Name: Misurare intracellulare Ca 2 + Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e limaging cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 26 s
Description: Impara a misurare le fluttuazioni di calcio intracellulare nello sperma umano con tecniche fluorometriche, citometria a flusso e imaging cellulare. Questo metodo sensibile sostituisce le tecniche radioattive per studiare la fisiologia dello sperma.

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Gli autori ringraziano Jose Luis De la Vega, Erika Melchy e Dr. Takuya Nishigaki per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT-Messico) (99.333 e 128.566 per CT); Dirección General de Asuntos del personale Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 a CT).

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Segnalazione intracellulare è di vitale importanza per la maggior parte delle attività cellulari; Ca 2 + è un messaggero ubiquitario che accompagna le cellule di mammiferi in tutto il loro intero ciclo di vita, dalla loro origine alla fecondazione, alla fine del loro ciclo di vita. In risposta a stimoli diversi, [Ca 2 +] i aumenta, oscilla e diminuisce con codificazione spazio-temporale, di conseguenza, diversi processi sono attivati, modulate o denuncia da parte di Ca 2 + messaggi codif...

Ca 2 + è un secondo messaggero universale di vie di trasduzione del segnale in cellule eucariotiche. Intracellulare di Ca 2 + (Ca 2 + i) partecipa alla regolazione di molti processi fisiologici fondamentali nelle cellule sia eccitabili e non eccitabili. L&#39;importanza e l&#39;universalità di Ca 2 + come secondo messaggero durante eventi di trasduzione del segnale è derivato dalla sua versatilità spazio-temporale nella trasmissione delle informazioni all&#39;interno della cellula. Mentre Ca 2 + non possono essere sintetizzati de novo o degradati all&#39;interno della cellula, la sua concentrazione intracellulare ([Ca 2 +] i) viene mantenuta entro limiti molto ristretti attraverso diversi meccanismi cellulari che continuamente tampone, sequester, compartimenti stagni, e / o accumulare Ca 2 +. Cambiamenti nella concentrazione di questo ione possono verificarsi in aree molto localizzate all&#39;interno della cella 1, e decifrare tali fluttuazioni è essenziale per ottenere una deeper comprensione di (1) il loro ruolo nel meccanismo di segnalazione, (2) il loro significato fisiologico, e (3) meccanismi generali di segnalazione cellulare. Ca 2 +-mediata segnalazione è di particolare importanza in sperma fisiologia 2. La motilità degli spermatozoi è una delle funzioni più importanti per il successo la fecondazione, e in effetti, diversi difetti della motilità degli spermatozoi può causare sterilità 3-5. L&#39;importanza di Ca 2 + in movimento flagellare tempo è stato riconosciuto 6, tuttavia, il meccanismo di come Ca 2 + controlla la forma specifica di flagellare curvatura non è completamente nota. Prima di fondersi con l&#39;uovo, spermatozoi deve subire capacitazione, un processo complesso alla residenza spermatozoo all&#39;interno del tratto femminile. Durante la capacitazione, architettura lipidico della membrana e l&#39;organizzazione spermatozoi vengono modificati, soprattutto a seguito della rimozione del colesterolo dalla membrana plasmatica. Inoltre, diverse proteine ​​sono tirosin-fosforoylated 7. Soprattutto, durante la capacitazione vi è un aumento del pH intracellulare (pH i) e in [Ca 2 +] i, e il potenziale di membrana hyperpolarizes in alcune specie 2. Capacitazione avviene solo in una sottopopolazione di spermatozoi (20-40%), ed i meccanismi coinvolti in tutti questi cambiamenti cellulari sono tutt&#39;altro che chiare. E &#39;generalmente accettato che solo una sottopopolazione di spermatozoi capacitati subiscono la reazione acrosomiale (AR), quando esposti ad induttori fisiologici. L&#39;AR è anche un evento di 2 +-regolamentato Ca richiesto per la fertilizzazione in tutte le specie che possiedono un acrosomiale (organello specializzato con le membrane esterne ed interne). Durante questo processo i fusibili membrana acrosomiale esterna con la membrana plasmatica dello spermatozoo, rilasciando enzimi idrolitici che permettono al spermatozoo di penetrare la matrice glico-proteico che circonda l&#39;uovo (zona