Tecniche di Imaging Ca ^{2 +} Segnalazione di sperma umano

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere serie di immagini da spermatozoi umani immobilizzati marcati con un dado reporter di calcio fluorescente. Le cellule Motil vengono isolate dal plasma seminale nuotando nel terreno di incubazione. Dopo la capacitazione, le celle vengono marcate con un indicatore di calcio fluorescente, quindi trasferite in una camera di imaging fusibile, montata su un microscopio a fluorescenza invertita.

Le risposte alla concentrazione di ioni calcio vengono catturate come una serie di immagini time-lapse e analizzate per estrarre le risposte di singole cellule. Ciao, sono Edwin Andres Morales Garcia del laboratorio del Dr.Steven J.Public Cova presso la School of Biosciences dell'Università di Birmingham nel Regno Unito. Sono Katherine Nash, anche lei del Public Overlap.

E io sono Jennifer Morris dei Public Overlap. Oggi mostreremo la tua procedura per l'imaging delle risposte intracellulari del calcio nel singolo terreno perato umano. Utilizziamo questa procedura all'interno del nostro laboratorio per studiare la regolazione delle attività spermatiche utilizzando stimoli derivati dall'ovulo e dalla trappola femminile.

Quindi iniziamo. Conservare i campioni di sperma a 37 gradi Celsius per non più di 30 minuti dal momento della raccolta per isolare le cellule motorie dal plasma seminale PET, un millilitro di soluzioni saline dell'equilibrio di L'S integrate con lo 0,3% di BSA, abbreviato in S-E-B-S-S in una serie di tubi a fondo tondo di polistirene da cinque millilitri. Appoggiare delicatamente l'S-E-B-S-S in ciascuna provetta con 0,3 millilitri di sperma e tappare la provetta senza stringere.

Incubare le provette con un angolo di 45 gradi per un'ora a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Per consentire alle cellule mobili di nuotare verso l'alto nella S-E-B-S-S, ci espulse delicatamente dai primi 0,7 millilitri di soluzione e tirate fuori la soluzione da tutte le provette in una provetta da centrifuga pulita in polistirene da 15 millilitri. Agitare delicatamente per mescolare le cellule di conta che sono state immobilizzate con la formalina in una nuova camera di conteggio intestinale.

Portare la concentrazione a 6 milioni di cellule per millilitro in S-E-B-S-S e dividere lo spermatozoo in aliquote da 200 microlitri in provette a fondo tondo di polistirene da cinque millilitri. Tappo senza stringere. Se si sta studiando la risposta delle cellule capacitate, incubare le provette per cinque o sei ore a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica per consentire la capacitazione Applicare 10 microlitri di polilisina al 10% come una serie di piccole gocce al centro di un 22 per 50 millimetri.

Numero uno slittare la copertura e lasciarlo asciugare completamente. Utilizzare grasso sottovuoto per fissare il lato trattato con il vetrino coprioggetto a una camera di imaging fusibile incorporata. A tale scopo.

Per ogni esperimento di imaging, selezionare una singola provetta di celle capacitate e aggiungere 1,2 microlitri di 2,5 milligrammi per millilitro. Verde d'organo calcio-dipendente disciolto in DMSO per una concentrazione finale di 10 micromolari. Incubare la provetta per 40 minuti a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica.

Utilizzando un Pepto da 200 microlitri con punta P 200, rimuovere completamente tutta la soluzione dal tubo. Riempire la camera iniettando delicatamente nella porta di afflusso. Inclinare la camera in modo che le bolle fuoriescano attraverso il deflusso.

Posizionare l'intera camera nell'incubatore e incubare per altri 20 minuti a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica. Per consentire agli spermatozoi di aderire alla poli-D lisina. Montare la camera sul microscopio a fluorescenza invertita e collegarla all'apparecchio di perfusione.

Lasciare il preparato al buio per almeno 10 minuti per far spazzare via la perfusione. Le cellule libere e l'extracellulare muoiono sotto contrasto di fase con ingrandimento di 40x o 60x, scegliere un campo visivo in cui la spaziatura cellulare sia sufficiente per consentire di valutare separatamente la fluorescenza di ciascuna cellula. Le cellule devono essere adeguatamente attaccate, ma preferibilmente esibiscono una chiara attività fledger

Portare il microscopio sul canale fluorescente verde. Mantenere i tempi di esposizione al minimo richiesto per ottenere un'immagine fluorescente nitida. Per ridurre il fotosbiancamento nel software IQ.

Attiva l'acquisizione dell'immagine della serie temporale. Acquisisci immagini a 0,1 hertz e utilizza un otturatore controllato da software per limitare l'illuminazione. Inizialmente registrando per un periodo di controllo da tre a cinque minuti, manipolare la concentrazione di calcio della soluzione salina e applicare i farmaci cambiando la soluzione salina all'intestazione del sistema di perfusione.

Prendere nota del tempo in cui ogni stimolo viene aggiunto all'intestazione e calcolare il suo tempo di arrivo nella camera come descritto nella parte scritta di questo protocollo. Per analizzare le immagini offline, utilizzare uno degli strumenti di disegno per delineare una regione di interesse o ROI attorno a ciascuna cellula o parte di una cellula qui, la testa posteriore dello spermatozoo perché il calcio immagazzinato come mobilitato in quest'area. Scorri con la barra di scorrimento per controllare la serie di immagini.

Identificare e rimuovere le cellule che non riescono a rimanere completamente all'interno del ROI, si sovrappongono ad altre cellule o hanno mostrato l'aumento ampio e rapido seguito da un forte calo dell'intensità della fluorescenza caratteristica della morte cellulare. Utilizza la funzione di analisi per generare una serie di intensità di fluorescenza temporale per ogni ROI. I dati possono quindi essere esportati e analizzati in un foglio di calcolo.

Queste immagini provengono da una serie ottenuta durante la stimolazione con tre progesterone micromolari. La fila inferiore è stata rivestita in pseudo colore. Per illustrare meglio i cambiamenti di intensità relativa, il progesterone è entrato nella camera qui. Qui.

Questi risultati sono animati in un video time-lapse. Si noti il rapido picco di intensità della fluorescenza seguito da un lento aumento che indica cambiamenti corrispondenti nei livelli di calcio intracellulare. Questi dati sono qui quantificati dalle intensità medie della testa posteriore di tre cellule.

Tre micromolari di progesterone sono stati aggiunti all'ora contrassegnata dalla freccia. La linea tratteggiata mostra la fluorescenza di controllo media. Oggi vi abbiamo appena mostrato come isolare cellule di buona qualità, caricarle con un colorante sensibile al calcio e monitorare la risposta delle singole cellule alla stimolazione.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare la migliore popolazione cellulare possibile, ridurre al minimo l'illuminazione delle cellule per evitare danni fotografici e scegliere il colorante che si adatta meglio alle risposte che si stanno osservando. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.