Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare i precursori dei globuli rossi direttamente nel tessuto appena raccolto nei topi. Questo ci permette di studiare le loro proprietà molecolari durante i periodi in cui il sistema eritropoietico in questi topi sta subendo cambiamenti. Ad esempio, durante lo sviluppo embrionale o durante la risposta allo stress ipossico, il primo tessuto ematopoietico viene isolato dal fegato fetale di topo o dalla milza adulta o dal midollo osseo e dissociato in una sospensione di una singola cellula.

Successivamente le cellule vengono marcate con anticorpi contro i marcatori di superficie cellulare CD 71 e TER one 19 e con qualsiasi altro marcatore di interesse, ad esempio, per misurare la sopravvivenza cellulare o lo stato del ciclo cellulare, la sospensione cellulare marcata viene quindi analizzata utilizzando un analizzatore di citometria a flusso e vengono identificati specifici sottogruppi di eritroblasti in fasi distinte di maturazione. Questi sottogruppi specifici possono essere purificati mediante smistamento cellulare. Successivamente, l'analisi cellulare e molecolare può essere effettuata per ciascun sottogruppo di maturazione degli eritroblasti.

La capacità di identificare l'eritroblasto in specifici stadi di maturazione direttamente in tessuti ematopoietici appena isolati ci dà l'opportunità di studiare le cellule nella corteccia fisiologica. Questo metodo ci permette quindi di studiare eritroblasti alti di diversi stadi di maturazione, rispondere in vivo. Quando i topi sono sottoposti a stimoli, accelerano la cassa eritropoietica.

Ad esempio, condizioni ipossiche che imitano l'alta quota o l'iniezione dell'ormone eritropoietina. Utilizziamo la citometria a flusso multiparametrica per identificare un blats all'interno di un ambiente tissutale complesso e studiare contemporaneamente la loro sopravvivenza al segnale e lo stato del ciclo cellulare. Possiamo anche ordinare gli eritroblasti e le sue specifiche fasi di maturazione direttamente da tessuti freschi ed esplorare i loro livelli di espressione genica, lo stato della cromatina o altre funzioni molecolari.

L'eritropoiesi definitiva del topo avviene nella milza e nel midollo osseo del topo adulto. Pertanto, questi tessuti saranno raccolti da un topo soppresso. Dopo l'eutanasia il topo preleva il sangue mediante puntura cardiaca in provette per la raccolta del sangue con EDTA o eparina, questo sangue verrà utilizzato successivamente per la conta dell'ematocrito, la conta dei reticolociti o l'analisi dell'emocromo.

Posizionare la milza e il femore prelevati in tubi separati contenenti colorazione a freddo. Buffer. Se lo si desidera, tenere i fazzoletti raccolti sul ghiaccio. Pesare la milza.

È probabile che i topi sottoposti a una risposta allo stress eritropoietico mostrino un aumento significativo del peso della milza. Successivamente, le cellule della milza e del midollo osseo vengono preparate dai tessuti raccolti mediante procedure precedentemente dimostrate nell'embrione di topo. L'eritropoiesi definitiva avviene nel fegato fetale tra i giorni embrionali 12,5 e 15,5.

Le tope femmine gravide temporizzate sono preparate per ottenere cellule epatiche fetali nei giorni da 12,5 a 14,5 di gravidanza. Le tope femmine gravide vengono soppresse e le corna uterine vengono rimosse in una capsula di Petri contenente ghiaccio. Terreno di coltura a freddo o tampone di colorazione.

È necessario un microscopio da dissezione per sezionare il fegato fetale dal giorno embrionale 12,5 o più giovane per rimuovere gli embrioni dall'utero. Per prima cosa separa ogni perlina dal corno. Quindi asportare delicatamente la parete dell'utero per rilasciare l'embrione che si trova all'interno del suo sacco amniotico.

Staccare delicatamente la membrana amniotica. Il fegato fetale è il più grande tessuto addominale rosso situato sotto un cuore molto più piccolo. Per sezionare il fegato fetale, usa una pinza per immobilizzare l'embrione su entrambi i lati del fegato e spingere delicatamente il fegato fuori dall'addome nel mezzo.

Trasferire delicatamente il fegato in una provetta contenente un tampone di colorazione fresco. Dopo che tutti i fegati fetali sono stati sezionati e trasferiti in una provetta contenente una nuova colorazione. Dissociare meccanicamente i fegati mediante pipettaggio, quindi filtrare le cellule dissociate attraverso una rete di nylon da 40 micron Lavare le cellule due volte mediante centrifugazione, scartando il surnatante e sospendendo il reus nel tampone di colorazione.

Dopo il secondo lavaggio, colorare le cellule con trian blue e contare con un emocitometro. Un fegato fetale a E 13,5 ha circa 10 al settimo. Le cellule riprospendono le cellule da una a due volte da 10 a una sesta cellula per campione da 200 microlitri per l'analisi citofluorimetrica.

