Name: Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Impara le tecniche di imaging del calcio nello sperma umano per la biologia riproduttiva usando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Questo metodo consente di analizzare le risposte cellulari a singoli stimoli.

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Questo lavoro è finanziato dal Wellcome Trust, il Medical Research Council, della Royal Society, Birmingham Science City e The Research Trust infertilità. Vorremmo riconoscere l&#39;assistenza di esperti di ricerca Cairn nella costruzione e integrando gli impianti di perforazione di imaging.

Spermatozoi da soggetti sani fertile, con un esame dello sperma normale, sono normalmente preparati per l'imaging come segue. <ol><li> Campioni di sperma sono conservati a 37 ° C per non più di 30 min. Le cellule sono isolate dal plasma seminale di nuotare fino in integrato la soluzione di Earle salina bilanciata (sEBSS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 0,7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, NaCl 116,4, 55,6 D-glucosio, piruvato 2,73 Na, 41,8 lattato Na) integrata con lo 0,3% carbone de-lipidated/fatty libero Frazione acido V BSA (qualità della BSA è cruciale per il successo di capacitazione dello sperma). 1 ml di sEBBS è pipettato in ciascuno di una serie di provette da 5 ml e delicatamente underlayered con 0,3 ml di sperma. Dopo l'incubazione per 1 ora (37 ° C, 6% di CO 2) la parte superiore 0,7 ml viene delicatamente rimosso da ogni provetta e in pool. 10 microlitri della sospensione di spermatozoi viene diluito con 90 ml di 1% (v / v) formalina per immobilizzare le cellule, poi gli spermatozoi vengono conteggiati in una camera di Neubauer. Densità delle cellule nella sospensione viene quindi regolata (con sEBSS) a 6 milioni di cellule / ml. </li><li> Il campione viene quindi diviso in aliquote di 200 microlitri in tubi loosely-ricoperti e incubate (37 ° C, 6% di CO 2) a per 5-6 h per consentire capacitazione. </li><li> Coprioggetti (22x50 mm) sono stati precedentemente trattati con poli-D-lisina. 10 ml di poli-D-lisina soluzione (10% w / v) viene applicato come un certo numero di piccole gocce al centro del vetrino. La poli-D-lisina è poi lasciati asciugare all'aria. Questo può essere su un palco riscaldato e deve essere a completo essiccamento. Un copri è attaccato con grasso per vuoto ad un chiuso, appositamente costruito, perfusable, policarbonato immagini da camera (dimensioni 35 mm x 20 mm x 5 mm; capacità ≈ 180 microlitri). Analoga alla camera di Warner RC20 La poli-D-lisina- coprioggetto rivestito costituisce la base della camera quando le cellule sono visualizzati su un microscopio invertito e una da 12 mm di diametro circolare coprioggetto forma la superficie superiore della camera, consente la trasmissione di luce. </li><li> Oregon verde BAPTA1-AM (OGB) o calcio Verde 1-AM sono usati per le cellule etichettatura. OGB si prepara sciogliendo in DMSO. Pluronic acido F127 (un detergente) è incluso nel DMSO per evitare 'aggregazione' del colorante. Questo può essere preparato in laboratorio (100 Pluronic mg in 0,5 ml di DMSO), immediatamente prima dell'uso, o può essere acquistato già pronto. 