Misurare intracellulare Ca

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le fluttuazioni intracellulari di calcio negli spermatozoi umani mediante l'utilizzo di coloranti fluorescenti. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando il campione di spermatozoi con il metodo dello swim up e, se necessario, inducendo la capacitazione. Il secondo passaggio consiste nel caricare gli spermatozoi con un colorante fluorescente per il calcio.

Successivamente, utilizzando fluorimetria convenzionale, fluorimetria in flusso arrestato, citometria a flusso o imaging a singola cellula, eseguire l'esperimento e registrare le misurazioni del calcio. Infine, i risultati vengono analizzati per determinare le variazioni delle concentrazioni intracellulari di calcio indotte dal progesterone o durante il processo di capacITazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che implicano l'uso di radioattività, è che si tratta di una procedura molto sensibile.

È sicuro ed è facile da eseguire. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della segnalazione calcica SPR, come l'identificazione di composti che inducono l'aumento del calcio intracellulare con elevata risoluzione spaziale e temporale, e l'identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari in un campione di sperma. Le implicazioni derivanti dall'uso, ad esempio, della tecnica di citometria a flusso si estendono verso la diagnosi di problemi di fertilità attraverso l'analisi dello stato fisiologico dei gameti maschili.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per lo studio della mobilitazione del calcio negli spermatozoi umani, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule, come gameti maschili di altre specie o diversi tipi cellulari quali neuroni o cellule muscolari. In generale, chi utilizza questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché la manipolazione degli spermatozoi non è semplice e risulta fondamentale mantenere condizioni adeguate per ottenere cellule vitali e mobili durante l'esperimento. Abbiamo implementato l'utilizzo di queste tecniche combinando strategie che sfruttano diversi campi.

La dimostrazione visiva di questo metodo è importante poiché la preparazione e la manipolazione del campione, così come l'aggiunta dei composti, sono difficili da apprendere perché le cellule spermatiche possono subire danni durante la procedura e possono verificarsi artefatti nelle risposte durante la somministrazione dei composti. Per preparare il campione spermatico, è necessario stratificare con attenzione un millilitro di mezzo hams F 10 sopra ciascun campione di 500 microlitri di sperma liquefatto. Eloqua, toccare la parete del tubo con la punta della micropipetta ed erogare delicatamente il mezzo al di sopra del campione.

È fondamentale eseguire l'operazione lentamente per evitare di mescolare i livelli del campione e del mezzo. Il mezzo è integrato con cloruro di calcio due millimolare e BSA cinque milligrammi per millilitro. Per favorire la capacitazione in vitro, inclinare con attenzione i tubi a un angolo di circa 30 gradi.

Questo aumenterà la superficie di contatto tra i due liquidi, potenziando così lo spostamento o la risalita delle cellule spermatiche dal campione al mezzo durante l'incubazione. Successivamente, posizionare le provette inclinate in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, 95% di aria, per un'ora. Dopo un'ora.

Utilizzare una pipetta micrometrica per rimuovere con attenzione da ogni provetta i 700 microlitri superiori del mezzo Ham's F10, che ora contiene spermatozoi mobili. Riunire tutti i campioni raccolti in un singolo tubo di vetro pulito, evitando la formazione di bolle. Applicare 10 microlitri del campione combinato sulla lastra di vetro ottica della camera di conta per macchie e posizionare il vetrino coprioggetto.

Assicurarsi di evitare la formazione di bolle all'interno della camera, poiché ciò porterebbe a un conteggio cellulare inaccurato. Osservare al microscopio composto dotato di obiettivo 20 x. Il vetrino coprioggetto della camera di conteggio maculare presenta un quadrato grande composto da 100 quadratini più piccoli.

Contare le cellule in qualsiasi striscia di 10 quadrati. Questo numero rappresenta la concentrazione cellulare in milioni di cellule per millilitro. Ripetere il conteggio in altre due strisce di 10 quadrati e calcolare la media dei tre conteggi per caricare le cellule con un colorante fluorescente.

