Name: Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Scopri come generare, mantenere e caratterizzare organoidi intestinali e colici da cellule staminali pluripotenti umane. Questo protocollo migliora la riproducibilità e la scalabilità per la ricerca gastrointestinale.

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<ol><li>Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+gastrointestinal+tract%3A+twenty+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress.</a> Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).</li>
<li>van Klinken, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC5B+is+the+prominent+mucin+in+human+gallbladder+and+is+also+expressed+in+a+subset+of+colonic+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells.</a> American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).</li>
<li>Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Muc5b+mucin+gene%3A+cDNA+and+genomic+structures%2C+chromosomal+localization+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression.</a> Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).</li>
<li>Lau, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hedgehog+signaling+promotes+development+of+mouse+and+human+enteric+neural+crest+cells%2C+based+on+single-cell+transcriptome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses.</a> Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Munera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+colonic+organoids+via+transient+activation+of+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).</li>
<li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+fibroblasts+have+specialized%2C+diverse+transcriptional+phenotypes%3A+a+comprehensive+gene+expression+analysis+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).</li>
<li>Yahagi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-specific+expression+of+Hox+genes+along+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Congenital+Anomalies%22%5BJournal%5D)">Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract.</a> Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).</li>
<li>Sarvestani, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+organoids+derived+from+patients+with+ulcerative+colitis+recapitulate+colitic+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity.</a> Nature Communications. 12 (1), 262(2021).</li>
<li>Holloway, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+intestinal+organoids+with+endogenous+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells.</a> Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Jaitner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+determines+miRNA+expression+and+long-term+memory+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system.</a> Elife. 5, 17361(2016).</li>
<li>Teo, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+and+BMP4+synergistically+promote+formation+of+definitive+endoderm+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).</li>
<li>Fordham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+expanded+fetal+intestinal+progenitors+contributes+to+colon+regeneration+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).</li>
<li>Tamminen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+commitment+and+maturation+of+human+pluripotent+stem+cells+is+independent+of+exogenous+FGF4+and+R-spondin1%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1.</a> PloS One. 10 (7), 0134551(2015).</li>
<li>Crespo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+colorectal+cancer+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing.</a> Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+Salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Jung, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+induces+the+in+vitro+maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids.</a> Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).</li>
<li>Woo, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+a+Wnt-telomere+feedback+loop+restores+intestinal+stem+cell+function+in+a+human+organotypic+model+of+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+APC+mutagenesis+and+familial+adenomatous+polyposis+using+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells.</a> PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroendocrine+cells+couple+nutrient+sensing+to+nutrient+absorption+by+regulating+ion+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport.</a> Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+structure-function+study+of+neurogenin3+disease-causing+alleles+during+human+pancreas+and+intestinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development.</a> Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).</li>
<li>Kumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineage-specific+transcription+factor+CDX2+navigates+dynamic+chromatin+to+control+distinct+stages+of+intestine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development.</a> Development. 146 (5), (2019).</li>
