congelate di cervello AD/CAA erano immunitario-macchiato e focalizzate su arteriola e parenchima cerebrale, usando gli anticorpi contro Aβ40 (d: BA27) o Aβ42 (E: anti-Aβ42 policlonali). Entrambe le analisi hanno dimostrato che Aβ40 è preferenzialmente depositati in vasi sanguigni leptomeningea (frecce nel pannello D) e arteriole nello spazio subaracnoideo e parenchima cerebrale formando CAA. Al contrario, Aβ42 principalmente è depositato in SPs. Per IMS, risoluzione = 100 μm. Barra della scala = 5 mm (A, Be C) = 5 mm, 500 (D ed E). Questa figura è stata modificata con il permesso di Kakuda et al.21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig3.jpg"> Figura 3: MALD-IMS di congelato AD/CAA cervello sezioni (paziente #3) con una risoluzione di 40 µm. Varie N-terminale e C-terminale troncato e modificato peptidi Aβ in annuncio che accompagna CAA grave (paziente #3). Aβ1-36 a Aβ1-41 si depositano preferenzialmente nei vasi sanguigni di leptomeningeal, mentre Aβ1-42 e Aβ1-43 sono depositati nel parenchima cerebrale come placche senili. Scala bar = 1 mm (A-B), 2 mm (superiore sinistro). Risoluzione = 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig4.jpg"> Figura 4: MALDI-IMS di congelato AD/CAA cervello sezioni (paziente #3) con una risoluzione di 20 µm. Questo pannello mostra vari N-terminale e C-terminale troncato e modificato peptidi Aβ in annuncio che accompagna CAA grave (paziente #3). Aβ1-36 a Aβ1-41 si depositano preferenzialmente nei vasi sanguigni di leptomeningeal, mentre Aβ1-42 e Aβ1-43 sono depositati nel parenchima cerebrale come placche senili. Scala bar = 200 μm (a, b, c), 1 mm (superiore sinistro). Risoluzione = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig5.jpg"> Figura 5: mappa di segmentazione, ottenuto mediante MALDI-IMS di una sezione di cervello AD congelata, rivela presunta placca senile, le strutture di grande vaso subaracnoidea e piccole arteriole parenchimali. (A) segmentazione mappa ottenuta da un'analisi multivariata immagine di dati MALDI-IMS. (B) Bisettrice k-mezzi basati analisi cluster individuati piastra-come e vaso-come strutture nella corteccia occipitale. I cluster e sottostrutture e le loro relazioni vengono visualizzate come nodi (e.g.,1-0-0). (C), Aβ distinti modelli di localizzazione del peptide simile a placche (blu), subaracnoidea vasi (verde) e le strutture di arteriola (rosso). Si noti che alcuni ammassi rossi sono anche distribuiti nello spazio subaracnoideo. Questo è verificato da immagini di singolo ione di questi singoli peptidi Aβ a una risoluzione di 20 µm: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41 e (F) Aβ 1-42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Caso</td>
			<td>Genere</td>
			<td>All'età</td>
			<td>Braak SP</td>
			<td>CAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>M</td>
			<td>88</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>C</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>M</td>
			<td>70</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>M</td>
			<td>73</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: dati clinici e patologici dell'annuncio con casi di CAA e oggetti invecchiati SP O. Esemplari umani corticali per IMS e IHC sono stati ottenuti dalla banca del cervello al Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Ogni esemplare di cervello è stato preso dalla corteccia occipital di cinque pazienti dell'annuncio e cinque controlli di pari età. L'entità del deposito dell'amiloide come mostrato da un anticorpo monoclonale Aβ è stato definito da stadi di Braak SP (amiloide). In fase O, non ci sono quasi placche senili in tutta l'isocortex. Nella fase C, quasi tutti i settori isocortical sono interessati. Cervelli dell'annuncio sono invariabili in fase C. Questa tabella è stata modificata con il permesso di Kakuda et al.21.

Imaging molecolare con matrix-assisted laser desorbimento/ionizzazione-based imaging spettrometria di massa (MALDI-IMS) consente la mappatura simultanea di più analiti in campioni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e visualizzazione della proteina β amiloide sui tessuti di cervello del morbo di Alzheimer e campioni di angiopatia amiloide cerebrale usando MALDI-IMS.

