Misurare intracellulare Ca ^{2 +} Modifiche di sperma umano utilizzando quattro tecniche: fluorometria convenzionale, si fermò fluorometria Flow, Citometria a flusso singolo e l'imaging cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le fluttuazioni intracellulari del calcio negli spermatozoi umani con coloranti fluorescenti. Ciò si ottiene preparando prima il campione di sperma con il metodo swim up e, se necessario, promuovendo la capacitazione. Il secondo passo consiste nel caricare lo sperma con un colorante fluorescente di calcio.

Successivamente, utilizzando la fluorimetria convenzionale, la fluorimetria a flusso interrotto, la citometria a flusso o l'imaging a singola cellula, eseguire l'esperimento e registrare le misurazioni del calcio. In definitiva, i risultati vengono analizzati per determinare i cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di calcio innescate dal progesterone o durante il processo di capacitazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quelli che coinvolgono la radioattività è che si tratta di una procedura molto delicata.

È sicuro e facile da eseguire. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione del calcio SPR, come l'identificazione di composti che inducono il calcio intracellulare, aumenta con un'elevata risoluzione spaziale e temporale e l'identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari in un campione di siemen. Le implicazioni dell'utilizzo, ad esempio, della tecnica della citometria a flusso si estendono alla diagnosi dei problemi di fertilità attraverso l'analisi dello stato fisiologico delle gamme maschili.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sullo studio della mobilizzazione del calcio degli spermatozoi umani, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule come le gamme maschili di altre specie o diversi tipi di cellule come i neuroni o le cellule muscolari. In generale, gli individui che utilizzano questo metodo avranno difficoltà perché la gestione dello sperma non è facile ed è importante mantenere le condizioni appropriate per ottenere cellule vitali e motorie attraverso l'esperimento. Abbiamo implementato l'uso di queste tecniche combinando strategie utilizzando diversi campi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è importante in quanto la preparazione e la manipolazione del campione, così come l'aggiunta dei composti, sono difficili da apprendere perché gli spermatozoi possono essere danneggiati durante la procedura e gli artefatti nelle risposte potrebbero essere ottenuti durante l'edizione dei composti. Per preparare il campione di sperma, un millilitro di prosciutti F 10 medium deve essere accuratamente stratificato sopra ogni 500 microlitri di seme liquefatto. Eloqua, toccare la parete della provetta con la punta della micropipetta ed erogare delicatamente il terreno sopra il campione.

È fondamentale farlo lentamente per evitare di mescolare il campione e gli strati medi. Il terreno è integrato con due millimolari di cloruro di calcio e cinque milligrammi per millilitro di BSA. Per favorire la capacitazione in vitro, inclinare con cautela i tubi a un angolo di circa 30 gradi.

Ciò aumenterà la superficie tra i due liquidi, migliorando così lo spostamento o il rialzo degli spermatozoi dal campione al terreno durante l'incubazione. Quindi, posizionare le provette magre all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. 95% di aria per un'ora dopo un'ora.

Utilizzare una micropipetta per rimuovere con cura da ogni tubo i 700 microlitri superiori del terreno di coltura F 10 dei prosciutti che ora contiene spermatozoi molil. Raggruppare tutti i campioni raccolti in un unico tubo di vetro pulito, evitando la formazione di bolle. Posizionare 10 microlitri di campione aggregato sul vetro ottico piatto della base di una camera di conteggio maculare e posizionare il vetro di copertura.

Assicurati di evitare la formazione di bolle all'interno della camera in quanto ciò comporterebbe un conteggio delle cellule impreciso. Osservare al microscopio composto dotato di un obiettivo 20x. Il vetro di copertura della camera di conteggio maculare ha un grande quadrato composto da 100 quadrati più piccoli.

Conta le celle in una striscia qualsiasi di 10 quadrati. Questo numero rappresenta la concentrazione di cellule in milioni di cellule per millilitro. Ripetere il conteggio in altre due strisce quadrate da 10 e calcolare la media dei tre conteggi per caricare le celle con un colorante fluorescente.

Combinare in una provetta da 1,5 millilitri, il volume richiesto di sospensione spermatica con una quantità sufficiente di una quantità sufficiente di un millimolare di influenza o 3:00 AM soluzione madre per ottenere una concentrazione finale di due micromolari di influenza oh 3:00 AM incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius e proteggere dalla luce centrifugare la provetta a 750 G per cinque minuti. La formazione di una nuvola piuttosto che di un pellet indica che le cellule sono in buone condizioni, aspirano e scartano il surnatante e riprospendono il pellet nel volume appropriato di terreno spermatico umano o HSM. Per iniziare questo esperimento, combinare in un tubo di vetro a fondo piatto, 570 microlitri di HSM e 30 microlitri di sospensione di spermatozoi precedentemente caricata con influenza alle 3:00 AM e risospesa in HSM per ottenere una volta 10 all'ottavo di cellule per millilitro.