pellucida, o ZP). L&#39;AR espone anche una nuova superficie spermatozoo fusogenica che interagisce conla membrana plasmatica uovo per la fusione finale di entrambi i gameti. Ci sono diversi ligandi cellulari che inducono l&#39;AR, progesterone essendo uno dei più studiati tra loro. In questo lavoro presentiamo quattro diverse tecniche che prevedono l&#39;utilizzo di un colorante fluorescente Ca 2 +-sensibile da misurare [Ca 2 +] i cambiamenti di sperma umano innescata dal progesterone (tranne per citometria di flusso, in cui abbiamo misurato la [Ca 2 + ] i aumentare indotta durante il processo di capacitazione in vitro). In questo caso particolare abbiamo utilizzato Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorante membrana permeabile con una K d = 325 nM. In vitro abbiamo monitorato cambiamenti di fluorescenza in funzione del tempo con tre delle metodologie, e con la quarta tecnica abbiamo misurato valori di fluorescenza in un singolo punto nel tempo dato. Questi diversi approcci sono complementari, in quanto del tutto che forniscono risoluzione spaziale e temporaleoluzione sia a singola cella e livelli di popolazione di cellule. Cella Popolazione o esperimenti Bulk Tecniche di bulk sono ampiamente utilizzati non solo perché gli strumenti di cui hanno bisogno sono facilmente disponibili, ma anche perché sono semplici, ben consolidata, e consentono il calcolo della media delle informazioni a misurazioni effettuate su milioni di cellule in un singolo esperimento. Tecnica # 1. Fluorometria convenzionale Questa tecnica monitora le variazioni nella fluorescenza in funzione del tempo; gli esperimenti sono eseguite in provette di vetro con volumi di campione da 200 a 1.000 microlitri. Corretta miscelazione dei reagenti aggiunti richiede agitazione magnetica, e quindi la risoluzione temporale ottenuta è dell&#39;ordine di secondi. L&#39;intervallo di concentrazione cellulare tipica dei campioni analizzati è di 10 -10 8 5 cellule / ml. Tecnica # 2. Arrestato fluorometria flusso Tsua tecnica controlla anche cambiamenti nella fluorescenza in funzione del tempo, ma i reagenti vengono rapidamente miscelati tra loro (mediante pressione) in una cuvetta di registrazione contenente un volume di campione molto piccolo (che vanno 25-100 microlitri). Pertanto, omogeneizzazione dei reagenti è istantanea, consentendo un&#39;elevata risoluzione temporale nell&#39;ordine di millisecondi. Analisi delle tracce risultanti fluorescenza in funzione del tempo sono adatte per determinare le velocità di reazione, chiarire la complessità del meccanismo di reazione, ottenendo informazioni sulle intermedi di reazione breve durata, ecc L&#39;intervallo di concentrazione cellulare comune dei campioni analizzati è 10 5 -10 7 cellule / ml. Esperimenti Single Cell Esperimenti bulk riportano il comportamento medio di un gran numero di cellule, tuttavia, una popolazione può frequentemente esibire proprietà eterogenee che sono trascurati durante tale tipo di misure. Tecniche di singola cella sono quindi utilizzati per integrare thinformazioni e ottenuto con esperimenti popolazioni cellulari. Tecnica # 3. Citometria a Flusso Nonostante l&#39;importanza delle informazioni derivanti da misurazioni singola cellula, è importante analizzare un gran numero di celle per impedire l&#39;estrapolazione erronea proprietà cellula-specifici per un&#39;intera popolazione. Per questo motivo, le tecniche ad alta produttività sono favorite e il metodo più popolare è citometria di flusso, in cui 10.000 cellule per condizione sono convenzionalmente analizzati. Questo metodo consente l&#39;analisi multi-parametrica di popolazioni eterogenee come è categorizza le cellule in base alla loro dimensione (forward scatter (FSC)), granularità (side scatter (SSC)) e di intensità di fluorescenza (etichettatura specifica con un anticorpo, marcatore viabilità, ecc) , fornendo così informazioni sulla distribuzione dei parametri &#39;per un gruppo di celle. Citometria a flusso fornisce immediata, piuttosto che le informazioni in funzione del tempo 8. In avanti e laterale valori scatter are anche utile per selezionare una porta che include celle ma discrimina detriti cellulari, polvere, ecc Per misure di fluorescenza, fluorescenza controlli negativi e positivi deve