Unire in una provetta da 1,5 millilitri, il volume richiesto di sospensione di spermatozoi con una quantità sufficiente di soluzione madre di flu oh 3:00 AM a un millimolare per ottenere una concentrazione finale di due micromolare di flu oh 3:00 AM. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius, proteggendo dalla luce. Centrifugare la provetta a 750 G per cinque minuti. La formazione di un turbino anziché di un pellet indica che le cellule sono in buone condizioni. Aspirare e scartare il sopranatante e risospendere il pellet nel volume appropriato di mezzo per spermatozoi umani o HSM. Per iniziare questo esperimento, unire in una provetta di vetro con fondo piatto, 570 microlitri di HSM e 30 microlitri di sospensione di cellule spermatiche precedentemente caricate con flu oh 3:00 AM e risospese in HSM, per ottenere un valore di uno per 10 alla ottava cellule per millilitro.

Posizionare un agitatore magnetico all'interno del tubo di vetro ed inserire il tubo nella camera di lettura dello spettrometro preriscaldato a 37 gradi Celsius. Il campione deve essere agitato per tutta la durata del tempo di acquisizione. Avviare l'esperimento utilizzando il software oli e procedere ad acquisire i valori di fluorescenza con una frequenza di 0,5 hertz per 300 secondi.

Dopo aver acquisito la fluorescenza di base per 30 secondi, utilizzare una siringa micro Hamilton per iniettare il volume appropriato del composto in esame, in questo caso progesterone micromolare al secondo 100. Aggiungere 20 micromolare di ionomicina come controllo positivo per ottenere il valore massimo di fluorescenza. In questo esperimento, le variazioni di calcio intracellulare vengono misurate con elevata risoluzione temporale.

Utilizzando un miscelatore a flusso arrestato SFM 20 abbinato a un sistema ottico per cinetiche rapide, riempire una delle siringhe dello strumento con un millilitro di cellule spermatiche caricate con flu. 3:00 AM e la seconda siringa con un millilitro del composto da testare. 20 micromolare di progesterone disciolto in HSM.

In questo esempio, è fondamentale evitare la formazione di bolle durante il prelievo dei liquidi nelle siringhe. Sollevare entrambi i pistoni dello strumento finché non toccano l'estremità delle stantuffi delle siringhe. Impostare in questo caso il tempo totale di campionamento a 50 secondi e la frequenza a 10 millisecondi al fine di minimizzare il danno cellulare; impostare la portata al valore minimo che garantisca un trigger di risposta misurabile.

Il mescolamento dei reagenti e l'andamento della fluorescenza grezza in funzione del tempo verranno visualizzati sullo schermo del computer. Ripetere questa procedura sostituendo la progesterone con HSM come controllo negativo e l'ionomicina 10 micromolare come controllo positivo prima della citometria a flusso. Preparare i campioni sperimentali mettendo 500 microlitri di sospensione cellulare per tubo citometrico in ciascuna condizione da testare.

Impostare un esperimento utilizzando il software dell'apparecchiatura. Innanzitutto, creare una nuova cartella, un campione sperimentale e il numero di provette. Quindi selezionare le impostazioni appropriate del citometro per flu O 3:00 AM. Utilizzare i filtri per l'isotiocianato di fluoresceina e l'ioduro di propidio.

Eseguire i tubi di controllo non colorati uno e due nel citometro. Raccogliere i dati di scattering anteriore e laterale per verificare che le impostazioni della soglia siano appropriate e per creare il relativo cancello al fine di discriminare i detriti dalle cellule. Eseguire i tubi sperimentali e raccogliere i dati di fluorescenza da 10.000 eventi per campione.

Alla fine. Esportare tutti i dati nel software disponibile per l'analisi. Preparare i tondini copri-vetrino necessari per questa procedura applicando una goccia di cinque microlitri di soluzione di poli-L-lisina al centro di ciascun tondino.

