Apertura della barriera emato-encefalica indotta da ultrasuoni focalizzati per il targeting delle strutture cerebrali e la valutazione della neuromodulazione chemiogenetica

Questo protocollo delinea le fasi necessarie per la veicolazione genica attraverso l'apertura della barriera ematoencefalica (BBB) ad ultrasuoni focalizzati, la valutazione dell'espressione genica risultante e la misurazione dell'attività di neuromodulazione dei recettori chemiogenetici attraverso test istologici.

Il nostro protocollo consente il targeting di precisione submillimetrica degli ultrasuoni focalizzati nei topi. Ci consente di indirizzare gli ultrasuoni utilizzando parti stampate in 3D economiche senza la necessità di utilizzare apparecchiature chirurgiche o ecografiche compatibili con la risonanza magnetica. L'apertura della barriera emato-encefalica a ultrasuoni focalizzati può essere piuttosto complicata all'inizio.

È fondamentale che il trasduttore sia correttamente accoppiato all'animale utilizzando gel degassato o acqua e che le microbolle non collassino durante l'iniezione. A dimostrare la procedura sarà Richard Li, uno studente laureato al Caltech. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale in un topo anestetizzato, utilizzare 10 unità per millilitro di soluzione fisiologica eparinizzata per lavare un catetere pulito da 25 a 35 gauge e utilizzare un tampone di etanolo per disinfettare la coda dell'animale.

Inserire il catetere in una vena caudale laterale e utilizzare la colla per tessuti per fissare il catetere in posizione. Se l'ago è stato posizionato correttamente, si osserverà un riflusso di sangue nel catetere. Quando la colla si è asciugata, rimuovere i peli sulla testa dell'animale con una crema depilatoria e posizionare il mouse in un carrello per risonanza magnetica stampato in 3D, montando i denti anteriori su una barra per morsi con la testa all'interno di un cono nasale.

Fissare le barre smussate al cranio con una pressione di sicurezza e osservare la respirazione per 30 secondi per confermare che l'animale respiri liberamente al ritmo di un respiro al secondo. Collega la guida di puntamento alle barre auricolari e controlla nuovamente la respirazione. Posizionare il carrello per la risonanza magnetica in un supporto per risonanza magnetica e posizionare il supporto all'interno del foro di un magnete.

Quindi acquisisci una sequenza di risonanza magnetica per localizzare il topo nello scanner, utilizzando la sequenza di ripresa 3D veloce dal basso per visualizzare l'intero cervello. Per eseguire un puntamento guidato dalla risonanza magnetica, posizionare il carrello all'interno di uno strumento stereotassico e utilizzare un blocco metallico con nastro biadesivo per fissare il blocco in posizione contro due montanti di supporto dello strumento stereotassico. Trasferisci le immagini della risonanza magnetica su un computer con un programma software di guida a ultrasuoni focalizzati in esecuzione e apri le immagini.

Quando tutte le immagini sono state caricate, fare clic con il pulsante destro del mouse e fare clic su Riformatta per riformattare l'immagine su tre assi. Fare clic con il pulsante destro del mouse per localizzare il trasduttore sulla guida di puntamento circolare. Nella vista sagittale, regolare la posizione verticale del trasduttore virtuale per tenere conto dello spessore del bagno d'acqua e dell'alloggiamento del trasduttore.

Indicare le aree da mirare nel pianificatore di traiettorie e annotare le coordinate in un foglio di calcolo. Componi la profondità di puntamento desiderata e annota le coordinate come mostrato in precedenza. Quindi fare clic su Invia traiettoria ed eseguire per puntare ciascuno dei punti.

Per correlare le coordinate di una risonanza magnetica con il telaio stereotassico, posizionare il trasduttore montato su misura su una guida di puntamento e traslare fino a quando ciascuno dei tre bulloni di puntamento può passare attraverso sia il supporto del trasduttore che la guida di puntamento. Verificare che i bulloni non siano in tensione o inclinati e traslare il trasduttore di 10,56 millimetri in avanti in direzione antero-posteriore fino a quando il trasduttore non si trova nel punto in cui appare il centro di una guida di puntamento sulla risonanza magnetica. Quindi determinare la distanza dal centro del trasduttore virtuale alla regione di destinazione e utilizzare il frame per spostare il trasduttore su queste coordinate.

Per preparare la soluzione iniettabile, caricare 800 microlitri di soluzione fisiologica e 100 microlitri di mezzo di contrasto per risonanza magnetica in una provetta da 1,5 millilitri con miscelazione. Quindi, portare una soluzione di microbolle non attivata a temperatura ambiente, prima di attivare le microbolle per 45 secondi in un dispositivo di attivazione delle microbolle. Dopo l'attivazione, caricare lentamente 100 microlitri di microbolle dal centro della soluzione in una siringa tubercolina da un millilitro dotata di un ago calibro 21 e aggiungere 80 microlitri di microbolle nella soluzione di agente di contrasto.

Mescolare la soluzione preparata capovolgendo delicatamente il tubo da 1,5 millilitri per 15 secondi per evitare il galleggiamento. Al termine della miscelazione, caricare 200 microlitri di soluzione di microbolle in una siringa senza ago e capovolgere la siringa. Premere e ritrarre lo stantuffo per mescolare e collegare un ago calibro 30 alla siringa mentre è ancora capovolta.

Quindi spingere lentamente fuori la soluzione di microbolle fino a quando non compaiono goccioline all'estremità dell'ago. Non appena le microbolle sono pronte, impostare la durata dell'impulso per l'insonazione a 10 millisecondi, con 120 ripetizioni al secondo, con una pressione da 0,3 a 0,45 mega pascal al cranio. Rimuovere la guida di puntamento e applicare il gel per ultrasuoni degassato sulla testa del mouse, facendo attenzione a evitare bolle.

Abbassare il trasduttore fino a posizionarlo direttamente sulla parte piatta del supporto della barra auricolare e comporre le coordinate negli strumenti stereotassici. Diluire il virus adeno-associato di interesse a una concentrazione di 0,5-2 volte 10-10 per grammo di peso corporeo e caricare le particelle virali in una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 30. Iniettare la soluzione nel catetere della vena caudale e iniettare 80 microlitri della soluzione di microbolle nel topo.

Per valutare l'apertura della barriera emato-encefalica mediante risonanza magnetica, registrare una sequenza di ripresa veloce dal basso come dimostrato. Per la stimolazione DREADD, sciogliere l'N-ossido di clozapina in soluzione fisiologica sterile a una concentrazione di un milligrammo per millilitro e iniettarlo per via intraperitoneale. Da 15 a 45 minuti dopo il parto, iniziare a registrare l'attività comportamentale dell'animale.

Per l'analisi dell'attivazione neuronale, utilizzare il tessuto cerebrale. Seguendo il protocollo dimostrato, è possibile ottenere un potenziamento del segnale T1 nella regione dell'ippocampo e in altre parti del cervello. Come osservato, l'immunocolorazione contro mCherry porta a una rilevazione più affidabile dell'espressione di DREADD In questa procedura, ricordarsi di maneggiare delicatamente le microbolle e di assicurarsi che l'animale sia stabile durante l'imaging MRI e l'insonazione.