Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori

La barriera ematico-encefalica (BBB) può essere temporaneamente interrotta con ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS). Qui descriviamo un protocollo passo-passo per l'apertura BBB ad alta produttività in vivo utilizzando un sistema FUS modulare accessibile per esperti non ad ultrasuoni.

I gliomi di alto grado, come il glioma pontino intrinseco diffuso, sono tumori altamente invasivi con un'elevata mortalità. Nonostante anni di ricerche approfondite, la barriera emato-encefalica è un aspetto importante perché la chemioterapia non è in grado di raggiungere efficacemente il cervello. Fortunatamente, gli ultrasuoni focalizzati sono in grado di aprire temporaneamente e localmente la barriera emato-encefalica per trattamenti efficaci.

Abbiamo sviluppato un piccolo ed economico sistema a ultrasuoni focalizzato neuronavigato per l'interruzione della barriera emato-encefalica. Questo sistema è costruito con componenti disponibili in commercio e con un alto grado di automazione, consente studi preclinici di valutazione dei farmaci. La medicina di precisione è definita come il farmaco giusto alla dose giusta per il paziente giusto al momento giusto.

Per raggiungere questo obiettivo, è necessario eseguire lo screening di molti farmaci preselezionati. Il nostro sistema ecografico focalizzato compatto ad alta produttività per l'interruzione della barriera emato-encefalica ci consente di fare proprio questo. A dimostrare la procedura saranno Rianne Haumann e Elvin t Hart, due studenti di dottorato del mio gruppo di ricerca.

Il flusso di lavoro per gli ultrasuoni focalizzati sulla neuronavigazione stereotassica guidata da immagini include l'imaging interventistico e l'accoppiamento acustico per la sonoporazione sulla piattaforma ecografica. Successivamente, è possibile eseguire l'imaging di follow-up. Selezionare un trasduttore adatto in base ai requisiti dell'esperimento progettato.

Posizionalo in un cono stampato in 3D riempito con acqua degassata e chiuso sul fondo con una membrana Mylar acusticamente trasparente. Collegare il trasduttore a un generatore di funzioni e a un amplificatore di potenza. Montare il trasduttore su uno stadio lineare motorizzato per il posizionamento verticale automatico e collegarlo all'amplificatore di potenza.

Utilizza una piattaforma stereotassica staccabile che include riscaldamento a temperatura regolata, barre per morsi e orecchie, anestesia e marcatori fiduciali multimodali. Fissare la piattaforma al tavolino lineare 2D. Prima di poter utilizzare il sistema FUS, calibrarlo e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore.

Il punto di messa a fuoco corrisponde alla posizione verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica. Acclimatare l'animale alla struttura per almeno una settimana dopo l'arrivo e pesarlo regolarmente. Il giorno dell'esperimento, somministrare buprenorfina tramite un'iniezione sottocutanea 30 minuti prima del trattamento con FOS.

Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza oculare. Se necessario, rimuovere il pelo sulla sommità della testa dell'animale con un rasoio e una crema depilatoria. Lavare la pelle con acqua per rimuovere eventuali residui.

Per gli esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 microlitri di D-luciferina per via intraperitoneale con una siringa da insulina calibro 29. Per la somministrazione di microbolle per l'apertura della BEE, inserire un catetere della vena caudale da 26 a 30 gauge e lavare la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina. Fissare il catetere con del nastro adesivo per evitare il distacco.

Se il cateterismo ha esito positivo, riempire il catetere con la soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue. Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotassica a temperatura regolata per evitare l'ipotermia. Fissa la testa dell'animale usando una barra per morsi e barre auricolari e fissa la coda e il catetere alla piattaforma.

Fissare il corpo del mouse con una cinghia. Posiziona la piattaforma stereotassica con il mouse montato nella modalità di imaging e scatta immagini dell'animale. Determina se l'animale è posizionato correttamente sulla piattaforma.

Contrassegnare la posizione dell'animale utilizzando i marcatori fiduciali multimodali in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini in base al punto di messa a fuoco del trasduttore. Determinare l'area target posizionando un contorno cerebrale sopra l'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore. Prima di posizionare il trasduttore, proteggere le narici e la bocca dell'animale con del nastro adesivo per evitare che il gel per ultrasuoni interferisca con la respirazione.

Applicare il gel per ultrasuoni sulla parte superiore della testa del mouse per una corretta conduzione del suono. Registra la cavitazione a microbolle con l'ago idrofono, che viene posizionato nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale. In base ai valori di calibrazione, guidare il trasduttore nella posizione corretta sopra l'animale.

Applica le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati per mirare alla regione cerebrale di interesse. Dopo aver posizionato il trasduttore nella posizione corretta, sciogliere e attivare le microbolle come descritto dal produttore. Prima dell'iniezione di microbolle, sciacquare il catetere della vena caudale con soluzione fisiologica per confermare l'accesso alla vena caudale.

Avvia la traiettoria di insonicazione e contemporaneamente inietta le microbolle. Allo stesso tempo, l'idrofono ad ago rileverà e verificherà la cavitazione delle microbolle in tempo reale. Se lo si desidera, somministrare un mezzo di contrasto intravascolare o un farmaco dopo l'ecoporazione.

Monitorare l'animale fino a un punto temporale predeterminato. La pressione acustica con un indice meccanico di 0,4 in combinazione con microbolle ha fornito un mezzo molto sensibile e affidabile per il rilevamento della cavitazione stabile rispetto al mancato rilevamento di subarmoniche quando non sono state iniettate microbolle o all'osservazione della cavitazione inerziale quando è stato applicato un MI di 0,6. Mentre la pressione acustica con un infarto miocardico fino a 0,6 non ha provocato danni macroscopici, il danno microscopico è stato evidenziato istologicamente con un infarto miocardico di 0,6.

Un'ampiezza di pressione con un infarto miocardico di 0,8 ha provocato un'emorragia cerebrale macroscopica di vasi più grandi e una diffusa lisi tissutale con stravaso di eritrociti. Il blu di Evans per via endovenosa è stato iniettato per convalidare l'apertura della BBB nella regione pontina. Lo stravaso di albumina coniugata con blu di Evans è stato osservato a livello del ponte e del cervelletto nel topo trattato con FUS e microbolle, dimostrando un preciso targeting della regione di interesse.

Le fasi più importanti di questo protocollo sono il corretto posizionamento del catetere della vena caudale, il posizionamento e il targeting dell'animale e l'iniezione di microbolle con ultrasuoni focalizzati con rilevamento della cavitazione. Questo sistema a ultrasuoni focalizzato autocostruito può essere adattato e riprogettato per molteplici domande di ricerca, pur essendo conveniente e con un flusso di lavoro automatizzato, il che lo rende adatto a ricercatori relativamente inesperti.