Name: In vivo Imaging del calcio nelloliva inferiore del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri un protocollo chirurgico per l'imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo in vivo utilizzando lenti GRIN. Questo metodo consente di registrare l'attività neuronale senza danneggiare le strutture vitali del tronco encefalico.

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Ringraziamo Andrew Scott del Media Center di OIST per il suo aiuto nella registrazione e nell'editing video. Inoltre, ringraziamo Hugo Hoedemaker per il suo aiuto nello sviluppo dell'intervento chirurgico per esporre il tronco encefalico e il Dr. Kevin Dorgans per il suo aiuto nel disegnare diagrammi per le figure. Inoltre, un grande ringraziamento a Salvatore Lacava per la sua narrazione voice-over, così come a tutti i membri nRIM e agli animali domestici per il continuo supporto al benessere nei momenti difficili del COVID-19.

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<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Poiché la procedura chirurgica prevede operazioni eseguite nella regione della gola con numerose strutture vitali critiche (arterie, nervi), è essenziale che sia condotta da un ricercatore con abilità chirurgiche di alto livello. Di seguito, evidenziamo e commentiamo diversi punti chiave della procedura; tuttavia, va ricordato che nessuna quantità di consigli scritti può soppiantare l'esperienza, l'abilità e l'intuizione del ricercatore.
Il passo più critico nell'intervento chirurgico è la tracheotomia. Si tratta di tagliare la trachea, cambiare l'isoflurane dal cono del naso al tubo di intubazione, fissare la trachea alla pelle toracica e legare la trachea e il tubo di intubazione insieme. Tutte queste operazioni devono essere completate in modo fluido e rapido per evitare incidenti, come anestesia inadeguata, afflusso di fluido in trachea o slittamento del tubo di intubazione. Prima di tagliare la trachea, è necessario tenere a mente il protocollo.
L'emorragia è una delle principali cause di morte animale in questo intervento chirurgico. Poiché l'area del collo è densa di vasi sanguigni, il taglio deve essere eseguito solo quando la linea di vista è chiara per evitare di tagliare vene e arterie non vedere. Pertanto, i muscoli e i tessuti connettivi che oscurano la vista devono essere rimossi e il sangue dai capillari rotti deve essere pulito prima di avanzare.
L'animale può essere tenuto in vita per molto tempo (più di 8 ore) dall'inizio dell'intervento chirurgico. Tuttavia, è importante terminare rapidamente la procedura chirurgica in modo che ci sia più tempo per esaminare i neuroni del tronco encefalico quando le condizioni fisiologiche degli animali sono buone. Un ricercatore qualificato può terminare l'intera procedura in 70 minuti.
Mentre il metodo fornisce una visione pulita delle superfici cerebrali ventrali, è purtroppo impossibile farlo senza eseguire una tracheotomia e rimuovere una quantità significativa di tessuto nella regione della gola. Pertanto, non si può permettere all'animale di svegliarsi dall'anestesia. Inoltre, anche se è possibile mantenere in vita l'animale per molte ore con un'attenta regolazione del parto anestetico, mantenendo la temperatura corporea e l'idratazione, è inevitabile che la sperimentazione prolungata porti infine all'indebolimento delle condizioni animali. È lasciato all'esperienza del ricercatore considerare la durata massima delle registrazioni stabili.
Un'altra potenziale limitazione del metodo qui descritta è che poiché la lente GRIN non è inserita nel parenchima cerebrale, possono essere esaminati solo neuroni relativamente superficiali (~150-200 μm). Mentre l'impianto chirurgico della lente GRIN è tecnicamente possibile, il metodo di chirurgia acuta non consente ai neuroni di recuperare tempo sufficiente dallo stress ossidativo e dalla presenza di sangue dopo l'impianto che probabilmente degrada la qualità dell'immagine oltre l'accettabile.
Nonostante le preoccupazioni di cui sopra, crediamo che questa sia la prima volta che viene presentato un metodo per l'imaging in vivo dei neuroni IO. Permette l'esame dell'attività spatiotemporale nei neuroni IO nel contesto in vivo in presenza di ingressi afferenti intatti da sistemi sensoriali così come i segnali dei nuclei cerebellari e della giunzione mesodiencefalica22, un'impresa che finora non è stata possibile. Con questo metodo, la funzione dell'IO può ora essere studiata in modo più approfondito con la combinazione di stimolazione sensoriale e optogenetica. In particolare, con l'evoluzione dell'imaging di tensione (come il nostro recente metodo per l'imaging della tensione nell'IO 23), speriamo che il metodo chirurgico presentato ispiri numerosi ricercatori a affrontare la sfida di indagare come l'IO contribuisce alla generazione di picchi complessi cerebellari.

