Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare singole popolazioni cellulari da diversi compartimenti intestinali tenue che possono essere successivamente utilizzate per l'analisi citofluorimetrica o un mezzo alternativo di caratterizzazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'immunologia della mucosa, come ad esempio il modo in cui il microbiota influisce sullo sviluppo del sistema immunitario intestinale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che sono rapide, riproducibili e non richiedono laboriosi gradienti di percoll.

Per iniziare questa procedura, posizionare il topo con il lato dorsale rivolto verso il basso e spruzzare l'addome con etanolo al 70%, eseguire una laparotomia tagliando in sequenza la pelle e poi la fascia peritoneale lungo la linea mediana ventrale dalla sinfisi pubica al processo xifoideo, esponendo così la cavità peritoneale. Successivamente, separa l'intestino tenue dallo stomaco sezionando lo sfintere pilorico. Rimuovere delicatamente l'intestino tenue dal peritoneo e rimuovere il grasso mesenterico.

Per rimuovere completamente l'intestino tenue, eseguire un secondo taglio in corrispondenza della giunzione ileocecale. Posizionare l'intestino tenue isolato in un terreno RPMI a quattro gradi Celsius contenente il 10% di FBS per massimizzare la vitalità cellulare. Rimuovere delicatamente grandi pezzi di grasso utilizzando una pinza curva e prestare attenzione per evitare di strappare il tessuto intestinale stesso durante il processo.

Per rimuovere il contenuto intestinale, incannulare l'estremità prossimale dell'intestino tenue con un ago da alimentazione calibro 18 fissato a una siringa e sciacquare delicatamente l'intestino con 15-20 millilitri di PBS freddo. Usa le forbici per asportare le chiazze di Peyer che si trovano sul lato antimesenterico dell'intestino tenue e appaiono come una massa bianca multilobata. Quindi, posizionali in un terreno RPMI freddo contenente il cinque percento di FBS.

Quindi, taglia l'intestino tenue in segmenti da tre a quattro pollici, rimuovi il grasso residuo arrotolando ogni segmento dell'intestino tenue su un tovagliolo di carta inumidito con RPMI e usa un bisturi opaco per allontanare il grasso dal tessuto. Prestare molta attenzione alla completa rimozione del grasso mesenterico è fondamentale per garantire la vitalità dei linfociti, poiché anche piccoli pezzi di grasso possono causare la morte delle cellule. Successivamente, capovolgere il tessuto incannulando i segmenti intestinali con una pinza curva e afferrando l'estremità distale del tessuto, quindi utilizzare un paio di pinze diritte per rimuovere delicatamente il segmento di tessuto dall'estremità prossimale, con conseguente inversione del tessuto.

Posizionare i segmenti di tessuto in una tazza contenente 30 millilitri di terreno di estrazione e una barra di agitazione. Chiudere il coperchio sul tappo e mescolare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. L'agitazione deve essere vigorosa, ma non turbolenta.

Dopo 15 minuti, utilizzare un colino d'acciaio per separare i pezzi di tessuto dall'epitelio contenente surnatante che dovrebbe apparire torbido. Agitare manualmente i pezzi di tessuto in mezzo RPMI per lavare via il mezzo di estrazione residuo. Quindi, posizionare il fazzoletto su un tovagliolo di carta asciutto e capovolgerlo più volte per facilitare la rimozione del muco residuo che non è stato liberato dal mezzo di estrazione.

Successivamente, mettere i frammenti di tessuto in una provetta da cinque millilitri con 600 microlitri di terreno di digestione. Tritare il fazzoletto fino a quando i pezzi non si attaccano più alle forbici e la soluzione appare omogenea. Questo passaggio è fondamentale per garantire la completa digestione enzimatica del tessuto.

Tritare il tessuto fino a quando i pezzi non si attaccano più alle forbici e la soluzione appare omogenea è fondamentale per garantire la resa cellulare e garantire la riproducibilità dei risultati. Aggiungere l'intestino tenue tritato in una tazza contenente 25 millilitri di mezzo di digestione e mescolare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. A metà della digestione, convoglialo su e giù con una pipetta sierologica per aiutare a scomporre eventuali pezzi di tessuto di grandi dimensioni.

Successivamente, filtrare il tessuto digestivo attraverso un colino cellulare da 100 micrometri in un tubo da 15 millilitri. Sciacquare il colino con 20 millilitri di RPMI medium contenente il 10% di FBS. Successivamente, centrifugare la soluzione filtrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Decantare accuratamente il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno RPMI contenente il 10% di FBS. Filtrare le cellule risospese attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in una provetta da 15 millilitri. Sciacquare il colino con 20 millilitri di RPMI contenente il 10% di FBS.

Successivamente, centrifugare la soluzione filtrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare accuratamente il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno RPMI, contenente il due percento di FBS. In questa procedura, trasferire i cerotti di Peyer asportati in una tazza con 25 millilitri di terreno di digestione e una barra di agitazione.

Chiudere il coperchio e centrifugare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, filtrare i cerotti di Peyer digeriti attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una provetta da 15 millilitri. Se rimangono dei grumi, premerli attraverso il colino usando l'estremità piatta dello stantuffo da una siringa da un millilitro.

Quindi, sciacquare il colino con 10 millilitri di RPMI medium, contenente il 10% di FBS. Centrifugare la soluzione filtrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, decantare accuratamente il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno RPMI contenente il due percento di FBS.

L'analisi citofluorimetrica di sospensioni di singole cellule di linfociti intestinali tenue, dovrebbe produrre una discreta popolazione di cellule che hanno caratteristiche di dispersione diretta e laterale simili a quelle degli splenociti. I linfociti possono iniziare a morire se il tessuto non viene mantenuto a quattro gradi Celsius durante le fasi iniziali dell'isolamento, con il risultato che la popolazione linfocitaria ha una minore dispersione in avanti ed è più difficile da separare da altre cellule epiteliali e morte. Inoltre, se il grasso mesenterico non viene completamente rimosso dal tessuto dell'intestino tenue, si avrà una perdita praticamente completa di linfociti.

In genere, si ottiene una vitalità dell'80% per i linfociti LP dell'intestino tenue. Una volta padroneggiati, si possono processare quattro topi e avere sospensioni di singole cellule pronte per la colorazione in meno di quattro ore. Durante questa procedura, è importante rimuovere completamente tutto il grasso mesenterico e tritare bene il tessuto per garantire una digestione completa.

Seguendo questa procedura, le sospensioni di singole cellule possono essere utilizzate per scopi diversi dalla citometria a flusso, come esperimenti in vitro, analisi dell'espressione genica o trasferimento adottivo per caratterizzare ulteriormente la funzione di queste cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in immunologia delle mucose per esplorare l'ontogenesi e le implicazioni funzionali del sistema immunitario intestinale nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le sospensioni di singole cellule da diversi compartimenti intestinali tenui, pulendo il grasso mesenterico, estraendo lo strato epiteliale e digerendo il tessuto con la collagenasi.