Name: Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per lapertura della barriera ematico-encefalica nei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Scopri come aprire la barriera emato-encefalica nei roditori con ultrasuoni focalizzati guidati da neuro-navigazione stereotattica. Questo metodo automatizzato facilita la somministrazione di farmaci per studi preclinici sui gliomi.

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Questo progetto è stato finanziato dal KWF-STW (Drug Delivery by Sonoporation in Childhood Diffuse Intrinsic Pontine Glioma e High-grade Glioma). Ringraziamo Ilya Skachkov e Charles Mougenot per il loro contributo allo sviluppo del sistema.

Tutti gli esperimenti in vivo sono stati approvati dal comitato etico olandese (numero di permesso di licenza AVD114002017841) e dall'Organismo per il benessere degli animali della Vrije Universiteit Amsterdam, paesi Bassi. Gli investigatori sono stati addestrati alle basi del sistema FUS al fine di ridurre al minimo il disagio degli animali.
1. Sistema ecografico focalizzato
NOTA: La configurazione descritta è un sistema di interruzione BBB integrato basato su componenti disponibili in commercio e include un cono stampato su misura stampato in 3D e una piattaforma stereotassica rimovibile. Il sistema è progettato modulare, il che facilita le modifiche in base alle attrezzature disponibili e all'uso specifico. Il protocollo descrive la procedura per la sonoporazione di un'area più ampia nella regione pontina del cervello del topo. Regolando la posizione del bersaglio, diverse parti del cervello potrebbero essere prese di mira. In questo studio è stato utilizzato un trasduttore mono-elemento a 1 MHz con una lunghezza focale di 75 mm, un'apertura di 60 mm e un'area focale di 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM di pressione di picco). Il piano focale del trasduttore è posizionato attraverso il cranio dell'animale nel piano orizzontale che si interseca con le barre dell'orecchio.
<ol><li>Selezionare un trasduttore appropriato per l'apertura della BBB nei roditori. NOTA: In base alle proprietà delle microbolle e alla frequenza impiegata, le impostazioni acustiche, in particolare l'indice meccanico (MI), sono soggette amodifiche 13,38.</li>
	<li>Posizionare il trasduttore nel cono stampato in 3D.</li>
	<li>Utilizzare una membrana milare acusticamente trasparente all'estremità inferiore del cono per ottenere l'accoppiamento acustico del percorso di propagazione del fascio e riempire il cono con acqua degassata.</li>
	<li>Montare il trasduttore sopra l'animale su uno stadio lineare motorizzato, come mostrato nella figura 1, consentendo il posizionamento verticale automatico del trasduttore.</li>
	<li>Progettare una piattaforma stereotassica rimovibile basata sui requisiti dello studio, che includa riscaldamento regolato dalla temperatura, mordente e auricolari, anestesia e marcatori fiduciari multimodalità, come mostrato nella figura 1 e nella figura 2. Il montaggio della piattaforma stereotassiva è costituito da un sistema di stadio lineare 2D, che consente un posizionamento automatico preciso (< 0,1 mm) dell'animale sotto il fascio.</li>
	<li>Collegare il trasduttore alla catena di emissione acustica mostrata nella figura 1 costituita da un trasduttore, un generatore di funzioni e un amplificatore di potenza.</li>
	<li>Ideare una pipeline di elaborazione delle immagini per rilevare i marcatori fiduciari multimodalità che consenta un targeting preciso della sonoporazione dell'area cerebrale di interesse e la raccolta dei dati di cavitazione rilevati dall'idrofono dell'ago.</li>
	<li>Calibrare il sistema e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore in corrispondenza del posizionamento verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica.</li>
</ol>2. Preparazione animale
NOTA: Il seguente protocollo è specificato per i topi ma può essere adattato per i ratti. Per questi esperimenti sono stati utilizzati topi Foxn1-/- nudi atimici (6-8 settimane).