Lasciare riposare per almeno un'ora prima dell'uso, quindi risciacquare l'area trattata con acqua. Questo passaggio rimuoverà l'eccesso di polilisina e permetterà alle cellule spermatiche di aderire al vetrino dalla testa, mentre i loro flagelli potranno ancora muoversi. Montare il vetrino all'interno della camera di registrazione.

Posizionare 10 µL di cellule caricate con flu oh 3:00 AM a una concentrazione di 1 × 10⁷ cellule/mL al centro del vetrino. Coprire le cellule con 200 µL di HSM preriscaldato.

Posizionare la camera sul palchetto del microscopio, preriscaldato a 37 gradi Celsius, e osservare le cellule utilizzando il contrasto di fase. Selezionare un'area in cui la densità cellulare sia appropriata per l'acquisizione delle immagini. Un numero eccessivo di cellule rende difficile l'analisi a causa del sovrapporsi dei segnali.

Le cellule devono essere saldamente attaccate al vetrino coprioggetto tramite la testa, ma devono mostrare movimento dei flagelli, il che conferma la vitalità. Avviare l'esperimento attivando il software di acquisizione delle immagini in serie temporale. Solitamente sono richieste quattro immagini al secondo con un'illuminazione di due millisecondi per immagine.

Acquisire immagini a fluorescenza in modalità live. Regolare messa a fuoco e luminosità. Utilizzare una pipetta micrometrica per aggiungere con attenzione, goccia a goccia, il composto in esame – nel presente caso progesterone – e continuare l'acquisizione delle immagini secondo necessità.

Eseguire due aggiunte di controllo sequenziali nella stessa camera: 20 micromolare di ionomicina per ottenere la fluorescenza massima e 5 millimolare di cloruro di manganese per ottenere la fluorescenza minima. Eseguire l'analisi delle immagini in modalità offline utilizzando il software IQ.

Delimitare le regioni di interesse (ROI) attorno a ogni cellula o parte di una cellula. Inoltre, selezionare un'area priva di cellule per la sottrazione automatica dello sfondo da parte del software. Viene quindi ottenuta una serie temporale dell'intensità di fluorescenza per ciascun ROI e questi dati possono essere esportati in Microsoft Excel per ulteriori analisi.

Il progesterone è uno dei noti induttori della reazione acrosomiale e, come previsto, provoca un aumento transitorio della concentrazione intracellulare di calcio negli spermatozoi umani, misurato mediante fluorimetria convenzionale. L'andamento della fluorescenza rossa nel tempo mostra le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio causate dall'aggiunta di quattro micromolar di progesterone; come controllo negativo è stato aggiunto HSM, che non ha causato alcuna variazione nei livelli di concentrazione intracellulare di calcio, come indicato dall'andamento della fluorescenza blu. Per ciascun andamento è mostrata la variazione indotta da 10 micromolar di ionomicina.

L'aggiunta di questo ionoforo del calcio determina l'aumento massimo della concentrazione cellulare di calcio, che non ritorna ai livelli basali. Questo istogramma mostra la variazione media della fluorescenza delta F per ciascuna condizione, più o meno l'errore standard, dove N è uguale a tre e l'asterisco indica un valore di P inferiore a 0,001 rispetto al controllo. L'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dalla progesterone è stato misurato con una risoluzione temporale maggiore mediante fluorimetria in flusso arrestato, e qui vengono mostrati risultati rappresentativi.

I tracciati grezzi sono mostrati nel pannello A: sia il progesterone, rappresentato dalla linea rossa, sia l'ionomicina, rappresentata dalla linea blu, hanno causato un rapido aumento della concentrazione intracellulare di calcio. Il tracciato verde è il controllo negativo in cui le cellule sono state mescolate con HSM. Il pannello B mostra i tracciati corretti per i segnali indotti da progesterone o da ionomicina, ottenuti sottraendo il segnale di controllo dai rispettivi segnali grezzi.

