Digestione del fegato murino per un'analisi citofluorimetrica delle cellule endoteliali linfatiche

L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare popolazioni di cellule endoteliali linfatiche all'interno del fegato usando gli indicatori descritti. Utilizziamo collagenasi IV e DNasi e una delicata macinazione del tessuto, combinato con citometria a flusso, per identificare una popolazione distinta di cellule endoteliali linfatiche.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi linfatico e epatico, come come le cellule endoteliali linfatiche, o LEC, rispondono a stimoli specifici e come ciò contribuisce alla patogenesi della malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo valutare il fenotipo endoteliale endoteliale linfatico del fegato e funzionare su base per cellula, e può essere utilizzato per applicazioni a flusso inverso dopo lo smistamento cellulare. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia linfatica epatica, può anche essere utilizzato per valutare le cellule endoteliali linfatiche di diversi tessuti, come la pelle e la ghiandola mammaria.

A dimostrare la procedura sarà Jeffrey Finlon, un assistente di ricerca professionale del mio laboratorio. Per preparare una sospensione a una cellula da cellule epatiche isolate, inizia spruzzando il topo con il settanta per cento di etanolo e fissando le zampe a una tavola di dissezione. Utilizzare le forbici di dissezione per tagliare la pelle di circa un centimetro sopra l'ano e utilizzare le forcep denate per sollevare la pelle lontano dal corpo.

Inserire le punte della forbice tra la pelle e il peritoneo e aprire le forbici per separare i tessuti prima di continuare l'incisione cutanea fino al collo. Fissare la pelle alla tavola di dissezione sotto ogni arto posteriore e sopra ogni arto posteriore e tirare il sacco peritoneale verso l'alto per estendere l'incisione verso il collo. Afferrare i lobi del fegato e tagliare appena sotto lo sterno per consentire la dissezione intorno al fegato.

Quindi trasferire l'organo in quattro millilitri del mezzo EHAA di Click. Utilizzare il bisturi per tagliare il fegato in pezzi di diametro di circa un millimetro e digerire i pezzi in cinquecento microlitri di soluzione di digestione appena preparata e cinquecento microlitri di DNasi 1. Dopo quindici minuti a trentasette gradi Celsius, utilizzare una pipetta da cinquecento millilitri per mescolare accuratamente i tessuti e riportare il contenitore nell'incubatrice per altri quindici minuti.

Al termine dell'incubazione, trasferire il campione digerito attraverso un colino da cento micron in un tubo conico da cinquanta millilitri e utilizzare lo stantuffo da una siringa millilitro per premere delicatamente i restanti pezzi di tessuto attraverso la rete. Lavare il filtro con cinque millilitri di tampone di isolamento e premere delicatamente il tessuto rimanente attraverso il colino. Raccogliere le cellule epatiche isolate per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in quattro millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi.

Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule in dieci millilitri di tampone di isolamento e contare le cellule sull'emocitometro per determinare l'intero conteggio del fegato. Sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di iodixanolo al venti per cento e sovrapporre la sospensione cellulare con un millilitro di PBS. Separare le cellule per separazione del gradiente di densità e raccogliere lo strato tra il PBS e lo iodixanolo.

Quindi filtrare le cellule attraverso un filtro di cento micrometri in un nuovo tubo conico da cinquanta millilitri. Lavare le cellule in dieci millilitri di tampone di isolamento fresco e sospendere nuovamente il pellet risultante in cinquecento microlitri di PBS, integrati con siero bovino fetale al due per cento, o FBS. Dopo il conteggio, aliquota circa cinque volte dieci alla sesta cellule non parenchimali in ogni controllo e pozzo sperimentale di una piastra di pozzo novantasei per la centrifugazione e sospendere di nuovo i pellet in novanta microlitri di PBS più FBS per pozzo.

Aggiungere i cocktail di anticorpi primari sperimentali e di controllo appropriati ad ogni pozzo e macchiare tutti i pozzi con un marcatore di vitalità appropriato. Il passo più importante in questa procedura è la corretta titolazione degli anticorpi e l'uso di controlli del tipo di ghiaccio e controlli della fluorescenza-1 per convalidare la colorazione. Dopo trenta minuti a quattro gradi Celsius, la centrifuga lava le cellule con cento microlitri di PBS più FBS per pozzo e trasferisce le cellule da ogni pozzo in singoli tubi di citometria a flusso rotondo a cinque millilitri a un volume finale di quattrocento microlitri di PBS più FBS per tubo.

Quindi, utilizzare un piccolo volume di celle per regolare il laser e le impostazioni di compensazione sul citometro di flusso e leggere tutti gli eventi per ogni tubo. Una volta letti tutti i tubi, importare i dati in un appropriato programma di analisi della citometria a flusso. Cancello su cellule vive in base al colorante marcatore di vitalità in cui l'espressione negativa è considerata viva.

Gate sulle cellule vive in base alle dimensioni e alla granularità delle cellule, nonché alla loro espressione di colorante marcatore di vitalità, seguita dalla gating sulla popolazione di cellule positive CD45 negativo CD31 utilizzando l'appropriato controllo dell'isotipo e i dati di fluorescenza-1 per determinare le popolazioni positive e negative. Quindi gate le cellule positive CD45 negativo CD31 secondo la loro espressione CD16/32 e podoplanina per consentire l'identificazione del CD45 negativo CD31 positivo, CD16/32 negativo podoplanina positiva endoteliale linfatico, e CD45 negativo CD31 positivo, CD16/32 positivo podoplanina fegato negativo endoteliale endoteliale. Le cellule endoteliali enfatiche esprimono vaso linfatico e ialuronan endoteliale, ma non CD146.

Le cellule positive positive CD16/32 positive CD31 isolate dal fegato, come dimostrato, sono anche positive cd146 e podoplanina positive, mentre le cellule negative CD16/32 positive cd31 sono principalmente negative CD146 e podoplanina positive o negative. La positività è stata determinata in base alla colorazione della fluorescenza-1. Le cellule endoteliali linfatiche del fegato sono negative cd146 e pdpn positive.

Né l'endotelio vascolare né i macrofagi epatici murini esprimono podoplanina. La colorazione della podoplanina può anche essere usata per distinguere i conlangiociti dai vasi linfatici basati sulle distinte strutture nucleari dei dotti biliari e dalla colorazione della citocheratina 7. Poiché solo le cellule endoteliali linfatiche co-esprimono il recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare 3 e la proteina omeobox Prospero 1 nel fegato, questi marcatori possono essere ulteriormente utilizzati per confermare la purezza della popolazione di cellule endoteliali linfatiche epatiche smistate.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente e mantenere le cellule sul ghiaccio. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come lo smistamento del flusso delle popolazioni LEC al fine di rispondere a domande aggiuntive, come la profilazione trascrizionale dei LED. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia linfatica specifica del fegato per esplorare come i linfatici hanno un impatto sulle malattie del fegato nei topi e nell'uomo.

Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché le cellule endoteliali linfatiche sono una popolazione poco frequente e graduale in un fegato e il metodo deve essere eseguito rapidamente.