Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare popolazioni di singole cellule da diversi compartimenti dell'intestino tenue che possono successivamente essere utilizzate per l'analisi mediante citometria a flusso o per un metodo alternativo di caratterizzazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'immunologia della mucosa, ad esempio in che modo la microbiota influisce sullo sviluppo del sistema immunitario intestinale. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità, la riproducibilità e il fatto che non richieda gradienti laboriosi di percoll.

Per iniziare questa procedura, posizionare il topo con il dorso rivolto verso il basso e spruzzare l'addome con etanolo al 70 percento; eseguire quindi una laparotomia tagliando in sequenza la cute e successivamente la fascia peritoneale lungo la linea mediana ventrale, dalla sinfisi pubica al processo xifoideo, esponendo così la cavità peritoneale. Successivamente, separare l'intestino tenue dallo stomaco recidendo lo sfintere pilorico. Rimuovere delicatamente l'intestino tenue dal peritoneo e staccare il grasso mesenterico.

Per rimuovere completamente l'intestino tenue, effettuare un secondo taglio alla giunzione ileocecale. Posizionare l'intestino tenue isolato in mezzo RPMI a quattro gradi Celsius contenente il 10 percento di FBS per massimizzare la vitalità cellulare. Rimuovere delicatamente i grossi pezzi di grasso utilizzando pinze curve e prestare attenzione a non strappare il tessuto intestinale durante l'operazione.

Per rimuovere il contenuto intestinale, canulare l'estremità prossimale dell'intestino tenue con un ago da alimentazione da 18 gauge fissato a una siringa ed eseguire una leggera irrigazione dell'intestino con 15-20 millilitri di PBS freddo. Utilizzare le forbici per escindere le placche di Peyer, localizzate sul lato antimesenterico dell'intestino tenue e che appaiono come una massa bianca multilobulata. Successivamente, posizionarle in un mezzo RPMI freddo contenente il 5% di FBS.

Successivamente, tagliare l'intestino tenue in segmenti lunghi da sette a dieci centimetri, rimuovere il grasso residuo arrotolando ogni segmento intestinale su un tovagliolo di carta inumidito con RPMI e utilizzare un bisturi smussato per staccare delicatamente il grasso dal tessuto. Prestare la massima attenzione alla completa rimozione del grasso mesenterico è fondamentale per garantire la vitalità dei linfociti, poiché anche piccolissimi frammenti di tessuto adiposo possono causare la morte cellulare. Successivamente, rivoltare il tessuto all'interno arrotolandolo su pinze curve inserite all'interno dei segmenti intestinali e afferrando l'estremità distale del tessuto; quindi, utilizzare un paio di pinze dritte per rimuovere delicatamente il segmento di tessuto dall'estremità prossimale, ottenendo così l'inversione del tessuto.

Posizionare i segmenti di tessuto in un bicchiere contenente 30 millilitri di mezzo di estrazione e una barretta magnetica. Chiudere saldamente il coperchio e agitare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. L'agitazione deve essere vigorosa, ma non turbolenta.

Dopo 15 minuti, utilizzare un colino di acciaio per separare i pezzi di tessuto dal soprannatante contenente l'epitelio, che dovrebbe apparire torbido. Agitare manualmente i pezzi di tessuto nel mezzo RPMI per rimuovere il mezzo di estrazione residuo. Successivamente, posizionare il tessuto su un tovagliolo di carta asciutto e capovolgerlo più volte per facilitare l'eliminazione del muco residuo non rilasciato dal mezzo di estrazione.

Successivamente, posizionare i frammenti di tessuto in una provetta da un punto cinque millilitri contenente 600 microlitri di mezzo di digestione. Tritare il tessuto fino a quando i pezzi non aderiscono più alle forbici e la soluzione appare omogenea. Questo passaggio è fondamentale per garantire una completa digestione enzimatica del tessuto.

Trinciare il tessuto fino a quando i pezzi non aderiscono più alle forbici e la soluzione appare omogenea è fondamentale per garantire il rendimento cellulare e la riproducibilità dei risultati. Aggiungere l'intestino tenue tritato in un contenitore con 25 millilitri di mezzo di digestione e mescolare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. A metà della digestione, aspirare e dispensare il campione ripetutamente con una pipetta serologica per favorire la disgregazione di eventuali frammenti di tessuto più grandi.

Successivamente, filtrare il tessuto digerito attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un tubo da 15 millilitri. Risciacquare il filtro con 20 millilitri di mezzo RPMI contenente il 10 percento di FBS. Successivamente, centrifugare la soluzione filtrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Versare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo RPMI contenente il 10 percento di FBS. Filtrare le cellule risospese attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in un tubo da 15 millilitri. Sciacquare il filtro con 20 millilitri di RPMI contenente il 10 percento di FBS.

Successivamente, centrifugare la soluzione filtrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Decantare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo RPMI, contenente il due percento di FBS. In questa procedura, trasferire le placche di Peyer escisse in un becher contenente 25 millilitri di mezzo di digestione e una barretta d'agitazione.

Chiudere il coperchio ed eseguire una centrifugazione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, filtrare le placche di Peyer digerite attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in un tubo da 15 millilitri. Se rimangono grumi, spingerli attraverso il filtro utilizzando l'estremità piatta dello stantuffo di una siringa da un millilitro.

Quindi, risciacquare il filtro con 10 millilitri di mezzo RPMI contenente il 10 percento di FBS. Centrifugare la soluzione filtrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, decantare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo RPMI contenente il 2 percento di FBS.

L'analisi mediante citometria a flusso di sospensioni cellulari singole di linfociti intestinali, dovrebbe produrre una popolazione distinta di cellule con caratteristiche di scattering anteroforward e laterale simili a quelle dei splenociti. I linfociti possono iniziare a morire se il tessuto non viene mantenuto a quattro gradi Celsius durante le fasi iniziali dell'isolamento, con conseguente riduzione dello scattering anteroforward della popolazione linfocitaria e una maggiore difficoltà nella separazione da altre cellule epiteliali e morte. Inoltre, se il tessuto adiposo mesenterico non viene completamente rimosso dal tessuto intestinale, si avrà una perdita praticamente completa dei linfociti.

Tipicamente, si ottiene una vitalità dell'80 percento per i linfociti della lamina propria dell'intestino tenue. Una volta acquisita padronanza, è possibile processare quattro topi ed ottenere sospensioni cellulari singole pronte per la colorazione in meno di quattro ore. Durante questa procedura, è importante rimuovere completamente tutto il grasso mesenterico e tritare bene il tessuto per garantire una digestione completa.

Seguendo questa procedura, le sospensioni di singole cellule possono essere utilizzate per scopi diversi dalla citometria a flusso, come esperimenti in vitro, analisi dell'espressione genica o trasferimento adottivo per caratterizzare ulteriormente la funzione di queste cellule. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nell'immunologia delle mucose per esplorare l'ontogenesi e le implicazioni funzionali del sistema immunitario intestinale nei topi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare sospensioni di singole cellule da diversi compartimenti intestinali, rimuovendo il grasso mesenterico, estraendo il layer epiteliale e digerendo il tessuto con collagenasi.