Un neuronavigation stereotattico guidato da immagini ad alta produttività e un sistema ad ultrasuoni focalizzati per l'apertura della barriera ematico-encefalica nei roditori
July 16th, 2020
La barriera ematico-encefalica (BBB) può essere temporaneamente interrotta con ultrasuoni focalizzati mediati da microbolle (FUS). Qui descriviamo un protocollo passo-passo per l'apertura BBB ad alta produttività in vivo utilizzando un sistema FUS modulare accessibile per esperti non ad ultrasuoni.
I gliomi di alto grado, come il glioma pontino intrinseco diffuso, sono tumori altamente invasivi con un'elevata mortalità. Nonostante anni di ricerche approfondite, la barriera emato-encefalica è un aspetto importante perché la chemioterapia non è in grado di raggiungere efficacemente il cervello. Fortunatamente, gli ultrasuoni focalizzati sono in grado di aprire temporaneamente e localmente la barriera emato-encefalica per trattamenti efficaci.
Abbiamo sviluppato un piccolo ed economico sistema a ultrasuoni focalizzato neuronavigato per l'interruzione della barriera emato-encefalica. Questo sistema è costruito con componenti disponibili in commercio e con un alto grado di automazione, consente studi preclinici di valutazione dei farmaci. La medicina di precisione è definita come il farmaco giusto alla dose giusta per il paziente giusto al momento giusto.
Per raggiungere questo obiettivo, è necessario eseguire lo screening di molti farmaci preselezionati. Il nostro sistema ecografico focalizzato compatto ad alta produttività per l'interruzione della barriera emato-encefalica ci consente di fare proprio questo. A dimostrare la procedura saranno Rianne Haumann e Elvin t Hart, due studenti di dottorato del mio gruppo di ricerca.
Il flusso di lavoro per gli ultrasuoni focalizzati sulla neuronavigazione stereotassica guidata da immagini include l'imaging interventistico e l'accoppiamento acustico per la sonoporazione sulla piattaforma ecografica. Successivamente, è possibile eseguire l'imaging di follow-up. Selezionare un trasduttore adatto in base ai requisiti dell'esperimento progettato.
Posizionalo in un cono stampato in 3D riempito con acqua degassata e chiuso sul fondo con una membrana Mylar acusticamente trasparente. Collegare il trasduttore a un generatore di funzioni e a un amplificatore di potenza. Montare il trasduttore su uno stadio lineare motorizzato per il posizionamento verticale automatico e collegarlo all'amplificatore di potenza.
Utilizza una piattaforma stereotassica staccabile che include riscaldamento a temperatura regolata, barre per morsi e orecchie, anestesia e marcatori fiduciali multimodali. Fissare la piattaforma al tavolino lineare 2D. Prima di poter utilizzare il sistema FUS, calibrarlo e determinare il punto di messa a fuoco del trasduttore.
Il punto di messa a fuoco corrisponde alla posizione verticale dell'animale sulla piattaforma stereotassica. Acclimatare l'animale alla struttura per almeno una settimana dopo l'arrivo e pesarlo regolarmente. Il giorno dell'esperimento, somministrare buprenorfina tramite un'iniezione sottocutanea 30 minuti prima del trattamento con FOS.
Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza oculare. Se necessario, rimuovere il pelo sulla sommità della testa dell'animale con un rasoio e una crema depilatoria. Lavare la pelle con acqua per rimuovere eventuali residui.
Per gli esperimenti con modelli tumorali BLI, iniettare 150 microlitri di D-luciferina per via intraperitoneale con una siringa da insulina calibro 29. Per la somministrazione di microbolle per l'apertura della BEE, inserire un catetere della vena caudale da 26 a 30 gauge e lavare la vena con un piccolo volume di soluzione di eparina. Fissare il catetere con del nastro adesivo per evitare il distacco.
Se il cateterismo ha esito positivo, riempire il catetere con la soluzione di eparina per evitare la coagulazione del sangue. Posizionare l'animale sulla piattaforma stereotassica a temperatura regolata per evitare l'ipotermia. Fissa la testa dell'animale usando una barra per morsi e barre auricolari e fissa la coda e il catetere alla piattaforma.
