Consegna di anticorpi nel cervello utilizzando ultrasuoni a scansione focalizzata
18 luglio 2020
Qui viene presentato un protocollo per aprire transitoriamente la barriera emato-encefalica (BBB) sia focalmente che attraverso un cervello di topo per fornire anticorpi marcati fluorescentemente e attivare la microglia. Viene inoltre presentato un metodo per rilevare la somministrazione di anticorpi e l'attivazione della microglia mediante istologia.
Solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici viene assorbita dal cervello. Utilizzando il nostro metodo, gli anticorpi vengono erogati nel cervello aprendo transitoriamente la barriera emato-encefalica. Questa tecnica ci consente di somministrare anticorpi nel cervello del topo in modo non invasivo.
Per eseguire il controllo di qualità delle microbolle utilizzando un contacapsule, rimuovere la soluzione di microbolle dall'amalgamatore e utilizzare un ago da 19 gauge per perforare il setto del flaconcino della soluzione di microbolle. Utilizzare una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 19 per diluire 100 microlitri di microbolle in cinque millilitri di soluzione filtrata e pipettare 100 microlitri della soluzione diluita di microbolle in 10 millilitri di soluzione filtrata in una cuvetta. Bloccare la cuvetta in posizione sulla piattaforma del contatore di cellule e assicurarsi che venga utilizzata un'apertura di 30 micron per l'acquisizione del campione.
Nel software, caricare il metodo operativo standard e selezionare modifica metodo operativo standard e concentrazione. Immettere 5.000 volte per la diluizione e fare clic su applica e OK. Fai clic su modifica informazioni per selezionare un nome file adatto. Selezionare l'anteprima e verificare che la concentrazione del campione di microbolle sia inferiore al 10%Selezionare Avvia e OK per iniziare l'acquisizione del campione.
Dopo la misurazione, sciacquare l'apertura del contatore di celle con una soluzione di flusso filtrata. Sonicare la cuvetta di soluzione di microbolle diluita per 30 secondi a bagnomaria. Misurare la soluzione di microbolle sonicate come dimostrato e fare clic su modifica informazioni per etichettare i dati come vuoti.
Dopo aver misurato il grezzo, sottrarre la lettura finale dalla lettura iniziale per escludere eventuali particelle che non siano microbolle. Per etichettare le sezioni con anticorpi IgG fluorescenti anti-topo, etichettare un milligrammo di anticorpo IgG di topo con Alexa Flour 647 in tampone bicarbonato di sodio molare 0,1 molare secondo le istruzioni del produttore per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, caricare la soluzione di anticorpi marcata in fluorescenza su una colonna di centrifugazione e purificare l'anticorpo mediante centrifugazione.
Quindi utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione proteica. Per configurare il sistema a ultrasuoni a scansione focalizzata, aggiungere uno spazio di cinque millimetri al bolo d'acqua per posizionare il fuoco a ultrasuoni nove millimetri sotto il fondo del bolo d'acqua. Riempire il bolo d'acqua con circa 300 millilitri di acqua deionizzata degassata e posizionare l'array anulare nel bolo d'acqua riempito.
Utilizzare uno specchio dentale per verificare che non ci siano bolle d'aria sulla superficie e avviare il software applicativo. Nel menu della forma d'onda, selezionare imposta il ciclo di lavoro della forma d'onda e impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso su 10 Hertz, il ciclo di lavoro su 10%, la messa a fuoco su 80 millimetri, la frequenza centrale su un megahertz, l'ampiezza su 0,65 megapascal e l'indice meccanico su 0,65. Premere set per definire la forma d'onda e memorizzare la forma d'onda.