<ol><li>Consentire all'animale di acclimatarsi per almeno una settimana nella struttura animale e pesare regolarmente l'animale.</li>
	<li>Somministrare buprenorfina (0,05 mg/kg) tramite iniezione sottocutanea (s.c.) 30 minuti prima del trattamento FUS per iniziare il trattamento analgesico.</li>
	<li>Anestetizza l'animale con il 3% di isoflurane, 2 L/min O2 e verifica che l'animale sia profondamente anestetizzato. Mantenere gli animali anestetizzati durante l'intera procedura e monitorare la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca per regolare la concentrazione di isoflurane in base alle esigenze.</li>
	<li>Applicare unguento per gli occhi per prevenire gli occhi asciutti ed evitare possibili lesioni.</li>
	<li>Rimuovere i capelli sulla parte superiore della testa con un rasoio e una crema depilatoria e lavare successivamente con acqua per rimuovere eventuali residui per evitare irritazioni alla pelle.</li>
	<li>Per esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 μL di D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneale (i.p.) con una siringa per insulina da 29 G per la guida dell'immagine BLI.</li>
	<li>Inserire un catetere della vena di coda da 26-30 G e sciacquare il catetere e la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina (5 UI/mL). Riempire il catetere con soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue. NOTA: Una buona cateterizzazione si vede quando c'è un reflusso di sangue nel catetere. Evitare bolle d'aria nel catetere per prevenire gli emboli. Per evitare un'eccessiva pressione di iniezione, assicurarsi che la lunghezza del catetere sia il più breve possibile.</li>
	<li>Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotattica regolata dalla temperatura per evitare l'ipotermia. NOTA: L'ipotermia riduce la circolazione sanguigna, che può influenzare l'iniezione / circolazione di microbolle e la farmacocinetica dei farmaci39.</li>
	<li>Immobilizzare e fissare la testa dell'animale sulla piattaforma stereotassiva usando le barre dell'orecchio e una barra del morso. Fissare il corpo con una cinghia e rastremare la coda dell'animale sulla piattaforma.</li>
</ol>3. Ultrasuoni in vivo focalizzati sull'immagine
NOTA: Per questo protocollo è stato utilizzato un trasduttore mono-elemento a 1 MHz con un impulso di scoppio di tono con una durata di 10 ms, un MI di 0,4 e una frequenza di ripetizione dell'impulso di 1,6 Hz con 40 cicli per 240 s. Il protocollo è ottimizzato per le microbolle stabilizzate da fosfolipidi contenenti esafluoruro di zolfo (SF6)come gas innocuo, per cui il diametro medio della bolla è di 2,5 μm e più del 90% delle bolle sono più piccole di 8 μm.
<ol><li>Posizionare la piattaforma stereotassica con l'animale montato nella modalità di imaging (adesempio, BLI o raggi X) e scattare l'immagine o le immagini dell'animale.</li>
	<li>Utilizzare i marcatori fiduciari multimodalità in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini per contrassegnare la posizione dell'animale in base al punto di messa a fuoco del trasduttore.</li>
	<li>Determinare l'area di destinazione posizionando un contorno cerebrale sull'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore (Figura 2). La posizione di parti specifiche del cervello è specificata nel Paxinos Brain Atlas40 usando i segni del cranio bregma e lambda come punti di riferimento. Ad esempio, i pons si trovano x=-1.0, y=-0.8 e z=-4.5 da lambda.</li>
	<li>Proteggi le narici e la bocca dell'animale con nastro adesivo per evitare che il gel ad ultrasuoni interferisca con la respirazione.</li>
	<li>Applicare il gel ad ultrasuoni sopra la testa dell'animale.</li>
	<li>Ritrarre la pelle del collo degli animali, lubrificare l'idrofono dell'ago con gel ad ultrasuoni e posizionare l'idrofono dell'ago nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale.</li>
	<li>Guida il trasduttore nella posizione corretta utilizzando la tubazione di elaborazione delle immagini e il punto di messa a fuoco.</li>
	<li>Applicare le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati e indirizzare l'area cerebrale di interesse. NOTA: A seconda della domanda di ricerca, le regioni tumorali o cerebrali possono essere sonoporate come un singolo punto focale o come forma volumetrica, come mostrato nella figura 2.</li>
	<li>Attivare le microbolle come descritto dal produttore. Iniettare un bolo di 120 μL (5,4 μg) di microbolle.</li>
	<li>Lavare il catetere della vena di coda con soluzione salina per controllare l'apertura del catetere.</li>
	<li>Iniettare le microbolle e iniziare l'insonation.</li>
	<li>Registrare la cavitazione delle microbolle con l'idrofono dell'ago.</li>
	<li>Somministrare un agente di contrasto intravascolare o un farmaco dopo la sonoporazione. La dose, i tempi e la pianificazione dipendono dallo scopo dello studio e dal farmaco. NOTA: Evans blue è un agente di colore comune per valutare l'apertura BBB41.</li>
	<li>Monitorare l'animale fino al punto di tempo predeterminato o prima dell'endpoint umano.</li>
</ol>4. Analisi della cavitazione delle microbolle
NOTA: Qui viene descritta la procedura applicata, che è adatta per la sperimentazione in vivo di microbolle SF6-fosfolipidi con un diametro medio di 2,5 μm (80% delle bolle inferiori a 8 μm) eccitate con un impulso di tono burst di 10 ms di durata ad una frequenza di 1 MHz, come originariamente suggerito da McDannold etal.
