Intrappolamento ottico di nanoparticelle plasmoniche per la caratterizzazione della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie in situ
23 giugno 2022
Il presente protocollo descrive un approccio conveniente per integrare l'intrappolamento ottico e la spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS) per manipolare nanoparticelle plasmoniche per il rilevamento molecolare sensibile. Senza agenti aggreganti, il laser trappola assembla nanoparticelle plasmoniche per migliorare i segnali SERS degli analiti target per misurazioni spettroscopiche in situ .
Questo protocollo fornisce il controllo spaziale e temporale per l'assemblaggio di nanoparticelle attive SERS in assenza di agenti di aggregazione per ottenere il rilevamento sensibile degli analiti target. Il vantaggio principale del nostro metodo è che non vengono utilizzati agenti di aggregazione per generare l'assemblaggio di nanoparticelle attive SERS, quindi viene utilizzato adatto per analizzare biomolecole sensibili in condizioni fisiologiche. È una piattaforma promettente per rilevare molecole analitiche come il biomarcatore di malattia in soluzioni e in condizioni fisiologiche in un sistema microfluidico.
Quando si utilizza questo metodo per la prima volta, un ricercatore potrebbe aver bisogno di mettere a punto la potenza del laser di trappola, il tempo di irradiazione e la concentrazione di nanoparticelle d'argento per ottenere le migliori prestazioni. Per iniziare, dirigere un raggio laser a 532 nanometri nella porta flessibile del microscopio ottico a pinzetta. Allineare il raggio laser a 532 nanometri nei percorsi stereo a doppio strato del microscopio ottico a pinzetta con uno specchio dicroico a passo lungo di 750 nanometri per combinarli con i raggi laser di intrappolamento originali per concentrarsi sulla camera del campione.
Raccogliere la luce retrodiffusa dalla camera del campione utilizzando uno specchio dicroico a passo lungo di 750 nanometri e reindirizzarla in uno spettrometro contenente una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddato ad azoto liquido. Posizionare un filtro notch da 532 nanometri davanti alla fessura di ingresso dello spettrometro prima dell'acquisizione spettrale. Pulire il vetrino e il vetrino di copertura con acqua ed etanolo.
Fissare il nastro del telaio al vetrino per creare una camera. Aggiungere alcune gocce della soluzione DSNB di nanoparticelle d'argento nel telaio. Metti la copertina sul nastro del telaio e sigillalo.
Aggiungere azoto liquido al contenitore della fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica raffreddato ad azoto liquido fino a quando la temperatura raggiunge meno 120 gradi Celsius. Bloccare il percorso del fascio della sonda Raman utilizzando uno schermo di sicurezza laser magnetico, quindi accendere il laser a sorgente di eccitazione Raman a 532 nanometri. Fissare la camera del campione con la soluzione DSNB di nanoparticelle d'argento sul supporto della camera.
Aggiungere acqua all'obiettivo immerso nell'acqua, quindi posizionare immediatamente il supporto della camera sul microstadio sopra l'obiettivo. Far cadere l'olio ad immersione sulla parte superiore del vetrino del coperchio e posizionare il condensatore immerso in olio per visualizzare le particelle sulla fotocamera del microscopio. Regolare la posizione Z dell'obiettivo ruotando la manopola del microscopio fino a quando il fascio della sonda Raman a 532 nanometri non viene focalizzato sulla superficie inferiore della camera, mostrando una macchia bianca sulla fotocamera del microscopio.
Regolare le posizioni X e Y del microstadio per spostare la camera per posizionare la regione centrale della camera nel punto bianco. Aprire il software di controllo delle pinzette ottiche e utilizzare il controllo joystick dotato per spostare il laser di intrappolamento a 1.064 nanometri in modo che si sovrapponga al punto bianco. Quindi, sintonizzare la manopola del microscopio per spostare la posizione Z dell'obiettivo verso l'alto.