20 l è aggiunto ad una aliquota di OGB 50 mg (2,5 mg / ml). Il flaconcino può essere quindi conservati congelati e scongelati per un uso successivo. </li><li> Dopo la capacitazione dello sperma (5-6 h in sEBBS, 37 ° C, 6% di CO 2) è stato selezionato un tubo per l'imaging e 1,2 ml di soluzione OGB si aggiunge, dando una concentrazione finale di 10 micron. Il tubo viene quindi incubato per altri 40 minuti, dopo di che la sospensione cellulare viene iniettata dolcemente nella porta della camera di afflusso di immagini con un p1000 (blu) puntale. La camera si trova nel lato coprioggetti incubatore, poli-D-lisina rivestite in giù, per 20 minuti. Cellule tendono a nuotare lungo le superfici della camera e aderire al poli-D-lisina rivestite zona. </li><li> La camera è ora montato sul microscopio, sono collegati agli apparecchi e perfusione perfuso a circa 0,5 ml / min. Una pompa a rulli alimenta salina nella camera e troppo pieno dalla porta di uscita viene rimosso da una pompa di aspirazione con trappola. La preparazione è lasciato al buio per almeno 10 minuti, mentre le cellule sciolte e tintura extracellulare vengono rimossi dalla perfusione della camera. Stabilità della temperatura è di fondamentale importanza perché piccole fluttuazioni non possono incidere solo sul cellulare di Ca 2 + omeostasi, ma può colpire anche K d del colorante. Gli esperimenti sono normalmente effettuate a 25 ° C, ottenuta mantenendo la temperatura della stanza buia a questo livello. Abbiamo scoperto che mantenere la temperatura ambiente al livello richiesto offre una maggiore stabilità di temperatura e attenzione rispetto all'utilizzo di una fase a temperatura controllata o di un riscaldamento termostatato sull'afflusso salina. </li><li> Le cellule sono visualizzati in contrasto di fase (40x o 60x ad immersione in olio) obiettivo e un'area per l'imaging è selezionata. La porzione di poli-D-lisina zona rivestita che è vicino alla porta d'ingresso è preferito, dove il flusso salino è laminare e coerente. E 'inoltre importante utilizzare una zona dove la densità delle cellule è appropriata (densità eccessiva influisce sulla qualità e integrità dei dati attraverso la ripresa del segnale da celle adiacenti) e dove le cellule sono adeguatamente collegati, ma l'attività flagellare è visibile. Un'immagine contrasto di fase è salvato. Il microscopio è poi passa alla modalità a fluorescenza (eccitazione 480 nm, emissione di 540 nm) e di esposizione sia ridotto al minimo il tempo necessario per ottenere una chiara immagine di fluorescenza (di solito 50-200 ms). </li><li> L'esperimento è iniziato da tempo attivando la serie software di acquisizione immagini (IQ). Di solito le immagini sono acquisite a 0,1 Hz e l'illuminazione è limitato ai periodi di acquisizione di immagini solo usando un Software otturatore controllato. Maggiore velocità di acquisizione dell'immagine può essere utilizzato, ma occorre tener conto per problemi di sbiancamento e la generazione di artefatti dovuti a foto-danni alle cellule (vedi discussione). IQ (e la maggior parte altre piattaforme software di acquisizione) consentirà in tempo reale, grafici di fluorescenza durante l'esperimento. </li><li> Dopo un periodo di controllo di 3-5 minuti Durata manipolazione di costituenti salini (come ad esempio [Ca 2 +] o) e l'applicazione di farmaci si ottiene la sostituzione di soluzione salina nell'intestazione perfusione. Tempo di aggiunta di ogni stimolo è notato in modo che l'orario di arrivo nella camera di imaging può essere calcolato, garantendo precisione sufficiente per la valutazione delle risposte lento qui descritti (campionato a 0,1 Hz). Per le risposte più rapide maggiore precisione si può ottenere con l'aggiunta di stimoli direttamente al flusso di soluzione salina attraverso una porta afflusso secondo quanto previsto nel RC20 Warner camera. </li><li> Le immagini sono analizzate in linea con IQ. Regioni di interesse (ROI) sono del giro ogni cella (o parte di cellulari) e anche una zona cella libera è selezionata (per la sottrazione del fondo automatico dal software. La serie di immagini viene poi controllato per