essere inclusa anche. Se viene usato più di un canale di fluorescenza, un processo noto come compensazione deve essere eseguita (per dettagli vedere <a href="http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp</a> ). Compensazione consente sovrapposizione spettrale discriminazione tra fluorofori. Citometria di flusso consente anche la discriminazione di cellule morte, generalmente per mezzo di propidio ioduro colorazione. Tecnica # 4. Singolo Imaging cellulare Microscopia è un altro metodo comune per studiare il comportamento di singole cellule, ma è adatto per gli studi di tempo-dipendenti e fornisce anche la risoluzione spaziale. Un grave inconveniente è che l&#39;analisi high-throughput è solo agli inizi in questo momento <sup&gt; 9.

<table><tbody><tr><td>Ham's F-10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-6013</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato circa 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-3881</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Makler</td><td>SEFI Medical Instuments LTD</td><td>SEF-MAKL</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td>20 fiale/50 &mu; g ciascuno</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Alomone</td><td>I-700</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0130</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3911</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>JT Baker</td><td>3506</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2670</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3125</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>JT Baker</td><td>1906-01</td><td>Reagenti per spermatozoi umani medium (HSM)</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2256</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>L-lattato di sodio (circa 99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-7022</td><td>Reagenti per terreno spermatico umano (HSM)</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio </td><td>Invitrogen</td><td>L-7011</td><td>Componente B</td></tr><tr><td>Triton X-100 (t-Ottilfenossipolietossietanolo)</td><td>Soluzione Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>2.4 mM in acqua </td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti rotondo </td><td>VWR</td><td>48380 080</td><td>25 mm di diametro</td></tr><tr><td>Soluzione di poli-L-lisina </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di manganese</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3634</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor; Camera cellulare, per microscopia</td><td>Life technologies</td><td>A-7816</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>5x5 ml</td></tr></tbody></table>

misurare intracellulare ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria flow, citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Gli spermatozoi sono cellule riproduttive maschili specialmente progettati per raggiungere, riconoscere e fondersi con l&#39;uovo. Per eseguire queste attività, gli spermatozoi devono essere preparati ad affrontare un ambiente in costante evoluzione e per superare le numerose barriere fisiche. Essere in sostanza transcriptionally e translationally silenziosa, queste cellule mobili affidano profondamente su diversi meccanismi di segnalazione di orientarsi e di nuotare in modo diretto, e fare i conti con le difficili condizioni ambientali durante il loro viaggio per trovare l&#39;uovo. In particolare, Ca 2 +-mediata segnalazione è fondamentale per diverse funzioni spermatiche: attivazione della motilità, capacitazione (un processo complesso che prepara lo sperma per la reazione acrosomiale) e la reazione acrosomiale (un evento esocitotico che permette la fusione spermatozoo-uovo). L&#39;uso di coloranti fluorescenti per monitorare fluttuazioni intracellulari di questo ione è di notevole importanza per la loro facilità di applicazione, sensibilità e versatilità di detezione. Utilizzando un unico protocollo di colorante di caricamento utilizziamo quattro diverse tecniche di fluorimetrici per monitorare lo sperma Ca 2 + dinamica. Ciascuna tecnica fornisce informazioni distinta che consente la risoluzione spaziale e / o temporale, generando dati sia a singola cella e di popolazioni cellulari.