Ai fini di questo protocollo video, la colorazione degli anticorpi per la citometria a flusso sarà dimostrata solo sulle cellule epatiche fetali. Per iniziare questa procedura, preparare una premiscela primaria per la colorazione degli anticorpi contenente le seguenti IgG di coniglio purificate per bloccare i recettori FC nelle cellule di topo, CD 71 FETR, 19 PE e un anticorpo diretto rapidamente contro la proteina della superficie cellulare. Miscelare delicatamente la soluzione anticorpale capovolgendo la provetta due o tre volte, aggiungere 200 microlitri di colorazione anticorpale primaria premiscelata al campione di cellule epatiche fetali precedentemente preparato e pipettare delicatamente su e giù per risospendere le cellule.

Quindi, preparare questi sei campioni di cellule di controllo. Un campione non colorato in cui le cellule vengono lasciate in tampone di colorazione per fornire l'autofluorescenza di fondo delle cellule, un singolo colore per ogni anticorpo o colore utilizzato nel protocollo per correggere la sovrapposizione spettrale tra i canali, che in questo esperimento sono TUR uno 19 PE CD 71 fz veloce, biotina e streptavidina A PC e sette A A DA fluorescenza meno un controllo per la biotina veloce, che fornisce il vero sfondo per quel canale in cui le cellule sono colorate con tutti i colori o gli anticorpi nel protocollo ad eccezione della biotina veloce. Incubare il campione e i relativi controlli nella colorazione anticorpale primaria su ghiaccio per 45 minuti a un'ora al buio.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule aggiungendo tre millilitri di tampone di colorazione a ciascuna provetta del campione e centrifugare per tre-cinque minuti a circa 400 volte la gravità a quattro gradi Celsius. Successivamente, applicare lo strep avid in un PC e incubare le provette sul ghiaccio per 30-45 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule come per la prima colorazione anticorpale.

Infine, risospendere le cellule in una soluzione colorante contenente la cellula impermeabile, colorante di DNA sette a a d per escludere le cellule morte. I campioni sono ora pronti per l'analisi con citometria a flusso. L'aspetto più difficile di questa procedura è la corretta analisi gating degli eventi citometrici a flusso che consente un'identificazione affidabile dei sottogruppi di eritroblasti.

Richiede un'attenta impostazione da parte della macchina di tutti i campioni di controllo corretti, un'attenta compensazione della sovrapposizione spettrale e il successivo gating che escluda cellule morte, aggregati ed eventi molto piccoli. All'inizio dell'analisi dei dati. Il campione non colorato e i singoli campioni di controllo del colore vengono utilizzati per impostare la compensazione della sovrapposizione spettrale per ciascuna combinazione di colori.

In questo esempio, mostreremo come la fluorescenza fit e si riversa nel canale PE e come questa sovrapposizione spettrale viene corretta dopo la compensazione. Innanzitutto, utilizzando il controllo non colorato, definiamo una regione di adattamento E positivo e PE negativo. Successivamente, utilizzando il controllo del colore singolo fit E, possiamo visualizzare lo spillover spettrale nel canale PE.

Seguendo la compensazione digitale con il software FlowJo, il segnale E di spillover nel canale PE è ridotto al minimo. Una volta compensate, le cellule morte, gli aggregati e i piccoli eventi possono essere rimossi. Gli aggregati e i doppietti di celle vengono rimossi tracciando l'altezza di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione in avanti e selezionando gli eventi all'interno di una stretta porta diagonale.

Le cellule morte vengono rimosse selezionando le cellule negative per la morte del DNA impermeabile alle cellule dapi A. Il DAPI negative viable cell gate esclude anche eventi molto piccoli come nuclei o detriti, che hanno una dispersione diretta molto bassa. Successivamente, mostreremo la strategia di gating per le cellule epatiche fetali.

Le cellule appena raccolte sono state marcate per CD 71, TUR one 19 e un cocktail di anticorpi marcati con ZI diretti a marcatori di lignaggio non eritroide. In questo esempio, i campioni sono già stati compensati per la sovrapposizione spettrale e quindi controllati per escludere aggregati, cellule morte ed eventi molto piccoli. Usiamo il campione FMO che contiene tutti i colori tranne la colorazione fitzy positiva per tracciare un istogramma fitzy e definire il cancello della cellula negativa per il lignaggio, quindi applichiamo questo cancello al campione di cellule epatiche fetali che è stato colorato con marcatori di lignaggio coniugato ZI.

Le celle negative di derivazione vengono selezionate e tracciate con CD 71 sull'asse Y e TER 19. Sull'asse A, le celle sono ora pronte per essere divise in sottoinsiemi da S zero a S cinque. Il sottogruppo S zero impoverito di Lin contiene in gran parte cellule con potenziale CFUE prima dell'inizio della dipendenza da EPO.

Il sottogruppo S one contiene cellule CFUE EPO dipendenti in gran parte nella fase S del ciclo cellulare. Le cellule del sottogruppo S due hanno perso il potenziale di formazione di colonie e stanno iniziando a esprimere l'emoglobina Le cellule del sottogruppo S3 sono in gran parte basofile I sottogruppi S quattro e S cinque contengono eritroblasti tardivi. Di seguito viene illustrata la strategia di analisi a seguito dell'acquisizione dei dati da cellule della milza processate e marcate con anticorpi diretti a CD 71 e TER one 19, nonché l'istogramma veloce del recettore di morte.