rimuovere le cellule che sono morti o sono stati sottoposti reazione acrosomiale ( che appare come un consistente e rapido aumento della fluorescenza seguita dalla perdita di colorante citoplasmatica) durante l'esperimento e quelli che hanno mostrato il movimento sufficiente a causare artefatti quando analizzata come una serie temporale. </li><li> Un tempo-fluorescenza serie intensità è poi ottenuto per ogni ROI e questi dati vengono analizzati in linea in Excel. Inizialmente fluorescenza è normalizzato al valore medio ottenuto durante il periodo di controllo, utilizzando l'equazione R = [(FF riposo) / F resto] x 100%, dove R è il cambiamento della fluorescenza% rispetto al periodo di controllo,, F è l'intensità di fluorescenza in un tempo t ed il resto F è la media di almeno 30 determinazioni di F ottenuti durante il periodo di controllo. </li></ol> Rappresentante Risultati La figura 1 mostra una serie di immagini da un esperimento in cui le cellule sono state stimolate con 3 mM progesterone. La riga superiore e film 1 mostrano le immagini di fluorescenza in scala di grigi e la stessa maghi sono riportati di seguito (e nel film 2) in pseudocolori ('16_colors lookup table 'in Image J), ​​dove' cool 'colori indicano bassa intensità e fluorescenti 'caldi' colori indicano alta intensità di fluorescenza. Le celle possono essere visualizzati in pseudocolore durante l'esperimento, utilizzando tabelle di ricerca in intelligenza, ma con scala di grigi è generalmente più informativo per la valutazione. Se le cellule sono ben etichettati. Le prime due immagini sono state raccolte a 0 s e 100 s dopo l'inizio della registrazione. Fluorescenza deve essere stabile e tende ad essere più forti nella zona posta acrosomiale e del collo sperma. Il progesterone è entrato nella camera di imaging a circa 175 s ed il 3 ° e 4 ° delle immagini (180 s e 220 ​​s) mostra un rapido aumento della [Ca 2 +] i (fluorescenza) originarie della testa e del collo posteriore della cellula. Immagini successive sono a 290, 360, 740, 990 e 1440 s, mostrando il decadimento del periodo iniziale di [Ca 2 +] i transitori e lo sviluppo di una elevazione secondaria sostenuta. La figura 2 mostra un'analisi foglio di calcolo, di conversione raw valori di fluorescenza per ogni ROI a fluorescenza normalizzata (variazione% della fluorescenza rispetto al periodo di controllo) La figura 3 mostra trame fluorescenza tempo normalizzato per 3 celle che mostrano 'tipico' risposte a 3 mM progesterone. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Esempio di dati da una cella stimolati con progesterone. Una serie di immagini di fluorescenza in scala di grigi (riga superiore) e pseudocolori (fila inferiore) sono mostrati. Punti di tempo sono 0, 180, 220, 290, 360 e 990. 3 progesterone microM entrato nella camera di imaging a 175 s. ROI sono mostrati nel primo pannello. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi dei dati singoli fluorescenza cella in Excel. Figure in nero sono serie temporali di dati di fluorescenza, disposti verticalmente. I valori in rosso (sotto) sono dati normalizzati ottenuti usando l'equazione data nel testo. Il grafico mostra normalizzato fluorescenza in tempo trama per 64 celle in questo esperimento che, su stimolo, mostra un aumento transitorio della fluorescenza seguita da una crescita lenta e una serie di piccole oscillazioni. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Fluorescenza in tempo le tracce per 3 celle individuali, espresso come variazione% rispetto al valore di controllo .. 3 mM progesterone è stato aggiunto al momento segnato dalla freccia. Mostra la linea tratteggiata significa fluorescenza di controllo.