<ol><li>Trasformazione di Fourier del segnale PCD registrato dal dominio del tempo nel dominio della frequenza.</li>
	<li>Integrare la potenza spettrale risultante per il rilevamento della cavitazione stabile intornoall'armonica 2 ° e 3rd (± 50 kHz), come mostrato nella figura 3 (scatola verde a 2 e 3 MHz).</li>
	<li>Integrare la potenza spettrale peril rilevamento della cavitazione inerziale, tra la frequenza principale, la2a, 3aarmonica, la 1a e la seconda ultraarmonica e la prima sub-armonica (± 150 kHz), come mostrato nella figura 3 (caselle rosse).</li>
	<li>Integrare la potenza spettrale attorno alla frequenza principale (1 MHz ± 50 kHz) per la normalizzazione di entrambi i segnali PCD precedentemente ottenuti. NOTA: Il segnale PCD, per microbolle SF6-fosfolipidiche in esperimenti in vivo a 1 MHz, non visualizza ultraarmonici o sottoarmonici prima che la cavitazione inerziale si insepol, come mostrato nella figura 3.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo sviluppato un sistema FUS basato su immagini economico per interruzioni transitorie della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema è stato in gran parte costruito con componenti disponibili in commercio e in combinazione con raggi X e BLI. La modularità del progetto proposto consente l'utilizzo di diverse modalità di imaging per la pianificazione e la valutazione in flussi di lavoro ad alta produttività. Il sistema può essere combinato con modalità di imaging ...

La barriera ematica-encefalica (BBB) è un grosso ostacolo per il somministrazione di farmaci nel parenchima cerebrale. La maggior parte dei farmaci terapeutici che sono stati sviluppati non attraversano la BBB a causa dei loro parametri fisicochimici (ad esempio, lipofilia, peso molecolare, accettori di legami idrogeno e donatori) o non vengono mantenuti a causa della loro affinità per i trasportatori di efflux nelcervello 1,2. Il piccolo gruppo di farmaci che possono attraversare la BBB sono tipicamente piccole molecole lipofile, che sono efficaci solo in un numero limitato di malattiecerebrali 1,2. Di conseguenza, per la maggior parte delle malattie cerebrali, le opzioni di trattamento farmacologico sono limitate e sono necessarie nuove strategie disomministrazione dei farmaci 3,4.
L'ecografia terapeutica è una tecnica emergente che può essere utilizzata per diverse applicazioni neurologiche come l'interruzione della BBB (BBBD), la neuromodulazione e l'ablazione4,5,6,7. Al fine di ottenere un'apertura BBB con un emettitore ad ultrasuoni extracorporeo attraverso il cranio, gli ultrasuoni focalizzati (FUS) sono combinati con microbolle. Il FUS mediato da microbolle si traduce in una maggiore biodisponibilità di farmaci nel parenchimacerebrale 5,8,9. In presenza di onde sonore, le microbolle iniziano a oscillare iniziando la tracitosi e l'interruzione delle giunzioni strette tra le cellule endoteliali della BBB, consentendo il trasporto paracellulare di molecole piùgrandi 10. Studi precedenti hanno confermato la correlazione tra l'intensità dell'emissione acustica e l'impatto biologico sull'apertura della BBB11,12,13,14. FUS in combinazione con microbolle è già stato utilizzato in studi clinici per il trattamento del glioblastoma utilizzando temozolomide o doxorubicina liposomiale come agente chemioterapico, o per la terapia del morbo di Alzheimer e sclerosi laterale amiotrofica5,9,15,16.
