Name: Misurare intracellulare Ca 2 + Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e limaging cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Impara a misurare le fluttuazioni di calcio intracellulare nello sperma umano con tecniche fluorometriche, citometria a flusso e imaging cellulare. Questo metodo sensibile sostituisce le tecniche radioattive per studiare la fisiologia dello sperma.

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Gli autori ringraziano Jose Luis De la Vega, Erika Melchy e Dr. Takuya Nishigaki per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-Messico) (99.333 e 128.566 per CT); Dirección General de Asuntos del personale Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 a CT).

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Segnalazione intracellulare è di vitale importanza per la maggior parte delle attività cellulari; Ca 2 + è un messaggero ubiquitario che accompagna le cellule di mammiferi in tutto il loro intero ciclo di vita, dalla loro origine alla fecondazione, alla fine del loro ciclo di vita. In risposta a stimoli diversi, [Ca 2 +] i aumenta, oscilla e diminuisce con codificazione spazio-temporale, di conseguenza, diversi processi sono attivati, modulate o denuncia da parte di Ca 2 + messaggi codif...

Ca 2 + è un secondo messaggero universale di vie di trasduzione del segnale in cellule eucariotiche. Intracellulare di Ca 2 + (Ca 2 + i) partecipa alla regolazione di molti processi fisiologici fondamentali nelle cellule sia eccitabili e non eccitabili. L&#39;importanza e l&#39;universalità di Ca 2 + come secondo messaggero durante eventi di trasduzione del segnale è derivato dalla sua versatilità spazio-temporale nella trasmissione delle informazioni all&#39;interno della cellula. Mentre Ca 2 + non possono essere sintetizzati de novo o degradati all&#39;interno della cellula, la sua concentrazione intracellulare ([Ca 2 +] i) viene mantenuta entro limiti molto ristretti attraverso diversi meccanismi cellulari che continuamente tampone, sequester, compartimenti stagni, e / o accumulare Ca 2 +. Cambiamenti nella concentrazione di questo ione possono verificarsi in aree molto localizzate all&#39;interno della cella 1, e decifrare tali fluttuazioni è essenziale per ottenere una deeper comprensione di (1) il loro ruolo nel meccanismo di segnalazione, (2) il loro significato fisiologico, e (3) meccanismi generali di segnalazione cellulare. Ca 2 +-mediata segnalazione è di particolare importanza in sperma fisiologia 2. La motilità degli spermatozoi è una delle funzioni più importanti per il successo la fecondazione, e in effetti, diversi difetti della motilità degli spermatozoi può causare sterilità 3-5. L&#39;importanza di Ca 2 + in movimento flagellare tempo è stato riconosciuto 6, tuttavia, il meccanismo di come Ca 2 + controlla la forma specifica di flagellare curvatura non è completamente nota. Prima di fondersi con l&#39;uovo, spermatozoi deve subire capacitazione, un processo complesso alla residenza spermatozoo all&#39;interno del tratto femminile. Durante la capacitazione, architettura lipidico della membrana e l&#39;organizzazione spermatozoi vengono modificati, soprattutto a seguito della rimozione del colesterolo dalla membrana plasmatica. Inoltre, diverse proteine ​​sono tirosin-fosforoylated 7. Soprattutto, durante la capacitazione vi è un aumento del pH intracellulare (pH i) e in [Ca 2 +] i, e il potenziale di membrana hyperpolarizes in alcune specie 2. Capacitazione avviene solo in una sottopopolazione di spermatozoi (20-40%), ed i meccanismi coinvolti in tutti questi cambiamenti cellulari sono tutt&#39;altro che chiare. E &#39;generalmente accettato che solo una sottopopolazione di spermatozoi capacitati subiscono la reazione acrosomiale (AR), quando esposti ad induttori fisiologici. L&#39;AR è anche un evento di 2 +-regolamentato Ca richiesto per la fertilizzazione in tutte le specie che possiedono un acrosomiale (organello specializzato con le membrane esterne ed interne). Durante questo processo i fusibili membrana acrosomiale esterna con la membrana plasmatica dello spermatozoo, rilasciando enzimi idrolitici che permettono al spermatozoo di penetrare la matrice glico-proteico che circonda l&#39;uovo (zona pellucida, o ZP). L&#39;AR espone anche una nuova superficie spermatozoo fusogenica che interagisce conla membrana plasmatica uovo per la fusione finale di entrambi i gameti. Ci sono diversi ligandi cellulari che inducono l&#39;AR, progesterone essendo uno dei più studiati tra loro. In questo lavoro presentiamo quattro diverse tecniche che prevedono l&#39;utilizzo di un colorante fluorescente Ca 2 +-sensibile da misurare [Ca 2 +] i cambiamenti di sperma umano innescata dal progesterone (tranne per citometria di flusso, in cui abbiamo misurato la [Ca 2 + ] i aumentare indotta durante il processo di capacitazione in vitro). In questo caso particolare abbiamo utilizzato Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorante membrana permeabile con una K d = 325 nM. In vitro abbiamo monitorato cambiamenti di fluorescenza in funzione del tempo con tre delle