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Se eseguite con successo, questa tecnica permette di registrare la distribuzione e la cinetica di spontaneo e indotto Ca 2 + segnali di sperma umano. Le risposte possono essere ottenute da un gran numero di cellule (fino a 200) che è importante in quanto lo sperma umano può mostrare un sacco di variazione nella loro spontanea e stimolata Ca 2 + segnali. L'etichettatura di successo e la sopravvivenza delle cellule durante la registrazione sono altamente dipendenti sulla qualità del campione. Campioni poveri danno etichettatura poveri, le risposte poveri e le cellule possono morire durante la registrazione. Spermatozoi umani sono molto sensibili al foto-danni e quindi utilizzare l'illuminazione minima necessaria (sia l'intensità e tempo di esposizione) al fine di massimizzare la sopravvivenza cellulare e ridurre al minimo gli artefatti dovuti alla morte delle cellule. Una telecamera ad alta sensibilità (permettendo l'uso di illuminazione a bassa intensità) è un grande vantaggio in quanto la telecamera riprenderà fluorescenza debole. Retro-illuminato, EM-CCD sono particolarmente adatti, anche se molto costoso. Illuminazione a LED (invece di utilizzare una lampada allo xeno o mercurio con filtro di eccitazione migliora anche la sopravvivenza delle cellule (Nishigaki et al, 2006). Non usiamo Fura-2, nonostante i vantaggi evidenti del rapporto-metrica delle immagini, perché Fura richiede l'eccitazione con luce UV e perché è necessario prendere due immagini per ogni rapporto. Per i dati ottenuti con singola lunghezza d'onda, coloranti luce visibile, la normalizzazione della fluorescenza compensa ampiamente la differenza di carico colorante tra le cellule, ma non per la distribuzione colorante all'interno di una singola cellula, e questo deve essere tenuto presente. Sebbene coloranti singola lunghezza d'onda può, in linea di principio, essere calibrato, l'accuratezza della tecnica è scarsa e non tentiamo di fare questo. Considerando che i dati ottenuti con rapporto di Fura-2 (o l'emissione rapporto colorante indo), anche senza calibrazione, dare una rappresentazione accettabile fedele di variazioni relative a [Ca 2 +] i, l'intensità di fluorescenza dei coloranti singola lunghezza d'onda è tutt'altro che linearmente relative alla [Ca 2 +] i. Sopra la parte più utile della curva di saturazione del rapporto per le tinture singola lunghezza d'onda si avvicina di solito a logaritmica. Al momento stiamo utilizzando Oregon Verde Bapta-1 (Figura 4), ​​perché è sensibile alle piccole variazioni [Ca 2 +] i di riposo vicino al livello s (50-100 nM). Quando [Ca 2 +] i supera 1 risposte microM saranno sottorappresentati in termini di cambiamento di fluorescenza e il colorante può saturare. Un'opzione per il miglioramento della tecnica senza ricorrere a eccitazione UV è di raddoppiare celle di carico con un colorante come Fluo-3 e Fura rosso. Entrambi possono essere eccitato a 488 nm, ma contemporaneamente le loro risposte sono molto diverse. Registrazione di emissione a 540 e 650 nm fornisce un rapporto che può fornire un metodo migliore per un accurato monitoraggio di [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) e possono essere applicabili allo sperma (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Figura 4"> Figura 4. Relazione tra libera [Ca 2 +] (nm) ed emissione di fluorescenza a lunghezza d'onda massima (circa 525 nm) per Oregon Verde Bapta-1 e Oregon verde Bapta-2. OGB1 dà una maggiore fluorescenza a riposo [Ca 2 +] ma satura a livelli più bassi e quindi ha un range più piccolo utilizzabile. Dati per tali appezzamenti sono stati ottenuti dal Molecular Probes manuale (Haughland, 2002).

<table><tbody><tr><td>Camera a basso livello di luce</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>Software per imaging</td><td>Andor</td><td>IQ</td><td></td></tr><tr><td>Software per imaging</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>Software di pubblico dominio</td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione LED</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (soluzione al 20% in DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

tecniche di imaging ca 2 + segnalazione di sperma umano

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Microscopia a fluorescenza di cellule caricate con fluorescenti, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibile coloranti viene utilizzato per la misurazione degli aspetti spaziali e temporali di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnalazione in cellule vive. Qui si descrive il metodo utilizzato nei nostri laboratori per caricare sospensioni di sperma umano con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnalazione coloranti e misurando il segnale di fluorescenza durante la stimolazione fisiologica. Cellule mobili sono isolati diretto swim-up e incubate in condizioni capacitating per 0-24 ore, a seconda dell&#39;esperimento. La cellula-permeanti AM (acetossi estere metilico) forma estere del Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnalazione colorante viene poi aggiunto ad una aliquota di cellule e un periodo di 1 h è consentito per il caricamento del colorante nel citoplasma. Noi usiamo coloranti lunghezza d&#39;onda visibili per minimizzare foto-danni alle cellule, ma questo significa che la registrazione raziometrico non è possibile. Vantaggi e svantaggi di questo approccio sono discussi. Durante il periodo di celle di carico sono inseriti in una camera di imaging e il permesso di aderire ad una poli-D-lisina coprioggetto rivestito. Alla fine del colorante periodo di carico in eccesso e le cellule vengono rimosse da perdere il collegamento della camera per l&#39;apparato di perfusione. La camera è perfuso continuamente, stimoli e saline modificati vengono poi aggiunti all&#39;intestazione perfusione. Gli esperimenti vengono registrati dal time-lapse acquisizione di immagini a fluorescenza e analizzati in dettaglio in linea, disegnando manualmente le regioni di interesse. I dati sono normalizzati a pre-stimolo livelli tali che, per ogni cella (o parte di una cellula), un grafico che mostra il Ca<sup&gt; 2 +</supRisposta&gt; come il cambiamento% della fluorescenza si ottiene.