Posizionare un'ancoretta magnetica all'interno del tubo di vetro e inserire il tubo nella camera di lettura dello spettrometro preriscaldato a 37 gradi Celsius. Il campione deve essere agitato per tutto il tempo di acquisizione. Iniziare l'esperimento utilizzando il software oli e procedere all'acquisizione dei valori di fluorescenza a una frequenza di 0,5 hertz per 300 secondi.

Dopo aver acquisito la fluorescenza basale per 30 secondi, utilizzare una siringa Hamilton Micro per iniettare il volume appropriato di composto in esame in questo caso per il progesterone micromolare a 100 secondi. A 20 micromolari ione micina come controllo positivo per ottenere il massimo valore di fluorescenza. In questo esperimento, le variazioni intracellulari del calcio sono misurate con un'alta risoluzione temporale.

Utilizzando un miscelatore a flusso interrotto SFM 20 accoppiato a un sistema ottico a cinetica rabbiosa, riempire una delle siringhe dello strumento con un millilitro di cellule spermatiche caricate per l'influenza alle 3:00 del mattino e la seconda siringa con un millilitro del composto da testare. 20 micromolari di progesterone disciolto in HSM.

In questo esempio, è fondamentale evitare la formazione di bolle durante l'aspirazione dei liquidi nelle siringhe. Sollevare entrambi i pistoni dello strumento finché non toccano la punta degli stantuffi della siringa. Impostare il tempo di campionamento totale in questo caso su 50 secondi e la frequenza su 10 millisecondi per ridurre al minimo i danni alle celle, impostare la velocità di flusso sul valore minimo che fornirà un trigger di risposta misurabile.

La miscelazione dei reagenti, la traccia di fluorescenza grezza rispetto al timo verranno visualizzate sullo schermo del computer. Ripetere questa procedura sostituendo il progesterone con HSM come controllo negativo e 10 micromolari di ione micina come controllo positivo prima della citometria a flusso. Preparare i campioni sperimentali posizionando 500 microlitri di sospensione cellulare per provetta del citometro in ogni condizione da testare.

Impostare un esperimento utilizzando il software dell'apparecchiatura. Innanzitutto, crea una nuova cartella, il campione dell'esperimento e il numero di provette. Quindi selezionare le impostazioni appropriate del citometro per l'influenza O 3:00 AM. Utilizzare i filtri isotiocianato di fluoresceina e ioduro di propidio.

Far scorrere i tubi di controllo non colorati uno e due nel citometro. Raccogli i dati di dispersione diretta e laterale per verificare che le impostazioni di soglia siano appropriate e per creare il gate corrispondente al fine di discriminare i detriti dalle celle. Esegui le provette sperimentali e raccogli i dati di fluorescenza da 10.000 eventi per campione.

Alla fine. Esporta tutti i dati nel software disponibile per l'analisi. Preparare i vetrini coprioggetti rotondi necessari per questa procedura applicando una goccia da cinque microlitri di soluzione di poli-L lisina al centro di ciascun vetrino coprioggetti.

Lasciare agire per almeno un'ora prima dell'uso, risciacquare la zona trattata con acqua. Questo rimuoverà la polilisina in eccesso e consentirà agli spermatozoi di aderire al vetrino coprioggetti dalla loro testa mentre i loro flagelli possono ancora muoversi. Montare il vetrino coprioggetto all'interno della camera di registrazione.

Mettere 10 microlitri di cellule caricate per l'influenza alle 3:00 del mattino a una concentrazione di una volta per 10 al settimo cellulare per millilitro. Al centro del vetrino coprioggetto. Coprire le celle con 200 microlitri di HSM pre preriscaldato.

Posizionare la camera sul tavolino del microscopio, preriscaldata a 37 gradi Celsius, e visualizzare le cellule utilizzando il contrasto di fase. Selezionare un'area in cui la densità cellulare è appropriata per l'imaging. Troppe cellule rendono difficile l'analisi a causa della sovrapposizione dei segnali.

Le cellule dovrebbero essere saldamente attaccate al vetrino coprioggetto per la testa, ma mostrano il movimento dei flagelli, che ne conferma la vitalità. Avviare l'esperimento attivando il software di acquisizione delle immagini delle serie storiche. In genere sono necessarie quattro immagini al secondo con un'illuminazione di due millisecondi per immagine.

Acquisisci immagini a fluorescenza in modalità live. Per regolare la messa a fuoco e la luminosità. In questo caso, utilizzare una micropipetta per aggiungere con cautela il progesterone del composto in esame e continuare l'acquisizione dell'immagine secondo necessità.

Eseguire due aggiunte di controllo sequenziali nella stessa camera. 20 micromolari di ione micina per ottenere la massima fluorescenza e cinque millimolari di cloruro di manganese per ottenere la minima fluorescenza. Esegui l'analisi delle immagini offline utilizzando il software IQ.

Disegna le regioni di interesse o le ROI attorno a ciascuna cella o parte di una cella. Inoltre, selezionare un'area priva di celle per la sottrazione automatica dello sfondo da parte del software. Per ogni ROI si ottiene quindi una serie di intensità di fluorescenza nel tempo e questi dati possono essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi.