metodologie, e con la quarta tecnica abbiamo misurato valori di fluorescenza in un singolo punto nel tempo dato. Questi diversi approcci sono complementari, in quanto del tutto che forniscono risoluzione spaziale e temporaleoluzione sia a singola cella e livelli di popolazione di cellule. Cella Popolazione o esperimenti Bulk Tecniche di bulk sono ampiamente utilizzati non solo perché gli strumenti di cui hanno bisogno sono facilmente disponibili, ma anche perché sono semplici, ben consolidata, e consentono il calcolo della media delle informazioni a misurazioni effettuate su milioni di cellule in un singolo esperimento. Tecnica # 1. Fluorometria convenzionale Questa tecnica monitora le variazioni nella fluorescenza in funzione del tempo; gli esperimenti sono eseguite in provette di vetro con volumi di campione da 200 a 1.000 microlitri. Corretta miscelazione dei reagenti aggiunti richiede agitazione magnetica, e quindi la risoluzione temporale ottenuta è dell&#39;ordine di secondi. L&#39;intervallo di concentrazione cellulare tipica dei campioni analizzati è di 10 -10 8 5 cellule / ml. Tecnica # 2. Arrestato fluorometria flusso Tsua tecnica controlla anche cambiamenti nella fluorescenza in funzione del tempo, ma i reagenti vengono rapidamente miscelati tra loro (mediante pressione) in una cuvetta di registrazione contenente un volume di campione molto piccolo (che vanno 25-100 microlitri). Pertanto, omogeneizzazione dei reagenti è istantanea, consentendo un&#39;elevata risoluzione temporale nell&#39;ordine di millisecondi. Analisi delle tracce risultanti fluorescenza in funzione del tempo sono adatte per determinare le velocità di reazione, chiarire la complessità del meccanismo di reazione, ottenendo informazioni sulle intermedi di reazione breve durata, ecc L&#39;intervallo di concentrazione cellulare comune dei campioni analizzati è 10 5 -10 7 cellule / ml. Esperimenti Single Cell Esperimenti bulk riportano il comportamento medio di un gran numero di cellule, tuttavia, una popolazione può frequentemente esibire proprietà eterogenee che sono trascurati durante tale tipo di misure. Tecniche di singola cella sono quindi utilizzati per integrare thinformazioni e ottenuto con esperimenti popolazioni cellulari. Tecnica # 3. Citometria a Flusso Nonostante l&#39;importanza delle informazioni derivanti da misurazioni singola cellula, è importante analizzare un gran numero di celle per impedire l&#39;estrapolazione erronea proprietà cellula-specifici per un&#39;intera popolazione. Per questo motivo, le tecniche ad alta produttività sono favorite e il metodo più popolare è citometria di flusso, in cui 10.000 cellule per condizione sono convenzionalmente analizzati. Questo metodo consente l&#39;analisi multi-parametrica di popolazioni eterogenee come è categorizza le cellule in base alla loro dimensione (forward scatter (FSC)), granularità (side scatter (SSC)) e di intensità di fluorescenza (etichettatura specifica con un anticorpo, marcatore viabilità, ecc) , fornendo così informazioni sulla distribuzione dei parametri &#39;per un gruppo di celle. Citometria a flusso fornisce immediata, piuttosto che le informazioni in funzione del tempo 8. In avanti e laterale valori scatter are anche utile per selezionare una porta che include celle ma discrimina detriti cellulari, polvere, ecc Per misure di fluorescenza, fluorescenza controlli negativi e positivi deve essere inclusa anche. Se viene usato più di un canale di fluorescenza, un processo noto come compensazione deve essere eseguita (per dettagli vedere <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensazione consente sovrapposizione spettrale discriminazione tra fluorofori. Citometria di flusso consente anche la discriminazione di cellule morte, generalmente per mezzo di propidio ioduro colorazione. Tecnica # 4. Singolo Imaging cellulare Microscopia è un altro metodo comune per studiare il comportamento di singole cellule, ma è adatto per gli studi di tempo-dipendenti e fornisce anche la risoluzione spaziale. Un grave inconveniente è che l&#39;analisi high-throughput è solo agli inizi in questo momento <sup&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato circa 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Makler</td><td>SEFI Medical Instuments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 fiale/50 &mu; g ciascuno</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reagenti per spermatozoi umani medium (HSM)</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>L-lattato di sodio (circa 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-7022</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Componente B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-Ottilfenossipolietossietanolo)</td><td>Soluzione Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>2.4 mM in acqua </td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti rotondo </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm di diametro</td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Camera cellulare, per microscopia</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