Poiché l'apertura della BBB mediata da ultrasuoni si traduce in possibilità completamente nuove per la farmacoterapia, è necessaria una ricerca preclinica per la traduzione clinica per valutare la risposta terapeutica di candidati selezionati. Ciò richiede in genere un flusso di lavoro ad alta produttività con precisione sia spaziale elevata che preferibilmente un rilevamento di cavitazione integrato per il monitoraggio dell'apertura BBB mirata con un'elevata riproducibilità. Se possibile, questi sistemi devono essere convenienti sia per gli investimenti iniziali che per i costi di gestione per essere scalabili in base alle dimensioni dello studio. La maggior parte dei sistemi FUS preclinici sono combinati con la risonanza prima della mento per la guida delle immagini e lapianificazione del trattamento 15,17,18,19. Sebbene la risonanza tura dia informazioni dettagliate sull'anatomia e sul volume del tumore, è una tecnica costosa, che viene generalmente eseguita da operatori addestrati / qualificati. Inoltre, la risonanza prima o poi ad alta risoluzione potrebbe non essere sempre disponibile per i ricercatori in strutture precliniche e richiede lunghi tempi di scansione per animale, rendendola meno adatta per studi farmacologici ad alta produttività. Degno di nota è che, per la ricerca preclinica nel campo della neuro-oncologia, in particolare dei modelli tumorali infiltrativi, la possibilità di visualizzare e indirizzare il tumore è essenziale per il successodel trattamento 20. Attualmente, questo requisito è soddisfatto solo dalla risonanza magnetica o da tumori trasdotti con una fotoproteina, consentendo la visualizzazione con imaging a bioluminescenza (BLI) in combinazione con la somministrazione del substrato di fotoproteina.
I sistemi FUS guidati dalla risonanza 10 utilizzano spesso un bagno d'acqua per garantire la propagazione delle onde ultrasoniche per applicazioni transcranici, in cui la testa dell'animale è parzialmente sommersa nell'acqua, i cosiddetti sistemi "bottom-up"15,17,18. Mentre questi progetti funzionano generalmente bene negli studi sugli animali più piccoli, sono un compromesso tra tempi di preparazione degli animali, portabilità e standard igienici realisticamente manutenibili durante l'uso. In alternativa alla risonanza valutazione, altri metodi di guida per la navigazione stereotassica comprendono l'uso di un atlante anatomico roditore21,22,23, avvistamento visivo assistito da puntatore laser24,dispositivo di scansione meccanica assistito da fori stenopeico25o BLI26. La maggior parte di questi disegni sono sistemi "top-down" in cui il trasduttore è posto sopra la testa dell'animale, con l'animale in posizione naturale. Il flusso di lavoro "dall'alto verso il basso" è costituito da un bagnod'acqua 22,25,26 o da un cono riempito d'acqua21,24. Il vantaggio dell'utilizzo di un trasduttore all'interno di un cono chiuso è l'ingombro più compatto, i tempi di configurazione più brevi e le possibilità di decontaminazione diretta semplificando l'intero flusso di lavoro.
L'interazione del campo acustico con le microbolle dipende dalla pressione e varia dalle oscillazioni a bassa ampiezza (indicate come cavitazione stabile) al collasso transitorio della bolla (indicato come cavitazione inerziale)27,28. Esiste un consenso consolidato sul fatto che l'ecografia-BBBD richiede una pressione acustica ben al di sopra della soglia di cavitazione stabile per ottenere un BBBD di successo, ma al di sotto della soglia di cavitazione inerziale, che è generalmente associata a danni vascolari /neuronali 29. La forma più comune di monitoraggio e controllo è l'analisi del segnale acustico (back-)scattered utilizzando il rilevamento passivo della cavitazione (PCD), come suggerito da McDannold etal. La PCD si basa sull'analisi degli spettri di Fourier dei segnali di emissione di microbolle, in cui la forza e l'aspetto dei tratti distintivi di cavitazione stabili (armoniche, sottoarmoniche e ultraarmoniche) e dei marcatori di cavitazione inerziale (risposta a banda larga) possono essere misurati in tempo reale.