Il progesterone è uno dei noti induttori della reazione acrosomica e, come previsto, provoca un aumento transitorio della concentrazione intracellulare di calcio negli spermatozoi umani, misurato mediante fluorimetria convenzionale. La traccia di fluorescenza rossa in funzione del tempo mostra cambiamenti di concentrazione di calcio intracellulare causati dall'aggiunta di quattro progesterone micromolari come HSM di controllo negativo, che non ha causato alcun cambiamento nei livelli di concentrazione di calcio intracellulare come indicato dalla traccia di fluorescenza blu come controllo positivo. Per ogni traccia viene mostrato il cambiamento indotto da 10 micromolari di ione micina.

L'aggiunta di questo ionoforo di calcio provoca il massimo aumento della concentrazione di calcio cellulare per l'artrite reumatoide, che non ritorna ai livelli basali. Questo grafico a barre mostrava la variazione media del delta di fluorescenza F da ciascuna condizione, più o meno l'errore standard dove N è uguale a tre e l'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 rispetto al controllo. L'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal progesterone è stato misurato con maggiore risoluzione temporale mediante fluorimetria a flusso interrotto e i risultati rappresentativi sono mostrati qui.

Le tracce grezze sono mostrate nel pannello A, sia il progesterone rappresentato dalla linea rossa che lo ione micina rappresentato dalla linea blu hanno causato un rapido aumento della concentrazione intracellulare di calcio. La traccia verde è il controllo negativo in cui le cellule sono state mescolate con HSM. Il pannello B mostra le tracce corrette per i segnali indotti con il progesterone o con lo ione micina ottenute sottraendo il segnale di controllo dai corrispondenti segnali grezzi.

Il progesterone ha causato un aumento della concentrazione intracellulare di calcio molto rapido e transitorio con un valore di fluorescenza massimo che si verifica 2,7 secondi dopo l'aggiunta dell'induttore. D'altra parte, la CIN ha causato un aumento rapido e sostenuto della concentrazione intracellulare di calcio per 50 secondi. Il riquadro nel pannello B mostra una visualizzazione espansa dei primi 500 millisecondi per ogni risposta.

L'assenza di un ritardo nell'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal progesterone è coerente con precedenti rapporti che suggeriscono che il progesterone attiva direttamente lo sperone del canale del calcio del gatto senza segnalazione intermedia. La concentrazione intracellulare di calcio è stata misurata anche in spermatozoi umani capacitati e non capacitati utilizzando la citometria a flusso. In questi grafici a dispersione rappresentativi in avanti e lateralmente.

Le celle capacitate sono in blu e le celle non capacitate sono in rosso. Il cancello selezionato è indicato con la linea blu e solo le celle all'interno di quell'area sono state utilizzate per ulteriori analisi. Il pannello B mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale di Fitzy da spermatozoi non colorati e il pannello D mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale FZ da spermatozoi colorati dell'influenza o delle 3:00 AM come osservato nel pannello D.La distribuzione dei valori di fluorescenza per gli spermatozoi capacitati rappresentati dalla traccia blu è spostata a valori più alti rispetto agli spermatozoi non capacitati rappresentati dalla traccia rossa.

Il pannello C mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale PI delle cellule non colorate e il pannello E mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale PI delle cellule morte. I valori di fluorescenza per ogni singola cellula possono essere osservati nei grafici a punti di fluorescenza bidimensionali mostrati qui. Per le cellule non colorate e le cellule doppiamente colorate con l'influenza alle 3:00 AM e pi greco, la percentuale di cellule registrate in ciascun quadrante è indicata dal numero rosso.

È importante sottolineare che il segnale derivante dalle cellule morte può essere eliminato. Infine, la variazione della concentrazione intracellulare di calcio indotta dal progesterone è stata misurata in singoli spermatozoi mediante imaging Queste immagini rappresentative a pseudocolori mostrano le cellule visualizzate all'inizio e dopo le aggiunte di progesterone, CIN e cloruro di manganese. L'aggiunta di progesterone provoca un aumento della concentrazione intracellulare di calcio, sia nella testa dello spermatozoo che nel lum cloruro di manganese viene utilizzato per ridurre l'influenza.

In questa figura sono mostrate le tracce di fluorescenza normalizzate rappresentative delle 3:00 AM di nove singole cellule dell'esperimento. Come osservato negli esperimenti di popolazione, l'analisi di singole cellule ha rivelato un aumento transitorio e sostenuto rispettivamente del progesterone e della micina ionica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di verificare la vitalità delle cellule e di eseguire i controlli appropriati Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'elettrofisiologia, potrebbero essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come l'identificazione di specifici canali ionici coinvolti nell'aumento del calcio, utilizzando soluzioni di proppe e protocolli di simulazione dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia cellulare per esplorare la dinamica del calcio nelle cellule viventi con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare la tecnica più appropriata per misurare gli aumenti di calcio intracellulari utilizzando la luce fluorescente in qualsiasi tipo di cellula, a seconda della domanda specifica a cui desideri rispondere. Non dimenticare che lavorare con campioni di siemen umani può essere pericoloso e precauzioni come l'uso di donatori di provata salute. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare sempre globi di lattice durante la procedura e lo smaltimento appropriato della soluzione e dei materiali.