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<table><tbody><tr><td>Soluzione di albumina sierica bovina (BSA) all'1%</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Provetta Corning da 15 mL</td><td>Falcone</td><td>21008-918</td><td>N/A</td></tr><tr><td>30% Saccarosio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prodotto in PBS.</td></tr><tr><td>5% Siero d'asino normale</td><td>Laboratorio di immunoricerca Jackson</td><td>017-000-121</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Provetta Corning da 50 mL</td><td>Falcone</td><td>21008-951</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Termo Scientifico</td><td>A1110501</td><td>Soluzione per il distacco delle cellule; aliquotare 5 mL di Accutase in provette da 10 mL per un totale di 20 provette e conservare a -20 &deg; C per un massimo di 6 mesi. Posto a 4 gradi C durante la notte prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Sistemi di guida delle celle</td><td>GFH6-100x10</td><td>Ricostituire la polvere liofilizzata a 100&micro; g/mL in PBS sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Aliquot 38 &micro; L di Activina A in provette per microcentrifuga prerefrigerate e conservare a -80 gradi C (Le provette scadono 12 mesi dalla data di ricezione).</td></tr><tr><td>Activin Day 1 medium (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Utilizzare aminoacidi non essenziali (NEAA, Corning 11140050) e conservare a 4 &deg;C. Terreno base giorno 1: 500 ml di RPMI 1640 e 500 ml di NEAA. Quando si prepara il terreno Activin Day 1, aggiungere 13 ml di terreno base Day 1, 13 &micro; l di Activina A (100 &micro; g/mL), e 2 &micro; l di BMP4 (100 &micro; g/mL). Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.</td></tr><tr><td>Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0,2% FBS vol/vol)</td><td>Clone</td><td>SH30070.03T</td><td>Utilizzare aminoacidi non essenziali (Corning 11140050) e conservare a 4 &deg;C. Terreno base del giorno 2: 500 ml di RPMI 1640, 500 ml di NEAA e 1 ml di siero allo 0,2%. Quando si prepara il terreno Activin Day 2, aggiungere 12,5 ml di terreno base Day 2 e 12,5 &micro; L di Activina A (100 &micro; g/mL). Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.</td></tr><tr><td>Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)</td><td>Clone</td><td>SH30070.03T</td><td>Utilizzare aminoacidi non essenziali (Corning 11140050) e conservare a 4 &deg;C. Terreno base del giorno 3: 500 ml di RPMI 1640, 500 ml di NEAA e 10 ml di siero al 2%. Quando si prepara il terreno Activin Day 3, aggiungere 12,5 ml di base Day 3 e 12,5 &micro; L di Activina A (100 &micro; g/mL). Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino anti-Capra</td><td>Termo Scientifico</td><td>Codice A11055</td><td>Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino anti-Coniglio</td><td>Termo Scientifico</td><td>Codice A21206</td><td>Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Asino anti-Topo</td><td>Termo Scientifico</td><td>Codice A10036</td><td>Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Asino anti-Topo</td><td>Termo Scientifico</td><td>Codice: A31571</td><td>Diluizione 1:500 (anticorpo secondario)</td></tr><tr><td>Stampo di base</td><td>Pescatore</td><td>22-363-552</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Terreno intestinale di base (DMEM avanzato)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>&nbsp; Quando si prepara il terreno intestinale di base, aggiungere 500 ml di DMEM, 500 ml di N2 (Gibco 17-502-048), 500 ml di B27 (Gibco), 500 ml di L-glutammina per ottenere 2 mM di L-glutammina (Corning A2916801), 5 ml di 100 U/mL di penicillina-streptomicina (Gibco 15-140-122) e 7,5 ml di L. 1 M HEPES per ottenere 15 mM HEPES. Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.</td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento PCR in tempo reale Biorad CFX96 Touch</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td>È possibile utilizzare altri sistemi qRT-PCR.</td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero delle cellule</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Soluzione di degradazione ECM</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>4000410</td><td>Ricostituire aggiungendo 2,15 mL di DMSO a 10 mM. Preparare 50 &micro; L. aliquote e conservare a -20 °C. Conservare la polvere a 4 gradi C, protetto dalla luce.</td></tr><tr><td>CTRL HIO pattern medium</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Terreno intestinale di base e 100 ng/mL di EGF.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Diluizione 1:100 (anticorpo secondario)</td></tr><tr><td>DE monostrato</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Il monostrato è stato generato nei passaggi precedenti (Sezione 4.4).</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td>Risospendere la polvere liofilizzata in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Filtrare la soluzione per la sterilizzazione aspirando utilizzando un tubo di sterilizzazione con filtro Millipore. Preparare 10 mL di aliquote (1 mg/mL) e conservare a -20 &deg; C per un massimo di 6 mesi. Posto a 4 gradi C durante la notte prima dell'uso.</td></tr><tr><td>FEG</td><td>Termo Scientifico</td><td>236-EG-01M</td><td>Durante la preparazione di 100 ng/mL di EGF ricostituire 500 &micro; g/mL in PBS sterile. Quindi aggiungere 2 ml di PBS sterile a 1 mg di EGF e fare 500 &micro; g/mL di soluzione EGF. Aliquot 100 &micro; L di EGF in 20 provette.