misurare intracellulare ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria flow, citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Gli spermatozoi sono cellule riproduttive maschili specialmente progettati per raggiungere, riconoscere e fondersi con l&#39;uovo. Per eseguire queste attività, gli spermatozoi devono essere preparati ad affrontare un ambiente in costante evoluzione e per superare le numerose barriere fisiche. Essere in sostanza transcriptionally e translationally silenziosa, queste cellule mobili affidano profondamente su diversi meccanismi di segnalazione di orientarsi e di nuotare in modo diretto, e fare i conti con le difficili condizioni ambientali durante il loro viaggio per trovare l&#39;uovo. In particolare, Ca 2 +-mediata segnalazione è fondamentale per diverse funzioni spermatiche: attivazione della motilità, capacitazione (un processo complesso che prepara lo sperma per la reazione acrosomiale) e la reazione acrosomiale (un evento esocitotico che permette la fusione spermatozoo-uovo). L&#39;uso di coloranti fluorescenti per monitorare fluttuazioni intracellulari di questo ione è di notevole importanza per la loro facilità di applicazione, sensibilità e versatilità di detezione. Utilizzando un unico protocollo di colorante di caricamento utilizziamo quattro diverse tecniche di fluorimetrici per monitorare lo sperma Ca 2 + dinamica. Ciascuna tecnica fornisce informazioni distinta che consente la risoluzione spaziale e / o temporale, generando dati sia a singola cella e di popolazioni cellulari.

<img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per la preparazione dei campioni di sperma con il metodo semi-sommerso. Le fasi principali per la separazione di spermatozoi mobili e per la regolazione della loro concentrazione sono illustrate. L&#39;ultimo passaggio di incubazione viene eseguita solo q...

Intracellulare di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinamiche sono molto importanti in sperma fisiologia e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibili coloranti fluorescenti costituiscono uno strumento versatile per studiarli. Esperimenti di popolazione (fluorometria e fermato il flusso fluorometria) ed esperimenti cella singola (citometria a flusso e l&#39;imaging di singola cellula) sono utilizzati per tenere traccia spazio-temporale [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Cambiamenti nelle cellule di sperma umano.