L'obiettivo principale delle neuroscienze dei sistemi è capire come i modelli di attività spaziotemporale delle reti neuronali contribuiscano alla generazione di comportamenti animali. Pertanto, la metodologia di imaging fluorescente che utilizza sonde sensibili al calcio è diventata nell'ultimo decennio uno strumento principale per esaminare l'attività della rete neuronale negli animaliviventi 1,2, in quanto consente la visualizzazione di tali dinamiche su scale spaziali che vanno dalle singole cellule ai circuiti mesoscala. Negli ultimi anni, l'approccio comune in cui i circuiti neurali nelle strutture cerebrali superficiali (come cortici cerebrali o cerebellari) sono immagini attraverso una finestra cranaletrasparente 3 è stato completato con l'uso di lenti dell'indice gradiente-rifrazione (GRIN)4 che consentono l'esame della dinamica di rete nelle strutture cerebrali profonde. Le lenti GRIN attualmente disponibili consentono di raggiungere strutture profonde diversi millimetri, come l'amigdala del topo, l'ippocampo e i gangli basali5. Tuttavia, molte regioni di interesse come vari nuclei nel midollo ventrale si trovano significativamente più in profondità, posizionandoli all'estremo della portata della lente GRIN.
Qui, descriviamo come superare questa difficoltà sfruttando l'accessibilità relativamente facile del midollo attraverso l'aspetto ventrale del cervello. Usando topi adulti in cui l'oliva inferiore (IO), un nucleo nel midollo ventrale, è stata trasfettata viralmente con un sensore di calcio GCaMP6s, descriviamo i passaggi chirurgici (modificati dal metodo descritto originariamente in Khosrovani et al. 20076) per posizionare una lente GRIN sulla superficie ventrale del cervello di un topo anestetizzato. Usando un microscopio in miniatura, dimostriamo la fattibilità di registrare l'attività neuronale in regioni cerebrali così estremamente ventrali. Mentre la procedura è necessariamente un intervento chirurgico di non sopravvivenza e nessuna sperimentazione può essere eseguita su animali svegli, il metodo consente l'esame della dinamica di rete intatta nel contesto della stimolazione sensoriale o di altre vie afferenti, fornendo chiari vantaggi rispetto agli approcci ex vivo come l'uso di preparati a fette acute.