Stimolo-evocato [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I segnali dei singoli spermatozoi umani sono valutati. Cellule mobili sono caricati con Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibili colorante fluorescente (AM-estere metodo) e immobilizzato in una camera perfusable. Le cellule sono ripreso dal time-lapse microscopia a fluorescenza e stimolato attraverso il medium di perfusione. Le risposte di singole cellule (o regioni) sono analizzati in linea con Excel.

Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano

La microscopia a fluorescenza di cellule caricate con coloranti fluorescenti sensibili al Ca2+ viene utilizzata per la misurazione degli aspetti spaziali e temporali della segnalazione del Ca2+ in...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere serie di immagini da spermatozoi umani immobilizzati, marcati con un colorante fluorescente per il calcio. Innanzitutto, le cellule mobili vengono isolate dal plasma seminale mediante risalita attiva nel mezzo di incubazione. Dopo la capacITazione, le cellule vengono marcate con un indicatore fluorescente del calcio, quindi trasferite in una camera di imaging fusa, che viene montata su un microscopio a fluorescenza invertito.Le risposte della concentrazione degli ioni calcio vengono acquisite come serie di immagini in time-lapse e analizzate per estrarre le risposte a livello di singola cellula. Ciao, sono Edwin Andres Morales Garcia del laboratorio del Dott. Steven J. Public Cova della School of Biosciences dell'Università di Birmingham, Regno Unito. Sono Katherine Nash, anch'io del Public Overlap.E io sono Jennifer Morris del Public Overlap. Oggi vi mostreremo il procedimento per l'analisi delle risposte intracellulari al calcio nei singoli spermatozoi umani. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la regolazione delle attività spermatiche mediante stimoli derivati dall'ovulo e dal tratto femminile.Cominciamo. Conservare i campioni di sperma a 37 gradi Celsius per non più di 30 minuti a partire dal momento del prelievo, al fine di isolare le cellule motili dal plasma seminale. Aggiungere un millilitro di soluzione salina equilibrata L'S integrata con BSA allo 0,3% (abbreviata come S-E-B-S-S) in una serie di provette in polistirene da cinque millilitri con fondo rotondo. Sovrapporre delicatamente in ciascuna provetta lo sperma (0,3 millilitri) sotto la S-E-B-S-S e chiudere la provetta con un tappo leggermente allentato.Incubare le provette ad un angolo di 45 gradi per un'ora a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Per consentire alle cellule mobili di nuotare verso l'alto nel S-E-B-S-S, prelevare delicatamente con una pipetta gli 0,7 millilitri superiori di soluzione ed aspirare il liquido da tutte le provette in una provetta da centrifuga pulita da 15 millilitri in polistirene. Agitare delicatamente per mescolare e contare le cellule che sono state immobilizzate con formalina in una nuova camera di conta.Portare la concentrazione a 6 milioni di cellule per millilitro in S-E-B-S-S e dividere lo sperma in aliquote da 200 microlitri in provette rotonde da 5 millilitri in polistirene. Chiudere i tappi leggermente. Se si sta studiando la risposta di cellule capacitate, incubare le provette per cinque-sei ore a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica per consentire la capacitazione. Applicare 10 microlitri di polilisina al 10% sotto forma di alcune gocce piccole al centro di un vetrino da 22 per 50 millimetri.Etichettare il primo coprioggetto e lasciarlo asciugare completamente. Utilizzare grasso da vuoto per fissare il coprioggetto con il lato trattato rivolto verso l'alto a una camera per imaging fusa realizzata. A tale scopo.Per ogni esperimento di imaging, selezionare un singolo tubo di cellule capacitate e aggiungere 1,2 microlitri di organ green dipendente dal calcio al 2,5 milligrammi per millilitro, disciolto in DMSO, per una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubare il tubo per 40 minuti a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica.Utilizzando una pipetta da 200 microlitri Pepto con una punta P 200, rimuovere completamente tutta la soluzione dal tubo. Riempire la camera iniettando delicatamente nel porto di ingresso. Inclinare la camera in modo che le bolle fuoriescano attraverso l'uscita.Posizionare l'intera camera nell'incubatore e incubare per ulteriori 20 minuti a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Per consentire agli spermatozoi di aderire alla poli-D-lisina. Montare la camera sul microscopio a fluorescenza invertito e collegarla all'apparato di perfusione.Lasciare il preparato al buio per almeno 10 minuti per consentire la rimozione della perfusione. Osservare al microscopio a contrasto di fase a 40 x o 60 x di ingrandimento e scegliere un campo in cui la distanza tra le cellule sia sufficiente per valutare separatamente la fluorescenza di ciascuna cellula. Le cellule devono essere adeguatamente aderenti, ma preferibilmente devono mostrare un chiaro movimento di fledge.Passare al canale di fluorescenza verde. Mantenere i tempi di esposizione al minimo necessario per ottenere un'immagine fluorescente nitida. Per ridurre il fotobiancamento nel software IQ.Attivare l'acquisizione di immagini in serie temporale. Acquisire le immagini a 0,1 hertz e utilizzare un otturatore controllato via software per limitare l'illuminazione. Dopo un periodo iniziale di registrazione di controllo della durata di tre-cinque minuti, modificare la concentrazione di calcio nella soluzione salina ed applicare farmaci cambiando la soluzione salina all'ingresso del sistema di perfusione.Prendere nota del momento in cui ogni stimolo viene aggiunto all'intestazione e calcolare il suo tempo di arrivo nella camera come descritto nella parte scritta di questo protocollo. Per analizzare le immagini offline, utilizzare uno degli strumenti di disegno per delineare una regione di interesse o ROI attorno a ciascuna cellula o parte di una cellula, in questo caso la testa posteriore dello spermatozoo poiché il calcio immagazzinato viene mobilitato in questa zona. Scorrere con la barra di scorrimento per controllare la serie di immagini.Identifichi e rimuova le cellule che non rimangono completamente all'interno della ROI, che si sovrappongono ad altre cellule o che hanno mostrato un forte e rapido aumento seguito da un netto calo dell'intensità di fluorescenza, caratteristico della morte cellulare. Utilizzi la funzione di analisi per generare una serie temporale dell'intensità di fluorescenza per ciascuna ROI. I dati possono quindi essere esportati e analizzati in un foglio elettronico.Queste immagini provengono da una serie ottenuta durante la stimolazione con progesterone a tre micromolari. La riga inferiore è stata colorata in falso colore. Per illustrare meglio le variazioni relative di intensità, qui è stato introdotto il progesterone nella camera. Qui.Questi risultati sono mostrati in un video time-lapse. Osservare il rapido picco di intensità della fluorescenza seguito da un aumento lento, che indica le corrispondenti variazioni nei livelli di calcio intracellulare. Questi dati sono quantificati qui a partire dalle intensità medie della regione posteriore della testa di tre cellule.Sono stati aggiunti tre micromoli di progesterone al momento indicato dalla freccia. La linea tratteggiata mostra la fluorescenza media del controllo. Oggi vi abbiamo mostrato come isolare cellule di buona qualità, carificarle con un colorante sensibile al calcio e monitorare la risposta di singole cellule alla stimolazione.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la popolazione cellulare migliore possibile, ridurre al minimo l'illuminazione delle cellule per evitare danni fotoindotti e scegliere il colorante più adatto alle risposte che si stanno analizzando. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

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