</td></tr><tr><td>Fisherbrand Piastre Petri da 6 cm con coperchio trasparente</td><td>Pescatore</td><td>FB0875713A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Sollevatore di celle</td><td>Pescatore</td><td>08-100-240</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Fiale filettate in vetro trasparente Classe B con chiusure attaccate</td><td>Pescatore</td><td>03-338B</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipetta Pasteur monouso in vetro borosilicato</td><td>Pescatore</td><td>13-678-2D0</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fluoromount G Carrello di montaggio medio</td><td>VWR</td><td>100241-874</td><td>N/A</td></tr><tr><td>DMEM avanzato Gibco</td><td>Gibco</td><td>12-491-023</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Capra anti-E-Caderina</td><td>R& Sistemi D</td><td>AF648</td><td>Diluizione 1:400 (anticorpo primario)</td></tr><tr><td>Capra anti-SOX17</td><td>R& Sistemi D</td><td>AF1924</td><td>Diluizione 1:500 (anticorpo primario)</td></tr><tr><td>Mezzo di patterning HCO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Terreno intestinale di base, 100 ng/mL di EGF e 100 ng/mL di BMP2. Durante la preparazione di BMP2, aggiungere 1 mL di HCl 0,1% BSA sterile da 4 mM ai flaconcini di BMP2 (100 &micro; g). Aliquot 25 &micro; L di soluzione BMP4 in 4 provette. Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)</td><td>Struttura per cellule staminali pluripotenti</td><td>N/A</td><td>Cellule seminate in una piastra a 24 pozzetti rivestita Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).</td></tr><tr><td>Soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% (PFA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Il pH deve essere 7,4.</td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica ImmEdge</td><td>Laboratori Vector</td><td>101098-065</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)</td><td>Struttura per cellule staminali pluripotenti (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)</td><td>N/A</td><td>È possibile utilizzare altre linee hESC o iPSC, ma il protocollo deve essere ottimizzato per ciascuna linea cellulare.</td></tr><tr><td>Microtomo Leica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>LSM 880</td><td></td><td></td><td>microscopio confocale</td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Matrigel Matrice qualificata hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Preparare 4 aliquote di Matrigel che corrispondono a volumi sufficienti per produrre abbastanza Matrigel diluito per 4 piastre a 6 pozzetti.</td></tr><tr><td>Mezzo di induzione dell'intestino medio-posteriore (RPMI 1640)</td><td>Corning</td><td>MT10041CV</td><td>Aminoacidi non essenziali (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 &micro; M CHIR99021 e 500 ng/mL FGF4. Il terreno di base è stabile fino a 3 settimane, ma deve essere utilizzato immediatamente dopo l'aggiunta di fattori di crescita.</td></tr><tr><td>Sferoidi medio-posteriori</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili</td><td>MilliporeSigma</td><td>SCGP00525</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Mouse anti-CDX2</td><td>BioGenex</td><td>MU392-UC</td><td>Diluizione 1:300 (anticorpo primario)</td></tr><tr><td>Topo anti-FOXA2</td><td>Abnova/Novus</td><td>H00003170-M01</td><td>Diluizione 1:500</td></tr><tr><td>Terreno di coltura completo mTeSR1</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>85870</td><td>Aggiungere 100 ml di integratore mTeSR (85870) in un terreno mTeSR da 400 ml (85870) e aliquotare in provette da 50 ml evitando la contaminazione. Negozio a 4 gradi C fino all'uso.</td></tr><tr><td>Soluzione Clear di Murray (nota anche come BABB)</td><td>Di Murray</td><td>N/A</td><td>benzoato benzilico 1:2 e alcool benzilico.</td></tr><tr><td>Mezzo di modellizzazione NOG HIO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Terreno intestinale di base, 100 ng/mL di EGF e 100 ng/mL di NOGGIN (Dispense 25 & micro; g di NOGGIN in 250 &micro; l. PBS sterile con 0,1% BSA).</td></tr><tr><td>RNA nucleospinato</td><td>Takara</td><td>740955.25</td><td>Possono essere utilizzati altri kit di isolamento dell'RNA.</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale di superficie Nunclon delta a 24 pozzetti (Nunc)</td><td>Termo Scientifico</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale superficiale Nunclon delta a 24 pozzetti rivestita con Matrigel</td><td>Termo Scientifico</td><td>73521-004</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale di superficie Nunclon delta a 6 pozzetti (Nunc)</td><td>Termo Scientifico</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale superficiale Nunclon delta a 6 pozzetti rivestito con&nbsp; Matrigel.</td><td>Termo Scientifico</td><td>73520-906</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Terreno di crescita per HIO, CTRL HIO e HCO</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Terreno intestinale basico e 100 ng/mL di EGF (concentrazione finale)</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato, 0,5% Triton X (PBS-T)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Primer</td><td>Tecnologie del DNA integrate, Inc. (IDT)</td><td>N/A</td><td>I primer sono elencati nella Tabella 2 del protocollo.