In vivo Imaging del calcio nell'oliva inferiore del topo

Presentiamo un protocollo per esporre il tronco encefalico del topo adulto dal lato ventrale. Utilizzando una lente indice gradient-rifrazione con un microscopio in miniatura, l'imaging di calcio può essere utilizzato per esaminare l'attività dei somata neurali olivari inferiori in vivo.

L'oliva inferiore è la parte più ventrale del midollo, ed è quindi estremamente difficile da raggiungere in un animale vivente. Qui, introduciamo un protocollo per esporre il cervello del topo adulto dal lato ventrale, e usiamo lenti GRIN per registrare l'attività neuronale nei neuroni dell'olivo inferiori che esprimono sensori di calcio. Questo metodo evita danni al tronco encefalico critico per la vita e consente indagini sui modelli di attività spazio-temporale e sull'integrazione dell'input nell'oliva inferiore.

Poiché l'operazione viene eseguita nella regione della gola complessa con molte strutture vitali, è essenziale che sia condotta da un ricercatore con abilità chirurgiche di alto livello. Preparare un tubo di intubazione tagliando una fessura lunga da 5 a 6 millimetri e larga 0,8 millimetri dalla punta di un catetere calibro 20. Preparare un ago smussato e curvo tagliando la punta, levigare la superficie di frattura e piegarla con la pinze.

Questo verrà utilizzato per supportare una trachea durante la tracheotomia. Diluire 15 milligrammi per millilitro ketamina con salina al 15%Assemblare strumenti chirurgici e materiali di consumo. Impostare la pastiglia di riscaldamento a 38 gradi Celsius.

Ruotare il cono nasale di 180 gradi orizzontalmente in cornice stereotassica. Pesare il topo la cui oliva inferiore è stata precedentemente trasfettata da GCaMP6 portatori di virus e calcolare la quantità di ketamina diluita per iniezione. Casella di induzione pre-riempimento con isoflurane al 5% e anestesizzare il mouse.

Montare il mouse nel telaio stereotassico, lato ventrale verso l'alto. Radere la gola del mouse e l'area della coscia. Rimuovere i capelli residui con crema per la depilazione.

Applicare localmente la gelatina di xilocaina sulla pelle della gola. Monitorare la temperatura del mouse con un sensore termico rettale. Iniettare una salina prerifabbrita in un millilitro per via intraperitoneale.

Valutare la profondità dell'anestesia con un forte pizzico sulle dita posteriori. Non deve essere evocata alcuna risposta rilevabile. Fai un'incisione verticale nella pelle della gola lungo la linea mediana.

Separare la pelle del collo dai visceri sotto di essa utilizzando il metodo di dissezione smussata e tagliare la pelle. Liberare le ghiandole salivari dal tessuto connettivo e capovolgerle lateralmente per esporre la trachea ricoperta di muscoli sternotiroidi. Iniettare per via intraperitoneale la prima dose di chetamina diluita a cinque millilitri per chilogrammo di peso animale.

Dividere con cura il muscolo sternotiroide lungo la linea mediana con la punta di una flessoria fine per esporre la trachea. Staccare la trachea dai vasi sanguigni e dall'esofago con le forcelle usando il metodo della dissezione smussata. Iniettare una seconda dose di ketamina diluita a 2,5 millilitri per chilogrammo di peso animale.

Inserire trasversalmente un ago smussato sotto trachea. Sollevare la trachea con l'ago smussato. Fai girare il filo di sutura intorno al terzo anello di trachea, caudale la ghiandola tiroidea, con un ago a mezzo cerchio.

Crea quattro cravatte per strumenti su questo anello. Perforare la pelle del torace con lo stesso ago a mezzo cerchio e condurre il filo attraverso la pelle. Sollevare delicatamente la trachea con il filo e tagliare la trachea caudale alla ghiandola tiroidea.

Tirare la trachea verso la pelle del torace. Sollevare l'apertura della trachea aggiungendo un piccolo pezzo di spugna chirurgica sotto di essa. Rimuovere il liquido rimanente all'interno della punta di apertura della trachea con una sottile striscia di tessuto detergente.

Passare il flusso di isoflurane dal cono nasale stereotassico al tubo di intubazione. Inserire il tubo di intubazione nella trachea. Assicurarsi che parte della fessura nel tubo rimanga al di fuori della trachea per consentire la respirazione.

Fissare la trachea alla pelle toracica del topo facendo da tre a quattro cravatte per strumenti. Legare la trachea con il filo di sutura per fissare il tubo di intubazione. Tagliare il muscolo sternotiroide lungo le fibre muscolari con le forcep sottili.

Tagliare la parte isolata con le forbici a molla. Liberare accuratamente la trachea e la laringe dagli avanzi dal muscolo per ridurre al minimo il danno sui vasi sanguigni nel muscolo. Rimuovere trachea e laringe rimanenti.

Esofago libero dal tessuto attaccato con le forcelle e tagliarlo con forbici a molla. Rimuovere il muscolo longitudinale che copre il tronco encefalico e l'arco ventrale dell'atlante. Rimuovere il muscolo che copre l'arco ventrale dell'atlante e il tubercolo anteriore.

Taglia gli archi ventrali dell'atlante con il rongeur. Rimuovere il tubercolo anteriore dell'atlante. Rimuovere il sangue e il fluido per visualizzare il forame magnum e il tronco encefalico.

Espandere il forame magnum rimuovendo l'osso occipitale con il rongeur. Rimuovere la cartilagine e sbucciare con cura lo strato periosteale del dura mater con le forcep fini per avere una visione chiara del tronco encefalico ventrale. Blocca il sensore SpO2 sulla coscia del mouse per monitorare segni vitali come frequenza cardiaca, saturazione dell'ossigeno e frequenza del respiro.

Montare l'obiettivo GRIN sull'asta di impianto. Pulire accuratamente l'obiettivo con tessuto detergente imbevuto di etanolo al 70%. Fissare l'asta di impianto su telaio stereotassico e montare il microscopio in miniatura sull'asta di impianto.

Aggiungere diverse gocce di soluzione salina nell'area del tronco encefalico per l'immersione dell'obiettivo GRIN. Avvicinati al tronco encefalico con l'obiettivo GRIN. I GCAMP6 che esprimono neuroni d'oliva inferiori nell'area superficiale possono essere trovati in una regione a forma di rettangolo, da circa 0,5 a 1,7 millimetri rostrali al rimanente atlante e circa 2,6 a 1,1 millimetri lateralmente alla linea mediana.

Accendi il LED blu eccitazione al microscopio in miniatura per localizzare i neuroni oliva inferiori trasfettato da GCaMP6s. I neuroni mostrano diverse intensità di fluorescenza basale a causa di vari livelli di espressione GCaMP6s. Il cambiamento del livello di calcio dei somata dei neuroni d'oliva inferiori cerchiati nel video a sinistra ci registrerà delta F diviso da tracce F a destra.

Sebbene il topo sia tenuto caldo e idratato, sarà inevitabilmente indebolito da anestesia prolungata e chirurgia. È essenziale mantenere breve la durata dell'intervento chirurgico in modo che le condizioni fisiche del mouse siano buone per la registrazione. Un ricercatore esperto può terminare l'intervento chirurgico in 70 minuti.

Questo metodo, con modifiche, può essere utilizzato per studiare altre regioni adiacenti del tronco encefalico ventrale.