<img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50344/50344fig1.jpg" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per la preparazione dei campioni di sperma con il metodo semi-sommerso. Le fasi principali per la separazione di spermatozoi mobili e per la regolazione della loro concentrazione sono illustrate. L&#39;ultimo passaggio di incubazione viene eseguita solo q...

Intracellulare di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinamiche sono molto importanti in sperma fisiologia e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibili coloranti fluorescenti costituiscono uno strumento versatile per studiarli. Esperimenti di popolazione (fluorometria e fermato il flusso fluorometria) ed esperimenti cella singola (citometria a flusso e l&#39;imaging di singola cellula) sono utilizzati per tenere traccia spazio-temporale [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Cambiamenti nelle cellule di sperma umano.

Misurare intracellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l&#39;imaging cellulare

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le fluttuazioni intracellulari di calcio negli spermatozoi umani mediante l'utilizzo di coloranti fluorescenti. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando il campione di spermatozoi con il metodo dello swim up e, se necessario, inducendo la capacitazione. Il secondo passaggio consiste nel caricare gli spermatozoi con un colorante fluorescente per il calcio.Successivamente, utilizzando fluorimetria convenzionale, fluorimetria in flusso arrestato, citometria a flusso o imaging a singola cellula, eseguire l'esperimento e registrare le misurazioni del calcio. Infine, i risultati vengono analizzati per determinare le variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio indotte dal progesterone o durante il processo di capacITazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che implicano l'uso di radioattività, è che si tratta di una procedura molto sensibile.È sicuro ed è facile da eseguire. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione calcica SPR, come l'identificazione di composti che inducono l'aumento del calcio intracellulare con elevata risoluzione spaziale e temporale, e l'identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari in un campione di sperma. Le implicazioni derivanti dall'uso, ad esempio, della tecnica di citometria a flusso si estendono verso la diagnosi di problemi di fertilità attraverso l'analisi dello stato fisiologico dei gameti maschili.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per lo studio della mobilitazione del calcio negli spermatozoi umani, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, come gameti maschili di altre specie o diversi tipi cellulari quali neuroni o cellule muscolari. In generale, chi utilizza questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché la manipolazione degli spermatozoi non è semplice e risulta fondamentale mantenere condizioni adeguate per ottenere cellule vitali e mobili durante l'esperimento. Abbiamo implementato l'utilizzo di queste tecniche combinando strategie che sfruttano diversi campi.La dimostrazione visiva di questo metodo è importante poiché la preparazione e la manipolazione del campione, così come l'aggiunta dei composti, sono difficili da apprendere perché le cellule spermatiche possono subire danni durante la procedura e possono verificarsi artefatti nelle risposte durante la somministrazione dei composti. Per preparare il campione spermatico, è necessario stratificare con attenzione un millilitro di mezzo hams F 10 sopra ciascun campione di 500 microlitri di sperma liquefatto. Eloqua, toccare la parete del tubo con la punta della micropipetta ed erogare delicatamente il mezzo al di sopra del campione.