<table><tbody><tr><td>AAV. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, USA</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>Sutura assorbibile con ago a semicerchio da 6 mm</td><td>Natume, Giappone</td><td>Ago a uncino</td><td>L6-60N2</td> con filo</tr><tr><td>Triangoli di assorbimento</td><td>FST, Germania</td><td>18105-03</td><td>Spugne chirurgiche</td></tr><tr><td>Stereomicroscopi</td><td>Leica, Germania</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo porta-aghi a punta curva con blocco</td><td>FST, Germania</td><td>12061-01</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>tamponi di cotone</td><td>Sanyo, Giappone</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per legatura delicata</td><td>FST, Germania</td><td>11063-07</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Pinza per legatura delicata</td><td>FST, Germania</td><td>11063-07</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 pinza</td><td>FST, Germania</td><td>11251-35</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Forbici per iride fine</td><td>FST, Germania</td><td>14060-09</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur punta curva</td><td>FST, Germania</td><td>16221-14</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Gelfoam spugna di gelatina assorbibile</td><td>Pfizer, USA</td><td>0315-08</td><td>Spugna di gelatina emostatica</td></tr><tr><td>Vetro-Capillare Nanoiniezione</td><td>Neurostar, Germania</td><td>n/a</td><td>Per iniezione di vettori virali</td></tr><tr><td>Pinze Graefe con punta seghettata</td><td>FST, Germania</td><td>11052-10</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Asta di impianto</td><td>Inscopix, USA</td><td>n/a</td><td>Fa parte del sistema nVoke2. È progettato per nVoke2 microscpe miniaturizzato e la lente GRIN può essere montata su di esso</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, Regno Unito</td><td>n/a</td><td>Isoflurano</td></tr><tr><td>KETALAR PER INIEZIONE INTRAMUSCOLARE</td><td>Daiichi Sankyo, Giappone</td><td>n/a</td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, USA</td><td></td><td>Estrattore</td></tr> per <tr><td>micropipette basato su laser</td> per tessuti di pulizia <td>Strumento Sutter, USA</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta Beveler</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereotassico motorizzato basato su Kopf, modello 900</td><td>Neurostar, Germania</td><td>n/a</td><td>Stereotaxic frame</td></tr><tr><td>mouseOxPlus con sensore di temperatura rettale e pulsossimetro a pinza per coscia</td><td>Starr Life Sciences, PA, USA</td><td>MouseOxPlus</td><td>Misura la frequenza cardiaca degli animali, la saturazione arteriosa di ossigeno (SpO2), la frequenza respiratoria e la temperatura</td></tr><tr><td>Sistema di microcamera per imaging del calcio integrato nVoke2</td><td>Inscopix, USA</td><td>1000-003026</td><td>Microscopio in miniatura</td></tr><tr><td>Ohaus Compact Scales</td><td>Ohaus, USA</td><td>CS 200</td><td>Bilancia utilizzata per pesare l'animale</td></tr><tr><td>Otsuka Soluzione salina normale</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory, Giappone</td><td>n/a Sistema di</td><td></td></tr><tr><td>controllo della temperatura fisiologico-biologico</td><td>SuperTech Instruments, Ungheria</td><td>TMP-5b</td><td>Pad termico per mouse</td></tr><tr><td>Sonda per lenti ProView Diametro 1,0 mm, lunghezza 9,0 mm</td><td>Inscopix, USA</td><td>1050-002214</td><td>Lente con indice di rifrazione a gradiente (GRIN)</td></tr><tr><td>Capillari in vetro Q114-53-10NP</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>112017</td><td>Capillari in vetro di quarzo personalizzati</td></tr><tr><td>Catetere IV di sicurezza 20G</td><td>B. Braun, Germania</td><td>4251652-03</td><td>Catetere da 20 gauage utilizzato per preparare il tubo</td></tr> <tr>di intubazione<td>Carta vetrata</td><td>ESCO, Giappone</td><td>EA366MC</td><td>Utilizzato per lucidare la punta dell'ago 25G per preparare l'ago curvo e smussato</td></tr><tr><td>Lama per bisturi</td><td>Muromachi Kikai, Giappone</td><td>10010-00</td><td>Utilizzato per tagliare la punta della pipetta in vetro di quarzo</td></tr><tr><td>Sistema di anestesia per inalazione a basso flusso SomnoSuite</td><td>Kent Scientific, USA</td><td>SOMNO</td><td>Fornisce un controllo preciso del flusso di isoflurano</td></tr><tr><td>Trapano Surgic XT Plus</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>Per iniezione di vettori virali</td></tr><tr><td>Siringa 1 ml</td><td>Terumo, Giappone</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa 25G</td><td>Top, Giappone</td><td>00819</td><td>Utilizzato per fare aghi smussati e piegati</td></tr><tr><td>Ago per siringa 26G</td><td>Terumo, Giappone</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Rifinitore professionale</td><td>Thrive, Giappone</td><td>n/a</td><td>Rasoio</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Bingen Spring Scissors</td><td>FST, Germania</td><td>15004-08</td><td>Strumento chirurgico</td></tr><tr><td>Vaselina</td><td>Hayashi Pure Chemical, Giappone</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet pelle sensibile</td><td>Veet, Canada</td><td>n/a</td><td>Crema di epilazione</td></tr><tr><td>Gelatina di xilocaina 2 % 30ml</td><td>Aspen Giappone,&nbsp; Giappone</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

L'oliva inferiore (IO), un nucleo nel midollo ventrale, è l'unica fonte di fibre rampicanti che formano uno dei due percorsi di ingresso che entrano nel cervelletto. L'IO è stato a lungo proposto per essere cruciale per il controllo motorio e la sua attività è attualmente considerata al centro di molte ipotesi di funzioni motorie e cognitive del cervelletto. Mentre la sua fisiologia e funzione sono state relativamente ben studiate a livello di singola cellula in vitro, attualmente non ci sono rapporti sull'organizzazione dell'attività della rete IO negli animali viventi. Ciò è in gran parte dovuto alla posizione anatomica estremamente impegnativa dell'IO, rendendo difficile l'argomento dei metodi convenzionali di imaging fluorescente, dove un percorso ottico deve essere creato attraverso l'intero cervello situato dorsalmente nella regione di interesse.
Qui descriviamo un metodo alternativo per ottenere dati di imaging di calcio all'avanguardia dalla rete IO. Il metodo sfrutta l'estrema posizione ventrale dell'IO e prevede una procedura chirurgica per l'inserimento di una lente indice gradiente-rifrazione (GRIN) attraverso i visceri del collo per entrare in contatto con la superficie ventrale del sensore di calcio GCaMP6s-espresso IO in topi anestetizzati. Una registrazione rappresentativa dell'imaging del calcio dimostra la fattibilità di registrare l'attività dei neuroni IO dopo l'intervento chirurgico. Sebbene si tratta di un intervento chirurgico di non sopravvivenza e le registrazioni devono essere condotte in anestesia, evita danni ai nuclei del tronco encefalico critici per la vita e consente di condurre una grande varietà di esperimenti che studiano i modelli di attività spaziotemporale e l'integrazione dell'input nell'IO. Questa procedura con modifiche potrebbe essere utilizzata per registrazioni in altre regioni adiacenti del tronco encefalico ventrale.