Accendere il laser di intrappolamento da 1.064 nanometri per attirare le nanoparticelle d'argento nella camera del campione e creare un assemblaggio di nanoparticelle d'argento plasmonico. Abbassare il raggio laser di intrappolamento per evitare il surriscaldamento o la formazione di bolle quando necessario. Regolare la posizione del microstadio del campione per posizionare la macchia scura del gruppo di nanoparticelle d'argento plasmonico sotto il fuoco del fascio di sonda Raman a 532 nanometri per misurazioni spettroscopiche.
Posizionare i filtri a densità neutra davanti all'uscita laser Raman a 532 nanometri per regolare la potenza a 10 megawatt. Immettere il tempo di acquisizione nel pannello delle impostazioni nel software dello spettro e fare clic sul pulsante Acquisisci per avviare l'acquisizione spettrale. Senza il laser trapping, le nanoparticelle d'argento disperse nella camera del campione hanno generato uno spettro nero.
Aumentare la potenza e prolungare il tempo di irradiazione del laser di cattura potrebbe attirare più nanoparticelle d'argento e generare una macchia scura. Poiché le nanoparticelle d'argento disperse erano sotto moto browniano, le giunzioni interparticellari erano grandi e instabili. Le intensità complessive di DSNB nell'assemblaggio plasmonico di nanoparticelle d'argento erano superiori a quelle della nanoparticella d'argento dispersa.
Considerando l'intensità del picco caratteristico a 1.444 centimetri inverso, l'assemblaggio di nanoparticelle d'argento plasmoniche può fornire un miglioramento di circa 50 volte del segnale spettroscopico Raman potenziato dalla superficie di DSNB rispetto a quello delle nanoparticelle d'argento disperse. Le intensità dei picchi caratteristici di DSNB a 1, 152, 1, 444 e 1.579 centimetri inversi attraverso questi 20 spettri Raman potenziati dalla superficie sono state tracciate come istogrammi con deviazioni standard relative rispettivamente di 6,88, 6,59 e 5,48%. La cosa più importante in questa procedura è localizzare la posizione del laser a sonda Raman a 532 nanometri e sovrapporlo al laser di intrappolamento a 1.064 nanometri.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per rilevare molecole di analita con controllo spaziale e temporale in condizioni fisiologiche per future analisi in vivo.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per integrare l'optical trapping con la spettroscopia Raman amplificata da superficie (SERS) al fine di manipolare nanoparticelle plasmoniche per la rilevazione molecolare sensibile. L'approccio consente misurazioni spettroscopiche in situ senza l'uso di agenti aggreganti, potenziando i segnali SERS degli analiti bersaglio.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biophysica
- Chimica analitica
Sfondo
- Il trappolamento ottico e la SERS sono tecniche potenti per la rilevazione molecolare.
- I metodi tradizionali spesso richiedono agenti aggreganti, che possono interferire con l'analisi di biomolecole sensibili.
- Questo studio presenta un approccio innovativo che elimina la necessità di tali agenti.
- Il metodo è adatto a condizioni fisiologiche, rendendolo applicabile per la rilevazione di biomarcatori.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'assemblaggio di nanoparticelle attive nella SERS senza l'uso di agenti aggreganti.
- Potenziare la sensibilità nella rilevazione molecolare in ambienti fisiologici.
- Fornire una piattaforma per l'analisi futura in vivo di biomolecole.
Metodi Utilizzati
- Integrazione del trappolamento ottico con la spettroscopia SERS per la manipolazione di nanoparticelle.
- Utilizzo di un laser a 532 nanometri per l'eccitazione e di un laser di trappolamento a 1.064 nanometri.
- Regolazione della potenza laser e del tempo di irradiazione per un assemblaggio ottimale delle nanoparticelle.
- Acquisizione spettrale mediante una telecamera CCD raffreddata a azoto liquido.
Risultati principali
- L'assemblaggio di nanoparticelle plasmoniche d'argento ha mostrato un aumento del segnale SERS di 50 volte rispetto alle nanoparticelle disperse.
- I picchi caratteristici degli analiti sono stati rilevati in modo costante con alta intensità.