È fondamentale eseguire l'operazione lentamente per evitare di mescolare i livelli del campione e del mezzo. Il mezzo è integrato con cloruro di calcio due millimolare e BSA cinque milligrammi per millilitro. Per favorire la capacitazione in vitro, inclinare con attenzione i tubi a un angolo di circa 30 gradi.Questo aumenterà la superficie di contatto tra i due liquidi, potenziando così lo spostamento o la risalita delle cellule spermatiche dal campione al mezzo durante l'incubazione. Successivamente, posizionare le provette inclinate in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, 95% di aria, per un'ora. Dopo un'ora.Utilizzare una pipetta micrometrica per rimuovere con attenzione da ogni provetta i 700 microlitri superiori del mezzo Ham's F10, che ora contiene spermatozoi mobili. Riunire tutti i campioni raccolti in un singolo tubo di vetro pulito, evitando la formazione di bolle. Applicare 10 microlitri del campione combinato sulla lastra di vetro ottica della camera di conta per macchie e posizionare il vetrino coprioggetto.Assicurarsi di evitare la formazione di bolle all'interno della camera, poiché ciò porterebbe a un conteggio cellulare inaccurato. Osservare al microscopio composto dotato di obiettivo 20 x. Il vetrino coprioggetto della camera di conteggio maculare presenta un quadrato grande composto da 100 quadratini più piccoli.Contare le cellule in qualsiasi striscia di 10 quadrati. Questo numero rappresenta la concentrazione cellulare in milioni di cellule per millilitro. Ripetere il conteggio in altre due strisce di 10 quadrati e calcolare la media dei tre conteggi per caricare le cellule con un colorante fluorescente.Unire in una provetta da 1,5 millilitri, il volume richiesto di sospensione di spermatozoi con una quantità sufficiente di soluzione madre di flu oh 3:00 AM a un millimolare per ottenere una concentrazione finale di due micromolare di flu oh 3:00 AM. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius, proteggendo dalla luce. Centrifugare la provetta a 750 G per cinque minuti. La formazione di un turbino anziché di un pellet indica che le cellule sono in buone condizioni. Aspirare e scartare il sopranatante e risospendere il pellet nel volume appropriato di mezzo per spermatozoi umani o HSM. Per iniziare questo esperimento, unire in una provetta di vetro con fondo piatto, 570 microlitri di HSM e 30 microlitri di sospensione di cellule spermatiche precedentemente caricate con flu oh 3:00 AM e risospese in HSM, per ottenere un valore di uno per 10 alla ottava cellule per millilitro.Posizionare un agitatore magnetico all'interno del tubo di vetro ed inserire il tubo nella camera di lettura dello spettrometro preriscaldato a 37 gradi Celsius. Il campione deve essere agitato per tutta la durata del tempo di acquisizione. Avviare l'esperimento utilizzando il software oli e procedere ad acquisire i valori di fluorescenza con una frequenza di 0,5 hertz per 300 secondi.Dopo aver acquisito la fluorescenza di base per 30 secondi, utilizzare una siringa micro Hamilton per iniettare il volume appropriato del composto in esame, in questo caso progesterone micromolare al secondo 100. Aggiungere 20 micromolare di ionomicina come controllo positivo per ottenere il valore massimo di fluorescenza. In questo esperimento, le variazioni di calcio intracellulare vengono misurate con elevata risoluzione temporale.Utilizzando un miscelatore a flusso arrestato SFM 20 abbinato a un sistema ottico per cinetiche rapide, riempire una delle siringhe dello strumento con un millilitro di cellule spermatiche caricate con flu. 3:00 AM e la seconda siringa con un millilitro del composto da testare. 20 micromolare di progesterone disciolto in HSM.In questo esempio, è fondamentale evitare la formazione di bolle durante il prelievo dei liquidi nelle siringhe. Sollevare entrambi i pistoni dello strumento finché non toccano l'estremità delle stantuffi delle siringhe. Impostare in questo caso il tempo totale di campionamento a 50 secondi e la frequenza a 10 millisecondi al fine di minimizzare il danno cellulare; impostare la portata al valore minimo che garantisca un trigger di risposta misurabile.Il mescolamento dei reagenti e l'andamento della fluorescenza grezza in funzione del tempo verranno visualizzati sullo schermo del computer. Ripetere questa procedura sostituendo la progesterone con HSM come controllo negativo e l'ionomicina 10 micromolare come controllo positivo prima della citometria a flusso. Preparare i campioni sperimentali mettendo 500 microlitri di sospensione cellulare per tubo citometrico in ciascuna condizione da testare.Impostare un esperimento utilizzando il software dell'apparecchiatura. Innanzitutto, creare una nuova cartella, un campione sperimentale e il numero di provette. Quindi selezionare le impostazioni appropriate del citometro per flu O 3:00 AM. Utilizzare i filtri per l'isotiocianato di fluoresceina e l'ioduro di propidio.Eseguire i tubi di controllo non colorati uno e due nel citometro. Raccogliere i dati di scattering anteriore