Qui presentiamo una registrazione rappresentativa ottenuta con il metodo descritto. La figura 6a mostra la posizione delle celle IO con etichetta brillante visualizzata durante l'esperimento. Le strisce diagonali scure sono vasi sanguigni. Si noti la luminosità variabile delle singole cellule, risultante dall'efficacia della trasfezione variabile. Nella figura del pannello 6b mostriamo le tracce di intensità di fluorescenza normalizzata media (deltaF/F) ottenute dai somata indicati con colori e numeri nel pannello a. Le deformazioni verso l'alto rappresentano aumenti transitori del calcio intracellulare. Si noti come il diverso livello di espressione di GCaMP6s (riflesso nella luminosità cellulare nel pannello a) porti a rapporti tra segnale e rumore variabili (SNR).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Figura 6: Esempio di registrazione dell'attività dei neuroni IO nel mouse anestetizzato. (a) Fotogramma di esempio rappresentativo da una registrazione dopo il filtraggio spaziale. I punti luminosi sono somi neuronali IO, molti dei quali sono stati indicati come regioni di interesse (ROM, numeri colorati). Le strisce scure sono vasi sanguigni. (b) Esempio di tracce deltaF/F ottenute dalle ROM indicate nel pannello a. Le deviazioni verso l'alto riflettono l'aumento del segnale calcio. Barra di scala in a=10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un protocollo per esporre il tronco encefalico del topo adulto dal lato ventrale. Utilizzando una lente indice gradient-rifrazione con un microscopio in miniatura, l'imaging di calcio può essere utilizzato per esaminare l'attività dei somata neurali olivari inferiori in vivo.