Fissare il corpo del mouse con una cinghia. Posiziona la piattaforma stereotassica con il mouse montato nella modalità di imaging e scatta immagini dell'animale. Determina se l'animale è posizionato correttamente sulla piattaforma.
Contrassegnare la posizione dell'animale utilizzando i marcatori fiduciali multimodali in combinazione con la pipeline di elaborazione delle immagini in base al punto di messa a fuoco del trasduttore. Determinare l'area target posizionando un contorno cerebrale sopra l'immagine a raggi X acquisita o utilizzando immagini BLI per determinare il centro del tumore. Prima di posizionare il trasduttore, proteggere le narici e la bocca dell'animale con del nastro adesivo per evitare che il gel per ultrasuoni interferisca con la respirazione.
Applicare il gel per ultrasuoni sulla parte superiore della testa del mouse per una corretta conduzione del suono. Registra la cavitazione a microbolle con l'ago idrofono, che viene posizionato nelle immediate vicinanze dell'osso occipitale. In base ai valori di calibrazione, guidare il trasduttore nella posizione corretta sopra l'animale.
Applica le impostazioni preconfigurate a tutti i dispositivi collegati per mirare alla regione cerebrale di interesse. Dopo aver posizionato il trasduttore nella posizione corretta, sciogliere e attivare le microbolle come descritto dal produttore. Prima dell'iniezione di microbolle, sciacquare il catetere della vena caudale con soluzione fisiologica per confermare l'accesso alla vena caudale.
Avvia la traiettoria di insonicazione e contemporaneamente inietta le microbolle. Allo stesso tempo, l'idrofono ad ago rileverà e verificherà la cavitazione delle microbolle in tempo reale. Se lo si desidera, somministrare un mezzo di contrasto intravascolare o un farmaco dopo l'ecoporazione.
Monitorare l'animale fino a un punto temporale predeterminato. La pressione acustica con un indice meccanico di 0,4 in combinazione con microbolle ha fornito un mezzo molto sensibile e affidabile per il rilevamento della cavitazione stabile rispetto al mancato rilevamento di subarmoniche quando non sono state iniettate microbolle o all'osservazione della cavitazione inerziale quando è stato applicato un MI di 0,6. Mentre la pressione acustica con un infarto miocardico fino a 0,6 non ha provocato danni macroscopici, il danno microscopico è stato evidenziato istologicamente con un infarto miocardico di 0,6.
Un'ampiezza di pressione con un infarto miocardico di 0,8 ha provocato un'emorragia cerebrale macroscopica di vasi più grandi e una diffusa lisi tissutale con stravaso di eritrociti. Il blu di Evans per via endovenosa è stato iniettato per convalidare l'apertura della BBB nella regione pontina. Lo stravaso di albumina coniugata con blu di Evans è stato osservato a livello del ponte e del cervelletto nel topo trattato con FUS e microbolle, dimostrando un preciso targeting della regione di interesse.
Le fasi più importanti di questo protocollo sono il corretto posizionamento del catetere della vena caudale, il posizionamento e il targeting dell'animale e l'iniezione di microbolle con ultrasuoni focalizzati con rilevamento della cavitazione. Questo sistema a ultrasuoni focalizzato autocostruito può essere adattato e riprogettato per molteplici domande di ricerca, pur essendo conveniente e con un flusso di lavoro automatizzato, il che lo rende adatto a ricercatori relativamente inesperti.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo ad alto rendimento per la temporanea interruzione della barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando un sistema ad ultrasuoni focalizzati (FUS) modulare. Sfruttando la sonoporazione mediata da microbolle, questa tecnica facilita l'efficace somministrazione di trattamenti per condizioni come i gliomi che sono ostacolati dalla BBB. La metodologia è progettata per l'accessibilità, permettendo ai non esperti di implementare l'apertura in vivo della BBB.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Ingegneria biomedica
- Somministrazione terapeutica
Sfondo
- I gliomi ad alto grado sono tumori altamente invasivi con opzioni di trattamento limitate a causa della BBB.
- Gli ultrasuoni focalizzati sono emersi come un metodo promettente per l'interruzione della BBB.