Dopo aver selezionato il piano di trattamento, aprire la scheda di scansione nella finestra del controller di movimento e immettere i valori di avvio, arresto e incremento per il movimento nella dimensione X e i valori di avvio, arresto e incremento per il movimento nella direzione Y. Per definire le azioni per i siti di trattamento, fare clic su evento e aprire la finestra di modifica dello script. Selezionare un elenco di azioni che verranno eseguite nell'ordine selezionato in ciascun sito di trattamento e impostare il tipo di movimento su griglia raster.
Nella scheda eventi, seleziona aggiungi azioni e sposta lo spostamento in modo sincrono, avvia il trigger ARB, attendi e arresta le azioni ARB nel pannello dello script. Quindi fare clic su Azione di attesa e selezionare un tempo di attesa di 6.000 millisecondi. Per preparare un animale per l'analisi, dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi in un topo anestetizzato, utilizzare un pennarello indelebile per etichettare il centro della testa, quindi incollare l'involucro di plastica sul fondo di una piccola pesa con il fondo tagliato e riempire la pesa con gel per ultrasuoni.
Per il trattamento a ultrasuoni focalizzati, capovolgere la fiala di microbolle e caricare delicatamente un microlitro di soluzione per grammo di peso corporeo del topo in una siringa da insulina calibro 29. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo marcato in fluorescenza alla siringa e capovolgere delicatamente e far rotolare la siringa tra il pollice e l'indice per mescolare l'anticorpo e le microbolle all'interno della siringa. Iniettare con cautela e lentamente per via retro-orbitale 150 microlitri di microbolla e soluzione anticorpale nel topo e impostare un timer per due minuti.
Applicare un unguento oftalmico, quindi posizionare il mouse nel supporto per la testa e fissare il naso nel supporto. Posizionare la piccola barca di pesatura riempita di gel per ultrasuoni sopra la testa e abbassare il bolo dell'acqua finché non si trova sopra il gel per ultrasuoni all'interno della barca di pesatura. Quindi utilizzare il joystick per allineare visivamente la messa a fuoco del trasduttore all'interno del centro della testa.
Quando il timer si spegne, nella scheda movimento del software, selezionare Ripristina origine e selezionare una scansione completa. Al termine del trattamento, applicare un unguento oftalmico sugli occhi dell'animale e posizionare il topo in una camera di recupero riscaldata. Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi delle misurazioni del contatore di coltura delle dimensioni e della concentrazione che possono essere ottenute quando le microbolle vengono prodotte correttamente.
L'assorbimento degli anticorpi da parte del cervello può essere facilmente visualizzato nell'intero cervello o nelle sezioni di tessuto utilizzando uno scanner a infrarossi o una microscopia a fluorescenza delle sezioni. Come dimostrato in queste immagini, la colorazione rappresentativa per i marcatori della microglia può essere utilizzata per determinare se le microglia diventano più fagocitiche dopo la somministrazione dell'anticorpo. È importante garantire il benessere e la sicurezza degli animali, soprattutto quando si eseguono le iniezioni retro-orbitali e si applica il trasduttore sopra le teste dei topi.
Questo metodo consente l'applicazione di vari modelli di scansione per colpire diverse regioni del cervello, come l'ippocampo, la corteccia o i singoli emisferi cerebrali. Questa tecnica può essere utilizzata per sviluppare nuove terapie e farmaci che penetrano la barriera emato-encefalica e per studiare il meccanismo di formazione e apertura della barriera emato-encefalica.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per aprire transitoriamente la barriera emato-encefalica (BBB) in modelli murini per facilitare la consegna di anticorpi marcati con fluorescenza e per attivare la microglia. Il metodo consente la consegna non invasiva e il monitoraggio dell'assorbimento degli anticorpi nel cervello attraverso tecniche istologiche.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Consegna terapeutica
Sfondo
- La barriera emato-encefalica limita l'assorbimento degli anticorpi terapeutici nel cervello.
- La microglia svolge un ruolo critico nelle risposte immunitarie del cervello.
- Le metodologie attuali per l'apertura della BBB e la consegna degli anticorpi sono limitate.