Un'analisi PCD "one size fits all" per un controllo preciso della pressione è complicata a causa della polidispersità della formulazione di microbolle (l'ampiezza di oscillazione dipende fortemente dal diametro della bolla), dalle differenze nelle proprietà del guscio della bolla tra le marche e dall'oscillazione acustica, che dipende fortemente dallafrequenza e dalla pressione 30,31,32. Di conseguenza, sono stati suggeriti molti diversi protocolli di rilevamento PCD, che sono stati adattati a particolari combinazioni di tutti questi parametri e sono stati utilizzati in vari scenari applicativi (che vanno dalla sperimentazione in vitro su piccoli protocolli animali alla PCD per uso clinico) per il rilevamento robusto della cavitazione e persino per il controllo retroattivo del feedbackdella pressione 11,14,30,31,32,33,34,35. Il protocollo PCD utilizzato nell'ambito di questo studio è derivatodirettamente da McDannold et al.
Abbiamo sviluppato un sistema FUS di neuronavigation guidato da immagini per l'apertura transitoria della BBB per aumentare il consumo di farmaci nel parenchima cerebrale. Il sistema si basa su componenti disponibili in commercio e può essere facilmente adattato a diverse modalità di imaging, a seconda delle tecniche di imaging disponibili nella struttura animale. Poiché abbiamo bisogno di un flusso di lavoro ad alta produttività, abbiamo scelto di utilizzare raggi X e BLI per la guida delle immagini e la pianificazione del trattamento. Le cellule tumorali trasdute con una fotoproteina (ad esempio, luciferasi) sono adatte per l'imaging BLI20. Dopo la somministrazione del substrato di fotoproteina, le cellule tumorali possono essere monitorate in vivo e la crescita e la posizione del tumorepossono essere determinate 20,36. BLI è una modalità di imaging a basso costo, consente di seguire la crescita tumorale nel tempo, ha tempi di scansione rapidi e si correla bene con la crescita tumorale misurata con la risonanzamagnetica 36,37. Abbiamo optato per sostituire il bagno d'acqua con un cono pieno d'acqua attaccato al trasduttore per consentire flessibilità per spostare liberamente la piattaforma su cui èmontato il roditore 8,24. Il design si basa su una piattaforma rimovibile dotata di integrazione di (I) marcatori fiduciari della piattaforma stereotattica per piccoli animali (II) con compatibilità a raggi X e immagini ottiche (III) maschera di anestesia rapidamente rimovibile e (IV) sistema integrato di riscaldamento degli animali regolato dalla temperatura. Dopo l'induzione iniziale dell'anestesia, l'animale viene montato in una posizione precisa sulla piattaforma dove rimane durante l'intera procedura. Di conseguenza, l'intera piattaforma passa tutte le stazioni del flusso di lavoro dell'intero intervento, pur mantenendo un posizionamento accurato e riproducibile e un'anestesia sostenuta. Il software di controllo consente il rilevamento automatico dei marcatori fiduciari e registra automaticamente tutti i tipi di immagini e modalità di immagine (ad esempio, micro-CT, raggi X, BLI e imaging a fluorescenza) nel quadro di riferimento della piattaforma stereotassica. Con l'aiuto di una procedura di calibrazione automatica, la lunghezza focale del trasduttore ad ultrasuoni è precisamente nota all'interno, il che consente la fusione automatica della pianificazione interventiva, della consegna acustica e dell'analisi di imaging di follow-up. Come illustrato nella figura 1 e nella figura 2, questa configurazione offre un elevato grado di flessibilità per progettare flussi di lavoro sperimentali dedicati e consente la manipolazione interfogliata dell'animale in diverse stazioni, il che a sua volta facilita gli esperimenti ad alta produttività. Abbiamo usato questa tecnica per il successo della somministrazione di farmaci negli xenografti di topo di glioma di alta qualità come il glioma medioline diffuso.