Uno mostra tutti gli eventi acquisiti in cui la porta diagonale rappresenta eventi che probabilmente saranno singole celle, escludendo doppietti o aggregati più grandi. Le cellule in questa porta sono ulteriormente analizzate nell'istogramma due qui. Sono esclusi eventi molto piccoli, probabili nuclei o detriti.

Le cellule gate sono mostrate nell'istogramma tre dove le cellule DAPI positive che sono probabilmente cellule apoptotiche permeabili alla membrana sono escluse da ulteriori analisi. L'istogramma quattro mostra la popolazione risultante di cellule vitali della milza. Il pro eGate contiene CD 71 TER alto uno 19 celle intermedie tur R uno 19 celle alte vengono ulteriormente analizzati nell'istogramma cinque.

Qui, le cellule alte CD 71 sono suddivise in un'area più grande meno matura, eritroblasti A e eritroblasti A B più piccoli e più maturi. L'espressione delle proteine della superficie cellulare può essere misurata simultaneamente per ciascuno di questi sottogruppi sommando gli anticorpi pertinenti contemporaneamente a TER Rone, 19 e CD 71. L'istogramma di colorazione sei mostra l'espressione della superficie cellulare del recettore di morte veloce, in particolare nell'area, sottogruppo A nei topi allo stato basale e nei topi iniettati con una singola dose di E ppo.

I risultati indicano che l'EPO sopprime l'espressione rapida nell'area. Una popolazione in vivo può anche essere misurata l'espressione di proteine intracellulari o lo stato del ciclo cellulare per le cellule di ciascun sottogruppo. In questa analisi rappresentativa del ciclo cellulare, ai topi è stato iniettato intraperitoneale BRDU e il midollo osseo è stato raccolto da 30 a 60 minuti dopo.

Oltre ad essere colorate per CD 71 e TER 19, le cellule sono state colorate per l'incorporazione di BRDU nelle loro cellule replicanti D-N-A-B-R-D-U positive che si trovano nella fase S del ciclo. Le celle di interfaccia sono BRDU negative e possono essere risolte in fasi G uno o G due M. Utilizzando il DNAD, è possibile selezionare sette celle A, A, D, da ciascuno dei sottoinsiemi PRO E, A, A, B e A EC.

Qui sono mostrati in preparazioni di citosina che mostrano una maturazione sequenziale con la diminuzione delle dimensioni cellulari, la condensazione nucleare e l'aumento della colorazione marrone che riflette l'espressione dell'emoglobina. Infine, qui viene mostrata un'analisi rappresentativa del ciclo cellulare del sottogruppo S3 nel fegato fetale E 13.5. Ai topi gravidi è stato iniettato BRDU.

I fegati fetali sono stati prelevati da 30 a 60 minuti dopo la permeazione fissata e colorati con anticorpi contro CD 71, TER one 19 e BRDU. Lo stato del ciclo cellulare delle cellule S3 viene analizzato dove si trovano le cellule in fase S. Il contenuto di BRDU positivo e DNA viene quantificato mediante colorazione per il colorante DNA sette A a d.

L'approccio citometrico che descriviamo consente lo studio simultaneo di funzioni cellulari come l'espressione di marcatori di superficie cellulare e altre proteine, la sopravvivenza cellulare, la segnalazione cellulare utilizzando anticorpi fosso specifici e lo stato del ciclo cellulare. Ci permette quindi di studiare le risposte molecolari degli eritroblasti, un diverso stadio di maturazione a un'ampia gamma di stimoli o l'effetto di mutazioni genetiche. Va notato che i sottogruppi di maturazione citofluorimetrica sono definiti in termini di espressione del marcatore di superficie cellulare e diffusione in avanti.

Abbiamo scoperto che, in generale, le cellule in ciascun sottogruppo corrispondono a uno stadio morfologico simile di eritroblasto in un'ampia varietà di modelli murini. Tuttavia, si consiglia di verificarlo quando si esamina un nuovo modello di topo. Ordinando le cellule di ciascun sottogruppo ed esaminando la loro morfologia, le cellule di ciascun sottogruppo possono anche essere ordinate per l'analisi dell'RNA o del trascrittoma. Gli esperimenti di smistamento utilizzano basse pressioni di selezione e nasi larghi per ridurre al minimo lo stress sulle cellule.

Si consiglia inoltre di verificare la purezza e la vitalità delle cellule dopo ogni esperimento di selezione. Infine, quando si rileva un cambiamento nella frequenza di un dato sottoinsieme, è importante determinare se questo è dovuto a un vero cambiamento nel numero di celle in quel sottoinsieme o se è dovuto a cambiamenti in altri sottoinsiemi. Pertanto, oltre a misurare le frequenze dei sottoinsiemi, è sempre necessario misurare anche il numero assoluto di celle in ciascun sottoinsieme.