e laterale per verificare che le impostazioni della soglia siano appropriate e per creare il relativo cancello al fine di discriminare i detriti dalle cellule. Eseguire i tubi sperimentali e raccogliere i dati di fluorescenza da 10.000 eventi per campione.Alla fine. Esportare tutti i dati nel software disponibile per l'analisi. Preparare i tondini copri-vetrino necessari per questa procedura applicando una goccia di cinque microlitri di soluzione di poli-L-lisina al centro di ciascun tondino.Lasciare riposare per almeno un'ora prima dell'uso, quindi risciacquare l'area trattata con acqua. Questo passaggio rimuoverà l'eccesso di polilisina e permetterà alle cellule spermatiche di aderire al vetrino dalla testa, mentre i loro flagelli potranno ancora muoversi. Montare il vetrino all'interno della camera di registrazione.Posizionare 10 µL di cellule caricate con flu oh 3:00 AM a una concentrazione di 1 × 10⁷ cellule/mL al centro del vetrino. Coprire le cellule con 200 µL di HSM preriscaldato.Posizionare la camera sul palchetto del microscopio, preriscaldato a 37 gradi Celsius, e osservare le cellule utilizzando il contrasto di fase. Selezionare un'area in cui la densità cellulare sia appropriata per l'acquisizione delle immagini. Un numero eccessivo di cellule rende difficile l'analisi a causa del sovrapporsi dei segnali.Le cellule devono essere saldamente attaccate al vetrino coprioggetto tramite la testa, ma devono mostrare movimento dei flagelli, il che conferma la vitalità. Avviare l'esperimento attivando il software di acquisizione delle immagini in serie temporale. Solitamente sono richieste quattro immagini al secondo con un'illuminazione di due millisecondi per immagine.Acquisire immagini a fluorescenza in modalità live. Regolare messa a fuoco e luminosità. Utilizzare una pipetta micrometrica per aggiungere con attenzione, goccia a goccia, il composto in esame – nel presente caso progesterone – e continuare l'acquisizione delle immagini secondo necessità.Eseguire due aggiunte di controllo sequenziali nella stessa camera: 20 micromolare di ionomicina per ottenere la fluorescenza massima e 5 millimolare di cloruro di manganese per ottenere la fluorescenza minima. Eseguire l'analisi delle immagini in modalità offline utilizzando il software IQ.Delimitare le regioni di interesse (ROI) attorno a ogni cellula o parte di una cellula. Inoltre, selezionare un'area priva di cellule per la sottrazione automatica dello sfondo da parte del software. Viene quindi ottenuta una serie temporale dell'intensità di fluorescenza per ciascun ROI e questi dati possono essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi.Il progesterone è uno dei noti induttori della reazione acrosomiale e, come previsto, provoca un aumento transitorio della concentrazione intracellulare di calcio negli spermatozoi umani, misurato mediante fluorimetria convenzionale. L'andamento della fluorescenza rossa nel tempo mostra le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio causate dall'aggiunta di quattro micromolar di progesterone; come controllo negativo è stato aggiunto HSM, che non ha causato alcuna variazione nei livelli di concentrazione intracellulare di calcio, come indicato dall'andamento della fluorescenza blu. Per ciascun andamento è mostrata la variazione indotta da 10 micromolar di ionomicina.L'aggiunta di questo ionoforo del calcio determina l'aumento massimo della concentrazione cellulare di calcio, che non ritorna ai livelli basali. Questo istogramma mostra la variazione media della fluorescenza delta F per ciascuna condizione, più o meno l'errore standard, dove N è uguale a tre e l'asterisco indica un valore di P inferiore a 0,001 rispetto al controllo. L'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dalla progesterone è stato misurato con una risoluzione temporale maggiore mediante fluorimetria in flusso arrestato, e qui vengono mostrati risultati rappresentativi.I tracciati grezzi sono mostrati nel pannello A: sia il progesterone, rappresentato dalla linea rossa, sia l'ionomicina, rappresentata dalla linea blu, hanno causato un rapido aumento della concentrazione intracellulare di calcio. Il tracciato verde è il controllo negativo in cui le cellule sono state mescolate con HSM. Il pannello B mostra i tracciati corretti per i segnali indotti da progesterone o da ionomicina, ottenuti sottraendo il segnale di controllo dai rispettivi segnali