In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Per comprendere le dinamiche di rete dei microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo. L'imaging del calcio è l'unico metodo che consente di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con risoluzione di una singola cellula.

Il metodo consiste nell'impiantare una finestra di imaging cranico, iniettare un colorante di calcio fluorescente che può essere assorbito da un gran numero di neuroni e infine registrare l'attività dei neuroni con l'imaging del calcio time-lapse. Ciao, sono Payman go dal laboratorio di Carlos Porter Cayo nel Dipartimento di Neurologia presso la David Geffen School of Medicine dell'UCLA. Nei video precedenti, il nostro laboratorio ha dimostrato una procedura per eseguire la craniotomia e l'imaging fotonico del flusso sanguigno nei topi.

Oggi vi mostreremo una procedura per eseguire l'imaging in vivo del calcio fotonico nei topi. Quindi arriviamo ad esso Prima di iniziare. La soluzione di iniezione del colorante deve essere preparata.

Innanzitutto, prepara la soluzione fluorescente dell'indicatore di calcio. Usiamo un colorante a estere etilico o coloranti am in breve. Questi sono coloranti che possono essere assorbiti dalle cellule quando iniettati extracellulare, in genere usiamo il verde organo BAFTA 1:00 AM o l'influenza oh 4:00 AM a una concentrazione di un millimolare.

Per prima cosa prepariamo una soluzione al 20% di onic F1 27. Nel DMSO, riscaldiamo la soluzione prima dell'uso ogni giorno fino a quando non è limpida. Sciogliamo l'indicatore di calcio in 20%onic F1 27 DMSO per 15-20 minuti fino a una concentrazione di 10 millimolari.

Quindi diluiamo la soluzione a un millimolare nella soluzione contenente in millimolare un 50 e ACL 2,5 KCL 10 mucchi, pH 7,4 e vortex per altri 10-20 minuti. Aggiungiamo 100 micromolari di zolfo rumina 1 0 1 per marcare selettivamente gli astrociti e per visualizzare la pipetta durante l'iniezione del colorante, quindi impiantamo una finestra cranica sull'area da visualizzare. L'approccio generale a questo intervento chirurgico è descritto da noi in un articolo video di lavoro pubblicato in precedenza, ma le seguenti modifiche sono importanti per l'iniezione di colorante di calcio.

Una craniotomia più piccola di due millimetri di diametro viene eseguita sull'area corticale di interesse, prestando estrema attenzione a non danneggiare la dura madre sottostante. Un vetrino coprioggetti è fissato in posizione sopra la craniotomia, ma copre solo parzialmente la craniotomia, lasciando un piccolo spazio tra il bordo della craniotomia e il vetrino coprioggetto per lasciare spazio a una pipetta per entrare obliquamente nella corteccia prima dell'iniezione. Un pozzo poco profondo con cemento dentale viene realizzato attorno alla craniotomia.

Il pozzetto per gli esperimenti di imaging del calcio deve estendersi il più possibile nella direzione rostrale ed essere sufficientemente poco profondo da consentire l'introduzione dell'iniezione Micro pipetta, filtriamo la soluzione con un filtro centrifugo da 0,45 micron immediatamente prima dell'iniezione. Il topo viene quindi trasferito sul tavolino del microscopio e la testa immobilizzata come mostrato nel nostro video sull'imaging del flusso sanguigno. Successivamente, tiriamo le pipette con microelettrodi di vetro a un diametro della punta che produce da due a quattro mega ohm di resistenza.

Utilizzando un estrattore per pipette, la miscela di colorante indicatore di calcio viene caricata sulla pipetta di vetro. Utilizzando una micro siringa con un micro manipolatore, la micropipetta viene abbassata delicatamente sulla superficie del cervello utilizzando un obiettivo quattro x e quindi posizionata più finemente. Con un obiettivo 40x, viene scelta una posizione adatta per l'iniezione in modo tale che ci siano pochi o nessun vaso sanguigno sovrastante.

Per oscurare l'imaging utilizzando la microscopia a due fotoni, la punta della micropipetta viene visualizzata e fatta avanzare lentamente nella corteccia fino a una profondità di 200 micrometri sotto la dura. Per eseguire questa operazione nel modo più accurato possibile, la lettura del fuoco Z dell'obiettivo è impostata su zero. Una volta visualizzata la dura madre, viene visualizzata la micropipetta e viene eseguita la lettura del fuoco Z mentre la micropipetta viene abbassata nel cervello a 200 micrometri sotto la dura.

La miscela D viene quindi iniettata a pressione a 10 PSI per un minuto. Utilizzando uno spritz pico, di solito forniamo da due a quattro iniezioni della miscela di colorante di calcio AM separata nello spazio da circa 200 a 300 micron. Questo approccio di caricamento di massa di iniezioni leggermente sovrapposte garantisce che un'area di 600 x 600 micron sia adeguatamente colorata per l'imaging del calcio.

L'imaging inizia un'ora dopo l'iniezione della miscela di colorante am per consentire al colorante di diffondersi e di essere assorbito dai neuroni. In vivo l'imaging a due fotoni viene eseguito con un microscopio a due fotoni su misura utilizzando un laser a zaffiro a tamaleonte sintonizzato da 800 a 880 nanometri e la tecnologia Cambridge. Le immagini degli specchi del galvanometro vengono acquisite utilizzando il software di scansione delle immagini sviluppato da Carl's Vida's.

La potenza del laser da laboratorio è in genere ben al di sotto di 70 milliwatt al campione. Le immagini a campo intero vengono acquisite utilizzando un obiettivo Olympus 20 x 0,95 NA da 1,95 a 15,63 fotogrammi al secondo, cinque da 12 x 2 56 pixel a 2 56 x 64 pixel. Le scansioni lineari vengono acquisite a 500 hertz durante l'imaging.

Gli animali sono tenuti sotto la luce di fluoro, anestesia da 0,6 a 0,9% e sono anche tenuti a 37 gradi Celsius utilizzando un apparecchio di Harvard. Dispositivo di controllo della temperatura, si presta attenzione a mantenere la frequenza respiratoria degli animali il più vicino possibile a 100 respiri al minuto. Questo livello di utilizzo dell'anestesia è il livello più basso che immobilizza l'animale, ma consente comunque di registrare l'attività spontanea.

Quindi ora diamo un'occhiata a un tipico esperimento di imaging del calcio. Ci sono due tre neuroni Di corteccia barile somatosensoriale di un topo postnatale a otto 10. Sono stati colorati con l'organo verde BTA am e ripresi con un obiettivo NA 20 x 0,95.

Le immagini sono state scattate ogni 0,512 secondi. Questo filmato di tre minuti mostra la coattivazione di grandi proporzioni di questi neuroni di colorazione che si verifica una o due volte al minuto. Ti abbiamo appena mostrato come eseguire l'imaging del calcio in vivo dell'attività di rete nel secondo strato tre della corteccia cerebrale.

Il vantaggio di questo metodo rispetto alle registrazioni elettrofisiologiche è che è meno invasivo e consente la registrazione dell'attività in reti neuronali dense. Quando si esegue questa procedura. È importante ricordare di prestare la massima attenzione quando si esegue la craniotomia per non danneggiare la dura.

Anche una piccola quantità di sanguinamento subdurale oscurerà notevolmente l'imaging. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.