Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca^{2 +}-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

I nostri saggi possono essere utilizzati per testare i composti per i loro effetti sulla funzione delle cellule spermatica umana. In particolare, questi metodi possono essere utilizzati per schermare rapidamente e facilmente un gran numero di composti per i loro effetti sulla segnalazione del calcio e sulla reazione acrosoma negli spermatozoi umani. Dimostrazioni visive di questo metodo renderanno più facile per gli altri impostare esperimenti simili nei propri laboratori.

Inizia posizionando un tubo da 50 millilitri per millilitro di campione di sperma grezzo in un rack di tubi con un angolo di 45 gradi e aggiungendo quattro millilitri di 37 gradi Celsius Human Tubal Fluid o HTF positive medium a ciascun tubo. Successivamente, pipettare con cura un millilitro di campione di sperma liqueficato sul fondo di ogni tubo e posizionare i tubi a 37 gradi Celsius per un'ora. Alla fine dell'incubazione, utilizzare una punta di pipetta modificata tenuta con un angolo di 45 gradi per trasferire delicatamente la maggior parte della frazione superiore della cellula spermatica mobile contenente il mezzo positivo HTF il più possibile in un nuovo tubo di plastica da 15 millilitri.

Per contare gli spermatozoi raccolti, diluire un'aliquota di 20 microlitri a un fattore di 10, 20, 30, 50 o 90 in tampone S100 in un tubo rotondo inferiore di due millilitri in base alla concentrazione prevista. Vortice gli spermatozoi diluiti per 10 secondi a 700 rotazioni al minuto. Quindi, immergere una cassetta SP1 nel campione e deprimere completamente lo stantuffo bianco per aspirare un'aliquota del campione nella cassetta.

Quindi posizionare la cassetta nel vassoio del citometro dell'immagine ed eseguire il test delle cellule spermatozoi umane macchiate PI in base al fattore di diluizione applicato. Per misurare i cambiamenti nella concentrazione di calcio intracellulare libera, pipettare delicatamente il campione di sperma su e giù una volta e utilizzare una pipetta ripetuta automatica per aliquota 50 microlitri di spermatozoi macchiati di fluoroforo a 24 pozzi di una fila di una piastra di pozzo da 384 micro. Posizionare la micro piastra del pozzo nel lettore di piastre a fluorescenza a 30 gradi Celsius e selezionare il protocollo appropriato per il fluorofore.

Selezionare un pozzo nella fila di spermatozoi e regolare il guadagno su un valore target del 20%Quindi iniziare la misurazione. Dopo 10 cicli di base, sospendere l'esperimento ed espellere il cassetto con la micro piastra del pozzo. Utilizzando una pipetta a 12 canali, aggiungere rapidamente 25 microlitri delle soluzioni preparate di composti e controlli di interesse nei 12 pozzi duplicati nella fila e restituire immediatamente la piastra al lettore per continuare la misurazione il più rapidamente possibile.

Eventuali cambiamenti nella fluorescenza in risposta all'aggiunta dei composti o dei controlli saranno catturati dallo strumento. Per l'analisi della reazione acrosoma, dopo aver incubato le cellule spermatiche condensate con i coloranti, i composti o i controlli fluorescenti appropriati, mescolare i campioni con pipettazione e aggiungere 50 microlitri di ciascun campione di prova a 100 microlitri di soluzione immobilizzante. Mescolare nuovamente i campioni e caricare le camere di un vetrino A2 per campione con circa 30 microlitri di campione per camera.

Quindi posizionare la prima diapositiva caricata sul vassoio del citometro dell'immagine. Selezionare il protocollo FlexiCyte e premere Esegui. Qui si possono osservare risultati rappresentativi di un esperimento che testa l'effetto di quattro composti, un controllo positivo del progesterone e un controllo tampone negativo utilizzando il saggio di segnalazione del calcio a velocità media come dimostrato.

In questo grafico viene mostrata una curva di risposta alla dose del progesterone derivata dalle variazioni percentuali di picco nella concentrazione di calcio libero intracellulare indotta dalla concentrazione diluita serialmente di progesterone. Questi dati illustrano gli effetti di uno o uno dei due controlli positivi sull'induzione di una reazione acrosoma negli spermatozoi umani condensati in un saggio di reazione acrosoma acrosoma a media produttività. Per evitare di perdere i picchi dei segnali indotti, è fondamentale aggiungere rapidamente le sostanze chimiche ai pozzi di replicazione e continuare immediatamente la misurazione in seguito.

Cambiando il tipo di fluorofori e coloranti, i nostri test possono essere facilmente modificati per rispondere a diverse domande scientifiche. Questi saggi sono già stati utilizzati in diversi studi per testare grandi gruppi di composti per i loro effetti sulla funzione spermatica umana.