Visualizzazione dei depositi β amiloide nel cervello umano con Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging spettrometria di massa

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Il contributo principale del nostro documento è che abbiamo esplorato un panorama preciso e fine della patologia beta amiloide del cervello del morbo di Alzheimer con la tecnologia di imaging della spettrometria di massa di imaging MALDI. Abbiamo raggiunto progressi tecnologici generando uno speciale protocollo con pretrattamento dell'acido formico delle diapositive tissutali. A seguito di MALDI-IMS, vengono generate mappe di segmentazione e vengono eseguiti calcoli per scoprire nuove proteine marcatori o peptidi colocalizzati con placca e vascucolatura subaracnoidea.Ottenere campioni corticali umani per l'IMS da cervelli che sono stati rimossi, elaborati e conservati a meno 80 gradi Celsius entro otto ore dopo la mortem. Prendi il campione cerebrale dalla corteccia occipitale dei pazienti affetti da AD e dai controlli abbinati all'età. Per tagliare le sezioni tissutali su un criostato, posizionare in primo luogo l'ossido di stagno di indio conduttivo o i vetri del microscopio rivestiti in ITO all'interno del criostato.Riscaldare l'esemplare cerebrale dell'autopsia da meno 80 gradi Celsius a meno 22 gradi Celsius all'interno del criostato. Attaccare una nuova lama monouso al criostato per ogni esperimento. Cerca sempre di usare una parte pulita della lama.Metti sul palco il cervello dell'autopsia congelato insieme a una piccola quantità di composto ottimale per la temperatura di taglio. Per l'IMS e l'immunoistochimica, tagliare da cinque a sei sezioni da ciascun campione di tessuto. Quando la lama sta appena iniziando a tagliare il tessuto, ruotare la ruota e affrontare il blocco fino a quando tutto il tessuto è esposto.Se c'è una piccola striscia o strappo attraverso la sezione, attendere nel criostato fino a quando la regolazione della temperatura non lo fissa automaticamente. Contare pochi secondi prima di aprire l'antirollio con un tessuto sotto. Posizionare immediatamente la fetta di tessuto sul lato rivestito di ITO dello scivolo di vetro.Scongelare la fetta di tessuto mettendo un dito sotto la diapositiva sul lato non rivestito di ITO. Il tessuto si attacca alla diapositiva. Assicurarsi che il tessuto sia il più piatto possibile senza rughe.Per risciacquare le sezioni tissutali, immergere i campioni in 40-100 millilitri di etanolo al 70% in un barattolo di colorazione del vetro per 30 secondi per rimuovere lipidi endogeni e sali inorganici. Lavare i campioni utilizzando la sequenza di lavaggio elencata nel protocollo di testo. Quindi, asciugare i campioni nel vuoto per 30 minuti.Ora, trattare le sezioni tissutali con un vapore acido formico per una migliore ionizzazione delle proteine beta amiloide dal tessuto cerebrale dell'autopsia. Per fare ciò, preparare il forno a 60 gradi Celsius e un piatto di vetro di incubazione con cinque millilitri di acido formico al 100%. Mantenere l'umidità dell'aria nel piatto di vetro di incubazione a livello di saturazione.Posizionare i vetrini di tessuto nella teglia di vetro di incubazione evitando l'immersione nell'acido formico e trattare per sei minuti. Prendi un'immagine ottica dei campioni usando uno scanner di pellicole, uno scanner di gel o un microscopio digitale. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente.L'allineamento dell'immagine ottica dei campioni è necessario quando la destinazione del campione è posizionata all'interno dello strumento. Di solito, non sarà possibile riconoscere la sezione del tessuto sotto lo strato della matrice. Per correlare le immagini ottiche con i campioni, creare segni guida visibili sia nell'immagine ottica che sotto lo strato della matrice nell'ottica della fotocamera.Il modo più semplice è individuare almeno tre segni di fluido di correzione intorno al campione prima di prendere l'immagine ottica. Per spruzzare la matrice con uno spruzzatore ad ultrasuoni, rimuovere il tessuto da spruzzare dall'essiccatore e posizionarlo nella camera. Assicurarsi