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-CDX2</td><td>Marchio Cella</td><td>EPR22764Y</td><td>Diluizione 1:100 (anticorpo primario)</td></tr><tr><td>Coniglio anti-SATB2</td><td>Marchio Cella</td><td>Codice: EP281</td><td>Diluizione 1:100 (anticorpo primario)</td></tr><tr><td>Proteina BMP-4 umana ricombinante</td><td>R& Sistemi D</td><td>314-BP-010</td><td>Ricostituire la polvere liofilizzata a 100&micro; g/mL in 4 mM di HCl sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere 4,17 mL di soluzione di HCl a 45,83 mL di acqua molecolare per un totale di 50 mL di 1 M HCl. Quindi aggiungere 200 &micro; L di 1 M HCl a 49,8 mL di acqua di grado molecolare per un totale di 50 mL di 4 mM HCl. Quindi aggiungere 0,05 g di BSA a 50 mL di HCl da 4 mM e filtrare per renderlo sterile. Aliquotare sterile 4 mM HCl 0,1% BSA in 33 provette per microcentrifuga e conservare a -20 °C. Aggiungere 100 &deg;C; l di 4 mM HCl 0,1% BSA sterili nei flaconcini BMP4 (10 &micro; g) realizzare la soluzione BMP4 a 100 &micro; g/mL.</td></tr><tr><td>Proteina umana ricombinante FGF-4</td><td>R& Sistemi D</td><td>235-F4-01M</td><td>Ricostituire a 100 &micro; g/mL in PBS sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina. Aggiungere 0,05 g di BSA in 50 ml di PBS per ottenere lo 0,1% di BSA. Filtro 0,22 & micro; M BSA per sterilizzare il BSA. Aliquotare 10 mL di BSA allo 0,1% in 5 provette. Aggiungere 1 mg di FGF-4 in 10 mL di BSA sterile allo 0,1%. Aliquot 250 &micro; L in 40 provette per microcentrifuga prerefrigerate e conservare a -80 °C.</td></tr><tr><td>Inibitore ROCK Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>La concentrazione finale è di 10 mM (10 mmol/L). Risospendere in DMSO a 10 mM e sterilizzare con filtro. Aggiungere 3 mL di PBS sterile in ogni flaconcino. Aliqout 100 &micro; L di inibitore ROCK in 30 provette e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Kit di sintesi cDNA SuperScript VILO</td><td>Termo Scientifico</td><td>11-754-250</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio SuperFrost Plus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tessuto Tek O.C.T Compound</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Generation, Maintenance, and Characterization of Human Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal and Colonic Organoids

Il successo della generazione di sferoidi durante la fase di induzione dell'intestino medio/posteriore è indicativo del successo del patterning. Eseguire la colorazione IF per CDX2 su sferoidi flottanti e sul monostrato per confermare che il pattern sia corretto. Sebbene la colorazione allo stadio definitivo dell'endoderma (DE) possa indicare l'efficacia dell'induzione di DE, la generazione di sferoidi non è possibile senza un'efficiente induzione di DE. Per testare l'efficienza dell'induzione DE, eseguire la colorazione...

Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Intestinal regional specification describes a process through which unique morphology and function are imparted to defined areas of the developing ...

Il seguente protocollo descrive una generazione di organoidi intestinali e del colon umani da cellule staminali pluripotenti umane. Questa tecnica consentirà all'utente di interrogare i percorsi coinvolti nel patterning intestinale. Questa tecnica consente all'utente di generare organoidi isogeni specifici per la regione. Questo protocollo potrebbe fornire informazioni sui fattori che regolano l'instaurazione e il mantenimento del pattern intestinale.[Narratore] Iniziare posizionando una matrice extracellulare o una piastra a 24 pozzetti rivestita con ECM all'interno di una cappa di biosicurezza per 30 minuti per consentirle di raggiungere la temperatura ambiente. Posizionare la soluzione completa di distacco di cellule medie mTeSR1 e il DMEM avanzato all'interno di un bagno di perline a 37 gradi Celsius e lasciarli riscaldare per 30 minuti. Preparare il mezzo di placcatura in una provetta conica da 50 millilitri aggiungendo 13 millilitri di mTeSR1 e 13 microlitri di proteina chinasi associata a Y-27632 Rho da 10 millimolari o inibitore ROCK. Per raccogliere le cellule dalla piastra a sei pozzetti, aspirare il terreno da tre a quattro pozzetti e lavare una volta con due millilitri di DMEM avanzato per pozzetto. Aspirare il DMEM avanzato e dosare un millilitro della soluzione di dissociazione cellulare in ciascun pozzetto. Incubare la piastra per cinque-sette minuti all'interno di un'incubatrice al 5% di anidride carbonica, a 37 gradi Celsius. Dissociare eventuali grumi di cellule pipettando su e giù quattro o cinque volte utilizzando una pipetta da cinque millilitri per preparare la sospensione cellulare. Aggiungere due millilitri di DMEM avanzato in ogni pozzetto. Pipettare delicatamente su e giù quattro o cinque volte e trasferire in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 300 g per tre minuti a temperatura ambiente. Aspirare il