- La marcatura fluorescente aiuta la visualizzazione dell'assorbimento degli anticorpi e l'attivazione della microglia.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per aprire transitoriamente la BBB per la consegna degli anticorpi.
- Attivare la microglia in un ambiente sperimentale controllato.
- Valutare l'efficacia di questo metodo di consegna attraverso l'istologia.
Metodi utilizzati
- La metodologia coinvolge l'ultrasuono focalizzato e l'iniezione di microbolle nel cervello del topo.
- Il modello biologico principale utilizzato sono topi anestetizzati.
- I passaggi chiave includono la preparazione di microbolle e anticorpi, e un attento targeting degli ultrasuoni.
- Gli anticorpi fluorescenti vengono purificati e visualizzati per misurare l'interazione con le cellule microgliali.
Risultati principali
- La tecnica ha dimostrato con successo la consegna di anticorpi al cervello.
- La microglia ha mostrato un'attività fagocitica aumentata dopo la somministrazione degli anticorpi.
- Le tecniche di visualizzazione hanno confermato la localizzazione e l'assorbimento efficaci degli anticorpi.
- I modelli di scansione hanno permesso il targeting di specifiche regioni cerebrali, ampliando le potenziali applicazioni terapeutiche.
Conclusioni
- Questo studio fornisce un metodo affidabile per migliorare la consegna di anticorpi terapeutici attraverso la BBB.
- Aprirà strade per future ricerche nello sviluppo di farmaci e nella comprensione dei meccanismi cerebrali.
- I risultati evidenziano il potenziale di questo metodo nello studio delle interazioni neuroimmunologiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Focused scanning ultrasound (SUS) with microbubbles enables transient blood-brain barrier opening to enhance antibody delivery into the brain, addressing a key limitation in neurodegenerative disease therapeutics. This noninvasive approach improves target engagement and supports mechanistic de-risking by allowing quantitative assessment of antibody biodistribution and cellular uptake. The method provides predictive confidence in early discovery by validating brain penetration of antibody candidates before costly preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic antibody access to brain targets, supporting target validation in neurodegenerative disease models.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess antibody biodistribution and target engagement in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of antibody-delivered brain tissue for downstream histological and imaging assays.
- Operational Value: Standardizes delivery parameters to ensure consistent antibody exposure across experimental groups.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant antibody delivery to evaluate target modulation and pathway engagement in preclinical models.
- Operational Value: Enables region-specific delivery (e.g., hippocampus, cortex) to align with disease pathology and biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum by enabling early validation of antibody brain penetration, informing lead identification decisions, and supporting preclinical continuity through region-specific delivery and microglial activity readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody access to brain targets and pathway clarification via enhanced delivery.
- Screening: Delivers antibodies consistently to brain tissue, enabling reliable compound or target evaluation in vivo.
- Analytics: Provides quantitative readouts of antibody concentration in brain and microglial phagocytosis as a functional biomarker of engagement.
- Translational Research: Connects delivery efficiency to preclinical validation by enabling antibody access to disease-relevant brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing BBB permeability of diverse antibody formats across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antibody brain uptake, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible antibody exposure across studies through controlled ultrasound and microbubble parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early brain exposure data, reducing late-stage failure risk due to poor CNS penetration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antibody candidates based on validated brain delivery efficiency.
Implementation Considerations
- Expertise in ultrasound physics, microbubble handling, and in vivo imaging is required for accurate setup and execution.
- Instrumentation includes a focused ultrasound transducer, water bolus, microbubble preparation system, and fluorescence detection tools.
- Cross-team standardization is needed for ultrasound parameters (frequency, amplitude, duty cycle) and injection protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation across models requires adjustment of scanning patterns and ultrasound targeting to match brain anatomy and disease-relevant regions.
- Practical limitations include variability in BBB opening efficiency and the need for careful animal welfare monitoring during retro-orbital injection and transducer application.
