Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Il seguente protocollo descrive una generazione di organoidi intestinali e del colon umani da cellule staminali pluripotenti umane. Questa tecnica consentirà all'utente di interrogare i percorsi coinvolti nel patterning intestinale. Questa tecnica consente all'utente di generare organoidi isogeni specifici per la regione. Questo protocollo potrebbe fornire informazioni sui fattori che regolano l'instaurazione e il mantenimento del pattern intestinale.

[Narratore] Iniziare posizionando una matrice extracellulare o una piastra a 24 pozzetti rivestita con ECM all'interno di una cappa di biosicurezza per 30 minuti per consentirle di raggiungere la temperatura ambiente. Posizionare la soluzione completa di distacco di cellule medie mTeSR1 e il DMEM avanzato all'interno di un bagno di perline a 37 gradi Celsius e lasciarli riscaldare per 30 minuti. Preparare il mezzo di placcatura in una provetta conica da 50 millilitri aggiungendo 13 millilitri di mTeSR1 e 13 microlitri di proteina chinasi associata a Y-27632 Rho da 10 millimolari o inibitore ROCK. Per raccogliere le cellule dalla piastra a sei pozzetti, aspirare il terreno da tre a quattro pozzetti e lavare una volta con due millilitri di DMEM avanzato per pozzetto. Aspirare il DMEM avanzato e dosare un millilitro della soluzione di dissociazione cellulare in ciascun pozzetto. Incubare la piastra per cinque-sette minuti all'interno di un'incubatrice al 5% di anidride carbonica, a 37 gradi Celsius. Dissociare eventuali grumi di cellule pipettando su e giù quattro o cinque volte utilizzando una pipetta da cinque millilitri per preparare la sospensione cellulare. Aggiungere due millilitri di DMEM avanzato in ogni pozzetto. Pipettare delicatamente su e giù quattro o cinque volte e trasferire in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 300 g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare il fluido dal tubo senza aspirare il pellet della cella. E aggiungere sei millilitri del terreno preparato di mTeSR1 più l'inibitore ROCK. Risospendere delicatamente le cellule pipettando su e giù tre o quattro volte. Quindi trasferire la sospensione sul resto del mezzo inibitore mTeSR1 e ROCK all'interno del tubo da 50 millilitri. Risospendere vigorosamente quattro o cinque volte e contare le cellule con un emocitometro. Aspirare l'ECM dalla piastra a 24 pozzetti appena prima di placcare le cellule. Risospendere nuovamente le cellule pipettando su e giù due o tre volte ed erogare 0,5 millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Scuotere delicatamente la piastra tre volte in senso orario, tre volte in senso antiorario, tre volte avanti e indietro e tre volte da un lato all'altro per disperdere uniformemente le cellule. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, e incubare per 24 ore. Dopo 24 ore, aspirare il terreno esaurito. Aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto di mTeSR1 e incubare nuovamente per 24 ore nelle stesse condizioni. Preparare il terreno completo di Activin day one diluendo la soluzione madre di Activina A da 100 microgrammi per millilitro e i 100 microgrammi per millilitro di BMP4 in un terreno di Activin day one in una provetta conica. Scaldare il terreno in un bagno di perle a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno mTeSR1 dalla piastra a 24 pozzetti e aggiungere 0,5 millilitri di terreno Activin al giorno uno per pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica e incubare per 24 ore. Controllare le celle dopo 24 ore. Preparare il terreno completo Activin day two diluendo la soluzione madre di Activin A da 100 microgrammi per millilitro in un terreno Activin day two in un tubo conico e posizionare il tubo in un bagno di perline a 37 gradi Celsius. Rimuovere la piastra di differenziazione a 24 pozzetti dall'incubatore ad anidride carbonica e rimuovere il terreno esaurito. Erogare 0,5 millilitri di terreno preriscaldato Activin day two per pozzetto e riposizionare la piastra all'interno dell'incubatore di anidride carbonica per 24 ore. Preparare il terreno completo di Activin 3 giorni diluendo la soluzione madre di Activina A da 100 microgrammi per millilitro in un mezzo di coltura Activin terzo giorno in un tubo conico e posizionare il tubo in un bagno di perline a 37 gradi Celsius. Rimuovere il terreno esaurito ed erogare 0,5 millilitri di Activina al terzo giorno per pozzetto. Per iniziare con la differenziazione dell'endoderma definitivo in sferoidi medio-intestinali, aggiungere 25 millilitri di terreno di induzione medio-intestinale con FGF4 in un tubo conico da 50 millilitri e metterlo in un bagno di perline a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per preparare il mezzo di induzione completo dell'intestino medio-posteriore, aggiungere 7,5 microlitri di CHIR99021 dopo che il terreno è caldo. Rimuovere il terreno esaurito, erogare 0,5 millilitri di terreno di induzione medio-posteriore per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo che la condensazione delle cellule all'interno del monostrato è avvenuta il giorno successivo, sostituire il terreno esaurito con un terreno di induzione fresco dell'intestino medio e riposizionare la piastra per l'incubazione per 24 ore. Per evitare di scartare gli sferoidi galleggianti durante il cambio del terreno, trasferire il vecchio terreno in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 300 g per un minuto. Risospendere gli sferoidi in 12,5 millilitri di terreno di induzione fresco dell'intestino medio-posteriore, aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto nella stessa piastra a 24 pozzetti e incubare per 24 ore nell'incubatore. Il quarto giorno di induzione dell'intestino posteriore, raccogliere gli sferoidi galleggianti dai pozzetti della piastra raccogliendo il terreno in una provetta da 15 millilitri, seguita dalla centrifugazione a 300 g per un minuto. L'efficienza dell'induzione definitiva dell'endoderma è stata valutata eseguendo la colorazione in immunofluorescenza per FOXA2 e SOX17. L'espressione dell'mRNA del fattore HOX anteriore HOXD3 è risultata essere la più alta negli organoidi intestinali umani trattati con Noggin o HIO, inferiore nel fattore di crescita epiteliale o negli HIO trattati con EGF e più bassa negli organoidi del colon umani o HCO trattati con BMP. Al contrario, è stato riscontrato che l'espressione dell'mRNA di HOXA13 e HOXD13 è bassa negli HIO e alta negli HCO. La colorazione in immunofluorescenza è stata eseguita per SATB2, CDX2 e CDH1 per determinare se l'epitelio HCO era correttamente modellato.