<table><tbody><tr><td>Siringa luer-lock da 1 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>Ago da 19 G</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 23 G</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico transporoso 3M</td><td>Scienza applicata alla vita</td><td>7000032707</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Generatore di forme d'onda arbitrarie</td><td>Siglent</td><td>n.a.SDG1025</td><td>, 25 MHz, 125 Msa/s</td></tr><tr><td>Stereotatto automatizzato</td><td>costruito internamente</td><td>n.a.Stereotatto</td> <td>con tutti gli elementi sono stati costruiti internamente</td></tr><tr><td>Bruker In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>n.a.Include</td> <td>software</td></tr><tr><td>Soluzione NaCl tamponata</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine cloridrato</td><td>Indivior UK limitato</td><td>n.a.0.324</td> <td>mg</td></tr><tr><td>Arricchimento della gabbia: carta-pasta smart home</td><td>Bio services</td><td>n.a.Filtro</td><td></td></tr> <tr><td>a carbone</td><td>Bickford</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>Cucchiaio in ceramica</td> n.a.n.a.Cotton <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fioc</td> n.a.D-luciferina<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, sale di potassio</td><td>Oro Biotecnologia</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VUmc farmacia</td><td>n.a.70</td><td>%</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius NaCl 0,9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.NaCl</td> <td>0,9 %, 1000 mL</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>n.a.Histoacryl</td> <td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Hydrophone</td><td>Precision Acoustics</td><td>n.a.Siringa</td><td></td></tr> da <tr><td>insulina</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0,5 mL e 0,3 mL</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Alfasan</td><td>n.a.10</td> <td>%, 10 mL</td></tr><tr><td>Cibo per topi: Teklad global 18% protein dieta per roditori</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Catetere in neoflon</td><td>Becton Dickinson</td><td>391349</td><td>26 GA 0,6 x 19 mm</td></tr><tr><td>Oscilloscopio</td><td>Keysight technologies</td><td>n.a.InfiniiVision</td> <td>DSOX024A</td></tr><tr><td>Tubi in plastica</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Amplificatore di potenza</td><td>Elettronica & Innovation Ltd</td><td>210L</td><td>Modello 210L</td></tr><tr><td>Preamplificatore DC Coupler</td><td>Precision Acoustics</td><td>n..</td><td>Numero di serie: DCPS94</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>o similari</td></tr><tr><td>Sedazine</td><td>AST Farma</td><td>n.a.2</td><td>%</td></tr><tr><td>SonoVue microbolle</td><td>Bracco</td><td>n.a.8</td> <td>&; l/ml</td></tr><tr><td>Acqua sterile</td><td>Fresenius Kabi</td><td>n.a.1000</td> <td>mL</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>n.a.n.a.varie</td><td></td> <td>siringhe possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Indivior UK limitd</td><td>n.a.0.3</td> <td>mg/ml</td></tr><tr><td>Trasduttore</td><td>Acustica di precisione</td><td>n.a.1</td> <td>MHz</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>o simile</td></tr><tr><td>Gel per ultrasuoni</td><td>Laboratori Parker Inc.</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic gel</td><td>Bausch + Lomb</td><td>n.d.10</td> <td>g</td></tr></tbody></table>

un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

La barriera ematica-encefalica (BBB) è stato un grosso ostacolo per il trattamento di varie malattie cerebrali. Le cellule endoteliali, collegate da giunzioni strette, formano una barriera fisiologica che impedisce alle grandi molecole (>500 Da) di entrare nel tessuto cerebrale. Gli ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS) possono essere utilizzati per indurre un'apertura BBB locale transitoria, consentendo ai farmaci più grandi di entrare nel parenchima cerebrale.
Oltre ai dispositivi clinici su larga scala per la traduzione clinica, la ricerca preclinica per la valutazione della risposta terapeutica dei candidati ai farmaci richiede configurazioni dedicate di ultrasuoni per piccoli animali per un'apertura BBB mirata. Preferibilmente, questi sistemi consentono flussi di lavoro ad alta produttività con precisione spaziale elevata e monitoraggio integrato della cavitazione, pur essendo convenienti sia nell'investimento iniziale che nei costi di gestione.