fluido dal tubo senza aspirare il pellet della cella. E aggiungere sei millilitri del terreno preparato di mTeSR1 più l'inibitore ROCK. Risospendere delicatamente le cellule pipettando su e giù tre o quattro volte. Quindi trasferire la sospensione sul resto del mezzo inibitore mTeSR1 e ROCK all'interno del tubo da 50 millilitri. Risospendere vigorosamente quattro o cinque volte e contare le cellule con un emocitometro. Aspirare l'ECM dalla piastra a 24 pozzetti appena prima di placcare le cellule. Risospendere nuovamente le cellule pipettando su e giù due o tre volte ed erogare 0,5 millilitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto. Scuotere delicatamente la piastra tre volte in senso orario, tre volte in senso antiorario, tre volte avanti e indietro e tre volte da un lato all'altro per disperdere uniformemente le cellule. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, e incubare per 24 ore. Dopo 24 ore, aspirare il terreno esaurito. Aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto di mTeSR1 e incubare nuovamente per 24 ore nelle stesse condizioni. Preparare il terreno completo di Activin day one diluendo la soluzione madre di Activina A da 100 microgrammi per millilitro e i 100 microgrammi per millilitro di BMP4 in un terreno di Activin day one in una provetta conica. Scaldare il terreno in un bagno di perle a 37 gradi Celsius. Aspirare il terreno mTeSR1 dalla piastra a 24 pozzetti e aggiungere 0,5 millilitri di terreno Activin al giorno uno per pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica e incubare per 24 ore. Controllare le celle dopo 24 ore. Preparare il terreno completo Activin day two diluendo la soluzione madre di Activin A da 100 microgrammi per millilitro in un terreno Activin day two in un tubo conico e posizionare il tubo in un bagno di perline a 37 gradi Celsius. Rimuovere la piastra di differenziazione a 24 pozzetti dall'incubatore ad anidride carbonica e rimuovere il terreno esaurito. Erogare 0,5 millilitri di terreno preriscaldato Activin day two per pozzetto e riposizionare la piastra all'interno dell'incubatore di anidride carbonica per 24 ore. Preparare il terreno completo di Activin 3 giorni diluendo la soluzione madre di Activina A da 100 microgrammi per millilitro in un mezzo di coltura Activin terzo giorno in un tubo conico e posizionare il tubo in un bagno di perline a 37 gradi Celsius. Rimuovere il terreno esaurito ed erogare 0,5 millilitri di Activina al terzo giorno per pozzetto. Per iniziare con la differenziazione dell'endoderma definitivo in sferoidi medio-intestinali, aggiungere 25 millilitri di terreno di induzione medio-intestinale con FGF4 in un tubo conico da 50 millilitri e metterlo in un bagno di perline a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Per preparare il mezzo di induzione completo dell'intestino medio-posteriore, aggiungere 7,5 microlitri di CHIR99021 dopo che il terreno è caldo. Rimuovere il terreno esaurito, erogare 0,5 millilitri di terreno di induzione medio-posteriore per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo che la condensazione delle cellule all'interno del monostrato è avvenuta il giorno successivo, sostituire il terreno esaurito con un terreno di induzione fresco dell'intestino medio e riposizionare la piastra per l'incubazione per 24 ore. Per evitare di scartare gli sferoidi galleggianti durante il cambio del terreno, trasferire il vecchio terreno in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 300 g per un minuto. Risospendere gli sferoidi in 12,5 millilitri di terreno di induzione fresco dell'intestino medio-posteriore, aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto nella stessa piastra a 24 pozzetti e incubare per 24 ore nell'incubatore. Il quarto giorno di induzione dell'intestino posteriore, raccogliere gli sferoidi galleggianti dai pozzetti della piastra raccogliendo il terreno in una provetta da 15 millilitri, seguita dalla centrifugazione a 300 g per un minuto. L'efficienza dell'induzione definitiva dell'endoderma è stata valutata eseguendo la colorazione in immunofluorescenza per FOXA2 e SOX17. L'espressione dell'mRNA del fattore HOX anteriore HOXD3 è risultata essere la più alta negli organoidi intestinali umani trattati con Noggin o HIO, inferiore nel fattore di crescita epiteliale o negli HIO trattati con EGF e più bassa negli organoidi del colon umani o HCO trattati con BMP. Al contrario, è stato riscontrato che l'espressione dell'mRNA di HOXA13 e HOXD13 è bassa negli HIO e alta negli HCO. La colorazione in immunofluorescenza è stata eseguita per SATB2, CDX2 e CDH1 per determinare se l'epitelio HCO era correttamente modellato.

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Biologia dello sviluppo

Descriviamo un metodo per stabilire enteroidi umani da cripte intestinali tenue e colonoidi da cripte del colon raccolte sia da tessuto chirurgico che da biopsie. In questo articolo metodologico, presentiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

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Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

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