Il progesterone ha causato un aumento molto rapido e transitorio della concentrazione intracellulare di calcio, con un valore massimo di fluorescenza raggiunto 2,7 secondi dopo l'aggiunta dell'induttore. D'altro canto, il CIN ha indotto un aumento rapido e sostenuto della concentrazione intracellulare di calcio per tutta la durata di 50 secondi. L'ingrandimento nel pannello B mostra una vista ampliata dei primi 500 millisecondi per ciascuna risposta.

L'assenza di un ritardo nell'aumento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal progesterone è in accordo con studi precedenti che suggeriscono come il progesterone attivi direttamente il canale del calcio cat spur senza segnalazione intermedia. La concentrazione intracellulare di calcio è stata inoltre misurata in spermatozoi umani capaci e non capaci mediante citometria a flusso. In questi grafici rappresentativi di scattering anteriore e laterale.

Le cellule capacitate sono in blu e le cellule non capacitate sono in rosso. Il gate selezionato è indicato con la linea blu e solo le cellule all'interno di quell'area sono state utilizzate per ulteriori analisi. Il pannello B mostra l'istogramma di fluorescenza nel canale Fitzy di spermatozoi non colorati, e il pannello D mostra l'istogramma di fluorescenza nel canale FZ di spermatozoi colorati con flu oh 3:00 AM come osservato nel pannello D. La distribuzione dei valori di fluorescenza per gli spermatozoi capaciti, rappresentata dal tracciato blu, è spostata verso valori più elevati rispetto a quella degli spermatozoi non capaciti, rappresentata dal tracciato rosso.

Il pannello C mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale PI di cellule non colorate e il pannello E mostra l'istogramma della fluorescenza nel canale PI di cellule morte. I valori di fluorescenza per ciascuna singola cellula possono essere osservati nei grafici a punti bidimensionali mostrati qui. Per le cellule non colorate e le cellule colorate in doppio con flu oh 3:00 AM e pi, la percentuale di cellule registrate in ciascun quadrante è indicata dal numero rosso.

È importante notare che il segnale derivante dalle cellule morte può essere eliminato. Infine, il cambiamento della concentrazione intracellulare di calcio indotto dal progesterone è stato misurato in singole cellule spermatiche mediante imaging; queste rappresentative immagini a pseudocolore mostrano cellule visualizzate all'inizio e dopo l'aggiunta di progesterone, CIN e cloruro di manganese. L'aggiunta di progesterone provoca un incremento della concentrazione intracellulare di calcio, sia nella testa dello spermatozoo che nel flagello; il cloruro di manganese viene utilizzato per ridurre la flu.

Alle 3:00 del mattino, fluorescenza mediante soppressione: in questa figura sono mostrati tracciati rappresentativi di fluorescenza normalizzata di nove singole cellule provenienti dall'esperimento. Come osservato negli esperimenti su popolazioni cellulari, l'analisi su singola cellula ha rivelato un aumento transitorio per la progesterone e un aumento sostenuto per l'ionomicina, rispettivamente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se effettuata correttamente.

Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di verificare la vitalità delle cellule ed eseguire i controlli appropriati dopo averla completata. Altri metodi, come l’elettrofisiologia, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio l’identificazione dei canali ionici specifici coinvolti nell’aumento del calcio, impiegando soluzioni adeguate e protocolli di simulazione dopo lo sviluppo della tecnica. Questa metodica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia cellulare per esplorare la dinamica del calcio in cellule vive con elevata risoluzione spaziale e temporale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare la tecnica più appropriata per misurare l'aumento del calcio intracellulare mediante l'uso di coloranti fluorescenti in qualsiasi tipo di cellula, a seconda della domanda specifica che desideri affrontare. Ricorda che lavorare con campioni di sperma umano può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni come l'uso di donatori con stato di salute verificato. L'utilizzo di guanti in lattice durante la procedura e lo smaltimento adeguato di soluzioni e materiali devono sempre essere osservati durante l'esecuzione di questa procedura.