Qui presentiamo un sistema FUS per piccoli animali stereotattico a bioluminescenza e a raggi X che si basa su componenti disponibili in commercio e soddisfa i suddetti requisiti. Un'enfasi particolare è stata posta su un elevato grado di automazione che facilita le sfide tipicamente incontrate negli studi preclinici di valutazione dei farmaci ad alto volume. Esempi di queste sfide sono la necessità di standardizzazione al fine di garantire la riproducibilità dei dati, ridurre la variabilità all'interno del gruppo, ridurre le dimensioni del campione e quindi rispettare i requisiti etici e ridurre il carico di lavoro non necessario. Il sistema BBB proposto è stato convalidato nell'ambito di BBB aprendo studi di somministrazione facilitata di farmaci su modelli di xenograft derivati dal paziente di glioblastoma multiforme e glioma medioline diffuso.

Il sistema FUS descritto (Figura 1 e Figura 2) e il flusso di lavoro associato sono stati utilizzati in oltre 100 animali e hanno prodotto dati riproducibili su topi sani e portanti di tumore. In base alla cavitazione registrata e alla densità spettrale alle armoniche nel momento di picco dell'iniezione di bolo di microbolle, la potenza spettrale di ogni frequenza può essere calcolata utilizzando l'analisi di Fourier come spiegato nella fase 4 del protocollo. Ba...

La barriera ematico-encefalica (BBB) può essere temporaneamente interrotta con ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS). Qui descriviamo un protocollo passo-passo per l'apertura BBB ad alta produttività in vivo utilizzando un sistema FUS modulare accessibile per esperti non ad ultrasuoni.

Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

The blood-brain barrier (BBB) has been a major hurdle for the treatment of various brain diseases. Endothelial cells, connected by tight junctions, form a ...

I gliomi di alto grado, come il glioma pontino intrinseco diffuso, sono tumori altamente invasivi con un'elevata mortalità. Nonostante anni di ricerche approfondite, la barriera emato-encefalica è un aspetto importante perché la chemioterapia non è in grado di raggiungere efficacemente il cervello. Fortunatamente, gli ultrasuoni focalizzati sono in grado di aprire temporaneamente e localmente la barriera emato-encefalica per trattamenti efficaci.Abbiamo sviluppato un piccolo ed economico sistema a ultrasuoni focalizzato neuronavigato per l'interruzione della barriera emato-encefalica. Questo sistema è costruito con componenti disponibili in commercio e con un alto grado di automazione, consente studi preclinici di valutazione dei farmaci. La medicina di precisione è definita come il farmaco giusto alla dose giusta per il paziente giusto al momento giusto.Per raggiungere questo obiettivo, è necessario eseguire lo screening di molti farmaci preselezionati. Il nostro sistema ecografico focalizzato compatto ad alta produttività per l'interruzione della barriera emato-encefalica ci consente di fare proprio questo. A dimostrare la procedura saranno Rianne Haumann e Elvin t Hart, due studenti di dottorato del mio gruppo di ricerca.Il flusso di lavoro per gli ultrasuoni focalizzati sulla neuronavigazione stereotassica guidata da immagini include l'imaging interventistico e l'accoppiamento acustico per la sonoporazione sulla piattaforma ecografica. Successivamente, è possibile eseguire l'imaging di follow-up. Selezionare un trasduttore adatto in base ai requisiti dell'esperimento progettato.Posizionalo in un cono stampato in 3D riempito con acqua degassata e chiuso sul fondo con una membrana Mylar acusticamente trasparente. Collegare il trasduttore a un generatore di funzioni e a un amplificatore di potenza. Montare il trasduttore su uno stadio lineare motorizzato per il posizionamento verticale automatico e collegarlo all'amplificatore di potenza.Utilizza una piattaforma stereotassica staccabile che include riscaldamento a temperatura regolata, barre per morsi e orecchie, anestesia e marcatori fiduciali multimodali. Fissare la piattaforma al tavolino lineare 2D. Prima di poter utilizzare il sistema FUS, calibrarlo e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore.Il punto di messa a fuoco corrisponde alla posizione verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica. Acclimatare l'animale alla struttura per almeno una settimana dopo l'arrivo e pesarlo regolarmente. Il giorno dell'esperimento, somministrare buprenorfina tramite un'iniezione sottocutanea 30 minuti prima del trattamento con FOS.Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza oculare. Se necessario, rimuovere il pelo sulla sommità della testa dell'animale con un rasoio e una crema depilatoria. Lavare la pelle con acqua per rimuovere eventuali residui.Per gli esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 microlitri di D-luciferina per via intraperitoneale con una siringa da insulina calibro 29. Per la somministrazione di microbolle per l'apertura della BEE, inserire un catetere della vena caudale da 26 a 30 gauge e lavare la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina. Fissare il catetere con del nastro adesivo per evitare il distacco.Se il cateterismo ha esito positivo, riempire il catetere con la soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue. Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotassica a temperatura regolata per evitare l'ipotermia. Fissa la testa dell'animale usando una barra per morsi e barre auricolari e fissa la coda e il catetere alla piattaforma.Fissare il corpo del mouse con una cinghia. Posiziona la piattaforma stereotassica con il mouse montato nella modalità di imaging e scatta immagini dell'animale. Determina se l'animale è posizionato correttamente sulla piattaforma.Contrassegnare la posizione dell'animale utilizzando i marcatori fiduciali multimodali in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini in base al punto di messa a fuoco del trasduttore. Determinare l'area target posizionando un contorno cerebrale sopra l'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore. Prima di posizionare il trasduttore, proteggere le narici e la bocca dell'animale con del nastro adesivo per evitare che il gel per ultrasuoni interferisca con la respirazione.Applicare il gel per ultrasuoni sulla parte superiore della testa del mouse per una corretta conduzione del suono. Registra la cavitazione a microbolle con l'ago idrofono, che viene posizionato nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale. In base ai valori di calibrazione, guidare il trasduttore nella posizione corretta sopra l'animale.Applica le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati per mirare alla regione cerebrale di interesse. Dopo aver posizionato il trasduttore nella posizione corretta, sciogliere e attivare le microbolle come descritto dal produttore. Prima dell'iniezione di microbolle, sciacquare il catetere della vena caudale con soluzione fisiologica per confermare l'accesso alla vena caudale.Avvia la traiettoria di insonicazione e contemporaneamente inietta le microbolle. Allo stesso tempo, l'idrofono ad ago rileverà e verificherà la cavitazione delle microbolle in tempo reale. Se lo si desidera, somministrare un mezzo di contrasto intravascolare o un farmaco dopo l'ecoporazione.Monitorare l'animale fino a un punto temporale predeterminato. La pressione acustica con un indice meccanico di 0,4 in combinazione con microbolle ha fornito un mezzo molto sensibile e affidabile per il rilevamento della cavitazione stabile rispetto al mancato rilevamento di subarmoniche quando non sono state iniettate microbolle o all'osservazione della cavitazione inerziale quando è stato applicato un MI di 0,6. Mentre la pressione acustica con un infarto miocardico fino a 0,6 non ha provocato danni macroscopici, il danno microscopico è stato evidenziato istologicamente con un infarto miocardico di 0,6.Un'ampiezza di pressione con un infarto miocardico di 0,8 ha provocato un'emorragia cerebrale macroscopica di vasi più grandi e una diffusa lisi tissutale con stravaso di eritrociti. Il blu di Evans per via endovenosa è stato iniettato per convalidare l'apertura della BBB nella regione pontina. Lo stravaso di albumina coniugata con blu di Evans è stato osservato a livello del ponte e del cervelletto nel topo trattato con FUS e microbolle, dimostrando un preciso targeting della regione di interesse.Le fasi più importanti di questo protocollo sono il corretto posizionamento del catetere della vena caudale, il posizionamento e il targeting dell'animale e l'iniezione di microbolle con ultrasuoni focalizzati con rilevamento della cavitazione. Questo sistema a ultrasuoni focalizzato autocostruito può essere adattato e riprogettato per molteplici domande di ricerca, pur essendo conveniente e con un flusso di lavoro automatizzato, il che lo rende adatto a ricercatori relativamente inesperti.

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