- Le deviazioni standard relative dei picchi erano basse, indicando misurazioni affidabili.
- Il metodo consente un controllo preciso sugli aspetti spaziali e temporali dell'assemblaggio delle nanoparticelle.
Conclusioni
- Questa tecnica rappresenta un notevole progresso nella rilevazione di biomolecole in condizioni fisiologiche.
- L'assenza di agenti aggreganti migliora l'affidabilità dei risultati.
- Applicazioni future potrebbero includere l'analisi in vivo di biomarcatori di malattie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Management
Le piattaforme integrate di cattura ottica e SERS rispondono a un'esigenza fondamentale di rilevamento molecolare riproducibile e ultrasensibile in ambienti fisiologicamente rilevanti, senza l'uso di agenti chimici di aggregazione. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nella scoperta di biomarcatori in stadi precoci e supporta flussi analitici robusti per l'analisi di sistemi rilevanti per le malattie. Il controllo spaziale e temporale del metodo sull'assemblaggio delle nanoparticelle consente analisi affidabili e a bassa perturbazione, essenziali per i percorsi di ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'interrogazione diretta di bersagli biomolecolari in soluzione in condizioni fisiologiche.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica eliminando l'interferenza degli agenti aggreganti nella rilevazione molecolare.
- Consente una validazione funzionale del bersaglio mediante un potenziamento riproducibile e quantitativo del segnale SERS.
- Facilita la previsione affidabile nell'identificazione precoce e nel triage dei biomarcatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma standardizzata e priva di aggregazioni per la preparazione di assemblaggi attivi alla SERS in sistemi microfluidici o acquosi.
- Garantisce un'elevata riproducibilità e risultati quantitativi con bassa deviazione standard relativa tra le misurazioni.
- Permette lo sviluppo scalabile di saggi per il screening di composti o biomarcatori sensibili.
- Consente una valutazione affidabile di molecole analita a concentrazioni sub-nanomolari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea all'analisi del sistema rilevante per la malattia consentendo la rilevazione in situ in ambienti fisiologici.
- Mantiene la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica riducendo al minimo le perturbazioni del campione.
- Riduce i rischi nelle decisioni di avanzamento fornendo dati robusti e riproducibili di caratterizzazione molecolare.
- Supporta futuri flussi di lavoro per l'analisi di biomarcatori in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo di trappolaggio ottico-SERS si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, supportando la verifica delle ipotesi, la validazione degli obiettivi e i flussi di lavoro per i biomarcatori traslazionali.
- Biologia della scoperta: Facilita il rilevamento basato su ipotesi di analiti e la chiarificazione dei percorsi in ambienti simili a quelli naturali.
- Screening: Fornisce output SERS quantitativi e riproducibili per la prontezza del saggio e la valutazione dei composti.
- Analisi: Offre misurazioni spettrali robuste e output statistici per il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento dei biomarcatori e la continuità nei modelli preclinici con minima perturbazione.
- Riutilizzo aziendale: Offre una capacità analitica riutilizzabile e priva di aggregazione per esigenze diversificate di rilevamento molecolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e la validazione degli obiettivi consentendo un rilevamento sensibile e riproducibile, senza artefatti di aggregazione.
- Valore operativo: Standardizza la formazione e la misurazione dell'assemblaggio attivo per SERS, per flussi di lavoro scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale riducendo i rischi analitici in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione e la progressione di programmi per biomarcatori e target, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso delle trappole ottiche, nella strumentazione SERS e nell'analisi spettrale.
- Necessita dell'accesso a microscopi con pinzette ottiche a doppio laser e a spettrometri CCD raffreddati con azoto liquido.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per l'allineamento del laser, la potenza e i parametri di acquisizione.
- Adattabile a diversi sistemi di nanoparticelle rivestite con analiti e a piattaforme microfluidiche.
- Le prestazioni possono dipendere da un preciso allineamento spaziale e dal controllo ambientale, come indicato dal protocollo.