- Esiste la necessità di dispositivi economici che possano essere facilmente gestiti da non esperti.
- Il protocollo qui delineato mira a rafforzare gli studi di valutazione preclinica dei farmaci.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema FUS ad alto rendimento per l'interruzione della BBB.
- Facilitare lo screening di farmaci preselezionati per applicazioni di medicina di precisione.
- Dimostrare la procedura in modo efficace utilizzando un sistema automatizzato.
Metodi utilizzati
- È stato utilizzato un sistema ad ultrasuoni focalizzati modulare per gli esperimenti in vivo.
- Sono stati impiegati modelli di topi per studiare l'interruzione della BBB e la somministrazione di agenti terapeutici.
- Il processo include imaging interventistico e accoppiamento acustico per la sonoporazione.
- I passaggi critici includono l'acclimatazione degli animali, la somministrazione di anestetici, la cateterizzazione e il posizionamento preciso del trasduttore ad ultrasuoni.
Risultati principali
- La procedura ha dimostrato in modo affidabile la capacità di migliorare la somministrazione dei farmaci attraverso la BBB.
- Il rilevamento della cavitazione delle microbolle è stato essenziale per monitorare l'efficacia del trattamento.
- I risultati quantitativi hanno confermato la precisa localizzazione dell'interruzione della BBB.
- Gli effetti sistemici sono stati misurati dopo l'applicazione degli ultrasuoni, dimostrando sicurezza ed efficacia.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un metodo pratico ed efficace per l'interruzione della BBB, consentendo interventi terapeutici migliorati.
- Il sistema FUS personalizzabile fornisce una base per ulteriori ricerche nella somministrazione dei farmaci e nel trattamento delle malattie del SNC.
- Le intuizioni acquisite potrebbero far progredire la comprensione della medicina di precisione e del targeting terapeutico nelle condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This high-throughput focused ultrasound system enables precise, reproducible blood-brain barrier opening in rodent models, directly supporting preclinical drug evaluation for CNS therapeutics. By integrating image-guided stereotactic navigation with automated cavitation monitoring, the system reduces variability and enhances data reliability in high-volume screening campaigns. Its cost-effective, modular design facilitates scalable implementation across discovery workflows targeting glioma and other brain diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of blood-brain barrier permeability for target validation in glioma models.
- Operational Value: Supports standardized, automated workflows that reduce intra-group variability and improve reproducibility in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, real-time cavitation detection as a biomarker for successful blood-brain barrier opening.
- Operational Value: Enables high-throughput screening of preselected drug compounds through automated transducer positioning and microbubble delivery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Validated in patient-derived xenograft models of glioblastoma and diffuse midline glioma, ensuring disease-relevant preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by confirming precise, localized drug delivery across the blood-brain barrier.
Pipeline & Workflow Integration
The system integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling image-guided, reproducible blood-brain barrier disruption for therapeutic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of blood-brain barrier modulation in glioma models through precise, stereotactic targeting.
- Screening: Delivers assay readiness via automated workflows, standardized microbubble injection, and real-time cavitation monitoring for compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs including cavitation signals, Evans blue extravasation, and histological confirmation of barrier opening.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through validation in patient-derived glioma models, supporting biomarker-aligned therapeutic assessment.
- Enterprise Reuse: Built from commercially available components with a modular design, enabling adaptation across multiple research questions and repeated use in discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in blood-brain barrier penetration data, reducing mechanistic ambiguity in CNS drug delivery.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability through automation and image-guided targeting.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable, quantitative blood-brain barrier opening data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS drug candidates based on confirmed, localized barrier disruption and drug delivery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, ultrasound physics, and microbubble handling.
- Needs instrumentation including function generator, power amplifier, motorized linear stage, needle hydrophone, and imaging modalities (X-ray, bioluminescence).
- Demands cross-team standardization of animal preparation, catheterization, and transducer calibration procedures.
- Involves adaptation considerations for different transducer frequencies, targeting coordinates, and model systems (e.g., rat vs. mouse).
- Practical limitations include the need for surgical skill in tail vein catheterization and potential variability in skull thickness affecting ultrasound transmission.