grezzi.Il progesterone ha causato un aumento molto rapido e transitorio della concentrazione intracellulare di calcio, con un valore massimo di fluorescenza raggiunto 2,7 secondi dopo l'aggiunta dell'induttore. D'altro canto, il CIN ha indotto un aumento rapido e sostenuto della concentrazione intracellulare di calcio per tutta la durata di 50 secondi. L'ingrandimento nel pannello B mostra una vista ampliata dei primi 500 millisecondi per ciascuna risposta.L'assenza di un ritardo nell'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal progesterone è in accordo con studi precedenti che suggeriscono come il progesterone attivi direttamente il canale del calcio cat spur senza segnalazione intermedia. La concentrazione intracellulare di calcio è stata inoltre misurata in spermatozoi umani capaci e non capaci mediante citometria a flusso. In questi grafici rappresentativi di scattering anteriore e laterale.Le cellule capacitate sono in blu e le cellule non capacitate sono in rosso. Il gate selezionato è indicato con la linea blu e solo le cellule all'interno di quell'area sono state utilizzate per ulteriori analisi. Il pannello B mostra l'istogramma di fluorescenza nel canale Fitzy di spermatozoi non colorati, e il pannello D mostra l'istogramma di fluorescenza nel canale FZ di spermatozoi colorati con flu oh 3:00 AM come osservato nel pannello D. La distribuzione dei valori di fluorescenza per gli spermatozoi capaciti, rappresentata dal tracciato blu, è spostata verso valori più elevati rispetto a quella degli spermatozoi non capaciti, rappresentata dal tracciato rosso.Il pannello C mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale PI di cellule non colorate e il pannello E mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale PI di cellule morte. I valori di fluorescenza per ciascuna singola cellula possono essere osservati nei grafici a punti bidimensionali mostrati qui. Per le cellule non colorate e le cellule colorate in doppio con flu oh 3:00 AM e pi, la percentuale di cellule registrate in ciascun quadrante è indicata dal numero rosso.È importante notare che il segnale derivante dalle cellule morte può essere eliminato. Infine, il cambiamento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal progesterone è stato misurato in singole cellule spermatiche mediante imaging; queste rappresentative immagini a pseudocolore mostrano cellule visualizzate all'inizio e dopo l'aggiunta di progesterone, CIN e cloruro di manganese. L'aggiunta di progesterone provoca un incremento della concentrazione intracellulare di calcio, sia nella testa dello spermatozoo che nel flagello; il cloruro di manganese viene utilizzato per ridurre la flu.Alle 3:00 del mattino, fluorescenza mediante soppressione: in questa figura sono mostrati tracciati rappresentativi di fluorescenza normalizzata di nove singole cellule provenienti dall'esperimento. Come osservato negli esperimenti su popolazioni cellulari, l'analisi su singola cellula ha rivelato un aumento transitorio per la progesterone e un aumento sostenuto per l'ionomicina, rispettivamente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se effettuata correttamente.Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di verificare la vitalità delle cellule ed eseguire i controlli appropriati dopo averla completata. Altri metodi, come l’elettrofisiologia, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio l’identificazione dei canali ionici specifici coinvolti nell’aumento del calcio, impiegando soluzioni adeguate e protocolli di simulazione dopo lo sviluppo della tecnica. Questa metodica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia cellulare per esplorare la dinamica del calcio in cellule vive con elevata risoluzione spaziale e temporale.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare la tecnica più appropriata per misurare l'aumento del calcio intracellulare mediante l'uso di coloranti fluorescenti in qualsiasi tipo di cellula, a seconda della domanda specifica che desideri affrontare. Ricorda che lavorare con campioni di sperma umano può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni come l'uso di donatori con stato di salute verificato. L'utilizzo di guanti in lattice durante la procedura e lo smaltimento adeguato di soluzioni e materiali devono sempre essere osservati durante l'esecuzione di questa procedura.

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