In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

L'oliva inferiore è la parte più ventrale del midollo, ed è quindi estremamente difficile da raggiungere in un animale vivente. Qui, introduciamo un protocollo per esporre il cervello del topo adulto dal lato ventrale, e usiamo lenti GRIN per registrare l'attività neuronale nei neuroni dell'olivo inferiori che esprimono sensori di calcio. Questo metodo evita danni al tronco encefalico critico per la vita e consente indagini sui modelli di attività spazio-temporale e sull'integrazione dell'input nell'oliva inferiore.Poiché l'operazione viene eseguita nella regione della gola complessa con molte strutture vitali, è essenziale che sia condotta da un ricercatore con abilità chirurgiche di alto livello. Preparare un tubo di intubazione tagliando una fessura lunga da 5 a 6 millimetri e larga 0,8 millimetri dalla punta di un catetere calibro 20. Preparare un ago smussato e curvo tagliando la punta, levigare la superficie di frattura e piegarla con la pinze.Questo verrà utilizzato per supportare una trachea durante la tracheotomia. Diluire 15 milligrammi per millilitro ketamina con salina al 15%Assemblare strumenti chirurgici e materiali di consumo. Impostare la pastiglia di riscaldamento a 38 gradi Celsius.Ruotare il cono nasale di 180 gradi orizzontalmente in cornice stereotassica. Pesare il topo la cui oliva inferiore è stata precedentemente trasfettata da GCaMP6 portatori di virus e calcolare la quantità di ketamina diluita per iniezione. Casella di induzione pre-riempimento con isoflurane al 5% e anestesizzare il mouse.Montare il mouse nel telaio stereotassico, lato ventrale verso l'alto. Radere la gola del mouse e l'area della coscia. Rimuovere i capelli residui con crema per la depilazione.Applicare localmente la gelatina di xilocaina sulla pelle della gola. Monitorare la temperatura del mouse con un sensore termico rettale. Iniettare una salina prerifabbrita in un millilitro per via intraperitoneale.Valutare la profondità dell'anestesia con un forte pizzico sulle dita posteriori. Non deve essere evocata alcuna risposta rilevabile. Fai un'incisione verticale nella pelle della gola lungo la linea mediana.Separare la pelle del collo dai visceri sotto di essa utilizzando il metodo di dissezione smussata e tagliare la pelle. Liberare le ghiandole salivari dal tessuto connettivo e capovolgerle lateralmente per esporre la trachea ricoperta di muscoli sternotiroidi. Iniettare per via intraperitoneale la prima dose di chetamina diluita a cinque millilitri per chilogrammo di peso animale.Dividere con cura il muscolo sternotiroide lungo la linea mediana con la punta di una flessoria fine per esporre la trachea. Staccare la trachea dai vasi sanguigni e dall'esofago con le forcelle usando il metodo della dissezione smussata. Iniettare una seconda dose di ketamina diluita a 2,5 millilitri per chilogrammo di peso animale.Inserire trasversalmente un ago smussato sotto trachea. Sollevare la trachea con l'ago smussato. Fai girare il filo di sutura intorno al terzo anello di trachea, caudale la ghiandola tiroidea, con un ago a mezzo cerchio.Crea quattro cravatte per strumenti su questo anello. Perforare la pelle del torace con lo stesso ago a mezzo cerchio e condurre il filo attraverso la pelle. Sollevare delicatamente la trachea con il filo e tagliare la trachea caudale alla ghiandola tiroidea.Tirare la trachea verso la pelle del torace. Sollevare l'apertura della trachea aggiungendo un piccolo pezzo di spugna chirurgica sotto di essa. Rimuovere il liquido rimanente all'interno della punta di apertura della trachea con una sottile striscia di tessuto detergente.Passare il flusso di isoflurane dal cono nasale stereotassico al tubo di intubazione. Inserire il tubo di intubazione nella trachea. Assicurarsi che parte della fessura nel tubo rimanga al di fuori della trachea per consentire la respirazione.Fissare la trachea alla pelle toracica del topo facendo da tre a quattro cravatte per strumenti. Legare la trachea con il filo di sutura per fissare il tubo di intubazione. Tagliare il muscolo sternotiroide lungo le fibre muscolari con le forcep sottili.Tagliare la parte isolata con le forbici a molla. Liberare accuratamente la trachea e la laringe dagli avanzi dal muscolo per ridurre al minimo il danno sui vasi sanguigni nel muscolo. Rimuovere trachea e laringe rimanenti.Esofago libero dal tessuto attaccato con le forcelle e tagliarlo con forbici a molla. Rimuovere il muscolo longitudinale che copre il tronco encefalico e l'arco ventrale dell'atlante. Rimuovere il muscolo che copre l'arco ventrale dell'atlante e il tubercolo anteriore.Taglia gli archi ventrali dell'atlante con il rongeur. Rimuovere il tubercolo anteriore dell'atlante. Rimuovere il sangue e il fluido per visualizzare il forame magnum e il tronco encefalico.Espandere il forame magnum rimuovendo l'osso occipitale con il rongeur. Rimuovere la cartilagine e sbucciare con cura lo strato periosteale del dura mater con le forcep fini per avere una visione chiara del tronco encefalico ventrale. Blocca il sensore SpO2 sulla coscia del mouse per monitorare segni vitali come frequenza cardiaca, saturazione dell'ossigeno e frequenza del respiro.Montare l'obiettivo GRIN sull'asta di impianto. Pulire accuratamente l'obiettivo con tessuto detergente imbevuto di etanolo al 70%. Fissare l'asta di impianto su telaio stereotassico e montare il microscopio in miniatura sull'asta di impianto.Aggiungere diverse gocce di soluzione salina nell'area del tronco encefalico per l'immersione dell'obiettivo GRIN. Avvicinati al tronco encefalico con l'obiettivo GRIN. I GCAMP6 che esprimono neuroni d'oliva inferiori nell'area superficiale possono essere trovati in una regione a forma di rettangolo, da circa 0,5 a 1,7 millimetri rostrali al rimanente atlante e circa 2,6 a 1,1 millimetri lateralmente alla linea mediana.Accendi il LED blu eccitazione al microscopio in miniatura per localizzare i neuroni oliva inferiori trasfettato da GCaMP6s. I neuroni mostrano diverse intensità di fluorescenza basale a causa di vari livelli di espressione GCaMP6s. Il cambiamento del livello di calcio dei somata dei neuroni d'oliva inferiori cerchiati nel video a sinistra ci registrerà delta F diviso da tracce F a destra.Sebbene il topo sia tenuto caldo e idratato, sarà inevitabilmente indebolito da anestesia prolungata e chirurgia. È essenziale mantenere breve la durata dell'intervento chirurgico in modo che le condizioni fisiche del mouse siano buone per la registrazione. Un ricercatore esperto può terminare l'intervento chirurgico in 70 minuti.Questo metodo, con modifiche, può essere utilizzato per studiare altre regioni adiacenti del tronco encefalico ventrale.

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