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le fluttuazioni intracellulari di calcio negli spermatozoi umani mediante l'utilizzo di coloranti fluorescenti. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando il campione di spermatozoi con il metodo dello swim up e, se necessario, inducendo la capacitazione. Il secondo passaggio consiste nel caricare gli spermatozoi con un colorante fluorescente per il calcio.Successivamente, utilizzando fluorimetria convenzionale, fluorimetria in flusso arrestato, citometria a flusso o imaging a singola cellula, eseguire l'esperimento e registrare le misurazioni del calcio. Infine, i risultati vengono analizzati per determinare le variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio indotte dal progesterone o durante il processo di capacITazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che implicano l'uso di radioattività, è che si tratta di una procedura molto sensibile.È sicuro ed è facile da eseguire. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione calcica SPR, come l'identificazione di composti che inducono l'aumento del calcio intracellulare con el

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Tecniche di Imaging Ca 2 + Segnalazione di sperma umano

Il calcio è coinvolto in numerose vie di segnalazione fisiologici e fisiopatologici. Imaging cellulare dal vivo richiede attrezzature specializzate e può richiedere molto tempo. Un rapido, metodo semplice usando un citometro di flusso per determinare variazioni relative del calcio citosolico nelle cellule epiteliali aderenti portati in sospensione è stata ottimizzata.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Qui, presentiamo le metodologie per valutare l'integrità della membrana di spermatozoan, una cellulare caratteristica associata con competenza di fertilizzazione dello sperma. Descriviamo tre tecniche per la valutazione di fluorimetrico delle membrane degli spermatozoi: macchiatura simultanea con sonde fluorescenti specifiche, microscopia a fluorescenza e citometria a flusso di sperma-dedicato avanzate. Inoltre vengono presentati esempi di combinazione delle metodologie.

Fluorimetrica tecniche per la valutazione delle membrane degli spermatozoi

Qui, due saggi di medio-velocità effettiva per la valutazione degli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sono descritti. Queste analisi possono essere utilizzate per rapidamente e facilmente a schermo grandi quantità di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano.

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Questo protocollo descrive come eseguire registrazioni elettriche da spermatozoi di mammifero in una configurazione a cellula intera, con l'obiettivo di registrare direttamente l'attività dei canali ionici. Il metodo è stato determinante per descrivere i profili elettrofisiologici di diversi canali ionici degli spermatozoi e ha contribuito a rivelare la loro identità molecolare e regolazione.

Registrazione delle correnti elettriche attraverso la membrana plasmatica degli spermatozoi dei mammiferi

Il presente protocollo fornisce una soluzione pratica che consente di misurare l'apoptosi, il potenziale di membrana mitocondriale e il danno al DNA negli spermatozoi umani con un singolo citometro.

Analisi citofluorimetrica di biomarcatori per la rilevazione di difetti funzionali degli spermatozoi umani

Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell'acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.

Imaging in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'esocitosi in spermatozoi di topo vivi

Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca2+) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca2+ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca2+ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Un metodo efficace per ottenere altamente purificato frazioni praticabile meiotica da mouse testicolo è descritto, che unisce un raffinato cellulare dissociazione protocollo con fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS). Questo metodo sfrutta le differenze nel contenuto di DNA nucleare e la densità di discreta frazioni meiotico.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

Impara a misurare le fluttuazioni di calcio intracellulare nello sperma umano con tecniche fluorometriche, citometria a flusso e imaging cellulare. Questo metodo sensibile sostituisce le tecniche radioattive per studiare la fisiologia dello sperma.

Misurare intracellulare Ca 2 + Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e limaging cellulare (Video) | JoVE Journal

Misurare intracellulare Ca

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