che il tessuto non copra la finestra del sensore.Iniziare la preparazione premendo il pulsante Start. Di solito, il tempo di preparazione è di circa 90 minuti. La preparazione sarà regolata automaticamente attraverso il monitoraggio dello spessore e dell'umidità dello strato della matrice.In alternativa, per spruzzare la soluzione a matrice sulla superficie del tessuto con uno spruzzatore automatico, utilizzare un sistema di pompaggio a solvente impostato a 10 psi e 0,15 millilitri al minuto per fornire la soluzione a matrice. Un flusso costante di gas di sheath riscaldato verrà consegnato congiuntamente con lo spray della soluzione a matrice. Esegui esperimenti di imaging ad alta produttività e ad alta risoluzione spaziale con MALDI-IMS.Per la misurazione della spettrometria di massa, definire le aree tissutali utilizzando il software di controllo MALDI e il software di analisi dei dati. Acquisire spettri in modo lineare positivo con un intervallo di rapporto massa-carica da 2.000 a 20.000 e una risoluzione spaziale di 20 e 100 micron. Per rendere standard la calibrazione, sciogliere lo standard di calibrazione peptidica e lo standard di calibrazione proteica in un rapporto uno-quattro con soluzione CHCA e TA30 e quindi diluirlo 10 volte.Posizionare un microlitro dello standard di calibrazione sullo scivolo in quattro posizioni diverse. Utilizzando un software di istologia molecolare, sovrapporre più immagini del segnale per trovare la correlazione spaziale di vari segnali come diversi peptidi beta amiloide colocalizzando in placche senili e pareti arteriosa. L'angiopatia amiloide cerebrale o fenotipi CAA del paziente numero tre sono stati i più importanti in questo studio.MALDI-IMS del tessuto cerebrale di questo paziente ha chiaramente visualizzato che l'amiloide beta 1-42 e l'amiloide beta 1-43 sono stati depositati preferenzialmente come placche senili nel parenchima cerebrale. Al contrario, beta amiloide più corte come l'amiloide beta da 1-36 a 1-41 sono state depositate preferenzialmente sulle aree vascolari leptomeningee. Non ci sono stati segnali significativi nel controllo non patologico.Le distribuzioni di amiloide beta 1-40 e amiloide beta 1-42 sono state ulteriormente convalidate con immunoistochimica utilizzando sezioni congelate adiacenti dei tessuti. L'anticorpo anti-amiloide beta 1-40 etichettato CAA e rivelato amiloide beta 1-40 è preferibilmente depositato nei vasi sanguigni leptomeningeali, che è chiaramente in contrasto con la distribuzione di beta amiloide 1-42 nel parenchima cerebrale come placche senili. Di seguito è mostrata una mappa di segmentazione ottenuta con un'analisi k-means di bisezione applicata alla stessa sezione dal paziente numero tre.Questo metodo di clustering ha identificato con successo strutture simili a placche nel parenchima e nelle strutture vascolari nello spazio subaracnoideo. È interessante trovare una piccola area circolare nel parenchima che viene rilevata proprio intorno a una piccola arteriola nel parenchima e nello spazio subaracnoideo. Questo è verificato da singole immagini ioniche di questi singoli peptidi beta amiloide.C'è un limite per rintracciare un'ampia gamma di beta amiloide contemporaneamente anche se si utilizzano gli anticorpi specifici. Qui, mostriamo la distribuzione della beta amiloide nel cervello umano usando il metodo di spettrometria di massa di imaging MALDI all'avanguardia. Riteniamo che questo contributo contribuisca alla ricerca sul morbo di Alzheimer perché questa relazione offre la caratterizzazione dell'intero insieme di proteine beta amiloide nel cervello autopsied umano.La scoperta più impressionante è che solo una singola alterazione dell'amminoacido al terminale C della proteina beta amiloide fa un drastico cambiamento nella loro distribuzione. Le fasi di preparazione dei tessuti sono fondamentali per ottenere una ionizzazione efficace delle proteine aggregate nel tessuto cerebrale umano. Cocristallizzazione omogenea dell'alita con matrici cruciali per l'alta sensibilità e l'imaging privo di artefatti.

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